1、1引言石油工業是我國現代能源及國民經濟的重要組成部分。石油是重要的能源，是現 代工業的“血液”，因此冇人把20世紀稱作為石油的世紀。但石油在開采、運輸、煉 制和使用過程中因意外事故或管理不當，會造成石油泄漏進入農田、河流、海洋等系 統，使環境遭受石油污染，直接危害人類的生產和生活。據統計，世界上每年約 有800萬噸油類物質通過各種途徑進入水體。石油進入水體后，造成水體污染，改變 局部水生態環境，使水生生物死亡，給水資源、生物資源和養殖業、旅游業帶來巨大 損失。例如當海水屮含油量為0.01mg/l時，魚在24h內就會產生油臭味廢水 中的油類呈油膜狀覆蓋水面，阻止空氣中的氧溶解于水，污染嚴重的區域

2、，造成水中 的浮游生物因供氧不足而死亡，其生態系統的恢復需要十年以上的時間。石油坯污染的環境治理是口前全球普遍關注的焦點之一，國內外很多科學工作者 對石油繪污染物的治理工作進行了廣泛深入的研究。生物修復是治理石油坯污染最為 冇效的方法z，該技術具冇經濟冇效、無二次污染等優點。因此，石油姪的生物降 解研究工作具有重要的現實意義。1.1石油的基本性質石油是從地下深處開采出來的黃色乃至黑色的可燃粘稠液體。石油是古代海洋或 湖泊中的生物經過漫長的演化形成的一種復雜的多組分均質混合物，其主要組成是姪 類（烷姪、環烷姪和芳香姪）和非姪組份（含氧化合物、含硫化合物、含氮化合物、 膠質和瀝青質）。石油按其產地

3、不同，性質也有所差異。1石油的元素組成右油元素組成變化范圍不大。在大部分右油屮，碳含量為83 %87 %,氫含量為 11%14%,硫、氮、氧等元素一般在1%4%。除上述5種元素外，石油中還含有饑（v）、 傑（ni）、銅（cu）、鐵（fe）、鉛（pb）、鈣（ca）、鈦（ti）、鎂（mg）、鈉（na）, 鉆（co）、鋅（zn）等金屬元素和氯（c1）、硅（si）、磷（p）、神（as）等非金屬 元素，它們的含量都很少。石油不同程度的氣味主要來源于少量的硫化物。石油中膠 質物質屈于含氧化物（脂肪酸類），它們含量少，但對右油加工過程影響很大。1.1.2石油怪的組成烷姪是組成石油的主要成分，隨相對分子量的增

4、加，烷炷分別以氣、液、固三種 狀態存在于石油屮。在常溫下，從甲烷到丁烷是氣態，是天然氣和油制氣的主要成分。 常溫下c5c|5的烷姪為液態。其中，含有512個碳原子的烷姪為汽油，其沸點在100 °c180°c；而922個碳原子的烷怪為煤油、柴油和機油；c"以上的烷坯為固體，一 般多以溶解態存于石油中，當溫度降低時，就有結晶體析出。石油中正構烷坯中碳數 一般達到40,除主要含直鏈烷炷外，還含冇支鏈（異構）烷坯。支鏈烷坯屮最重要的 是異戊二烯類化合物，它以姥鮫烷和植烷為代表。支鏈烷姪無毒，可被多數微生物生 物降解，但分支越多越難于生物降解4嘰石油屮環烷坯一般含56個碳原

5、子，環狀排列，占石油含量的30%60%,除環戊 烷和環己烷外，還有二環和多環烷坯。很重要的少量組分為循烷、粘烷類。環烷坯含 量高時，油品黏度大。環烷姪是潤滑油的主要成分，微生物很難降解環烷桂皿。芳香姪占石油含量的2 %4%回，有單環芳姪（如苯、甲苯、二甲苯），還含有雙環 芳姪（主要是蔡）、三環芳姪（如恿和菲）和三環以上的多環芳姪（如苯并憩多核芳姪）。 芳香坯對生物的毒性最大，特別是多環芳坯，難以生物降解。1.2石油污染的現狀1.2.1石油炷類對水體的污染近20年來，我國油ii開發、海運等事業有了很大的發展，但同吋溢油事故也連 續不斷發生，石油污染水體的面積不斷擴大。進入海洋環境的石油污染物質大

6、部分 滯留在海洋底棲環境屮，因而極大地影響著海洋底棲生物的正常生長。海洋環境屮大 量石油污染物的存在，使海洋水質卜降，嚴重破壞了海洋生態環境。工業的迅猛發展對作為主要能源的石油需求量急劇增加。石油在開采、運輸吋產 出大量石油污水，我國油皿每年產出的石油含油污水達6億n?。油口石油污水的排放 對內陸和沿海水系的污染日趨嚴重，給口然資源及人類健丿隸造成嚴重危害卩2】。隨著全球經濟的不斷發展，海上油川和海邊儲油庫、海上油品運輸及裝卸碼頭、 船舶修理廠等相關業務將會更加繁忙。為了保護白然生態環境、人類健康和經濟持續 發展，社會各界科學工作者對石油污水的治理極為關注。利用微生物降解消除水體石 油污染被認

7、為是最理想的方法，因為它不像化學劑會給水體造成二次污染。1.2.2石油炷類對土壤的污染在油山開發區，鉆井、洗井、釆油和修井的作業屮，會冇落地石油和固體廢棄物 排放到環境中，使大面積土壤受到污染：而隨著現代社會汽車數量的增加，大大小小 的加油站己遍布各地，輸油管道的滲漏和破裂，地下油罐滲漏也使人量土壤受到污染, 這些已經成為土壤污染的主要原因，對生態環境和人類健康帶來極大的危害。曲于石油特姝的物理化學性質，在它進入土壤后難以去除殘留時間長，使土壤中 的碳源大量增加，直接導致土壤'pc： n比失調以及酸堿度的變化，破壞了土壤結構, 給受污染土壤帶來一系列的危害，對污染地區的生態、作物以及人

8、類健康造成負面影 響。土壤是一個復朵的生態系統，土壤中存在著相當復雜的土壤-植物-微生物的相互 關系。土壤理化因子的改變，必然導致以土壤為生長介質的植物的改變，尤其對植物 根系功能的發揮影響較大，坯類物質進入土壤后將給受污土壤帶來一系列的危害，主 要表現在：與土壤土粒粘連，破壞土壤主態系統的結構和功能，影響土壤的透氣性和 滲水性，導致土壤板結；附著在植物根系表而形成粘膜，阻礙根系的呼吸和營養吸收, 導致植物根系腐爛，影響作物根系生長；石油姪類中所含的多環芳姪經作物吸收，在 作物體內和果實內的礦物油殘留很高，并能通過食物鏈在動植物體內逐漸富集。面 對自然環境的選擇，植物或者適應環境因子的變化，或

9、者被淘汰。在食物鏈屮，直接 與植物相關的微牛物也隨之受到影響。1.2.3石油炷類對大氣的污染空氣顆粒物中姪類物質的最主要來源有：有機化合物通過高溫反應、石油等產物 的低溫蒸發和地質塵?！?。多環芳坯(pahs)是指兩個以上苯環以稠環形式相連的化 合物，是一類在大氣環境屮分布最廣泛、危害性最大的有機污染物之一。pahs對生 物及人類的毒害主要是參與機體的代謝作用，具有“致癌、致畸和致基因突變”的“三 致”特征。對于油田開發所處的工業城市，氣相姪類有機物更是這些特殊工業城市的主要大 氣污染物。其一次污染物是烯姪、烷、醇、碳基化合物等，二次污染物主要是臭氧、 氫氧基、過氧氫基等自由基及醛、酮和過氧乙酰

10、硝酸酯(pan) o它們不僅惡化環境、 直接危害人體健康，而且是光化學煙霧的主要原因。石油中的氣態坯易揮發污染大 氣，溶解態和自由態是植物的直接殺手。1.3石油污染治理的方法石油污染的治理方法主要有物理方法、化學方法和生物方法。即利用物理、化學 和生物方法去除環境屮的石油污染物。1.3.1石油污染治理的物理化學方法1.3.1.1水處理中含油廢水處理的物理化學方法利用物理化學法處理石油污染物可以得到較好的處理效果，但因造價高、二次污 染等問題使其應用受到了限制。油廢水處理的物理法主要有： 氣浮法：氣浮技術是國內外含油廢水處理中廣泛使用的一種水處理技術，其原 理就是在水中通入空氣或其它氣體以產生細

11、小氣泡，使水屮的一些細小懸浮油珠及同 體顆粒附著在氣泡上，隨氣泡一起上浮到水面形成浮渣，從而完成固-液分離的一種 凈水法。氣浮技術用于除油在我國冇近一、二十年的歷史，對引進的設備和技術還沒 完全消化和吸收罔；現有設備自動化程度不高，操作管理跟不上，影響處理效果；氣 浮除油機理的研究也存在很大不足，這些都影響到氣浮技術在廢水除油中的應用。 膜分離法：膜分離法是s.sourirajan18開拓的，并在近20多年迅速發展起來的分 離技術。膜法處理含乳化油廢水，一般可不經過破乳，直接實現油水分離。膜分離除 油的關鍵在于膜的選擇，膜分離理論認為膜分離是處理料組分選擇性透過膜的物理- 化學過程，過程的推動

12、力主要是膜兩側的壓差?？谇坝糜谟退蛛x的膜通常是反滲透 膜、超濾膜和微濾膜，它們的作用是截留乳化油和溶解油。膜分離法處理含油污水方 法簡單，分離效率高，耗能低，特別適合于高濃度乳化油廢水的處理。但在膜處理前, 需對廢水進行嚴格的預處理，且膜的清洗也比較麻煩。 吸附法：吸附法是利用吸附劑的吸附性能除去水中的油。最常見的吸附劑是活 性炭，它不僅對油有很好的吸附作用，且能同吋有效地吸附廢水屮的其他有機吻，對 油的吸附容量一般為3080 mg/g,但是吸附劑（活性炭）的成本高，再生困難，故一 般只用于含油廢水的深度處理。含油廢水處理的化學法主要有： 化學絮凝法：絮凝是處理含油廢水中常見的方法，是在水中

13、投加絮凝劑，使之 與水體屮的油形成絮體以達到除油的效果，并常與氣浮法聯合使用。常用的無機絮凝 劑是鋁鹽和鐵鹽。近年來出現的無機高分子凝聚劑（如聚硫酸鐵、聚氯化鋁等）具有用 量少，效率高的特點，但使用的最佳ph也較寬。雖然無機絮凝劑的處理速度較快，但 投藥量大，污泥生成量多。最近發展了有機高分了絮凝劑，油去除率高，但由于其約 劑成本較無機絮凝劑高，目前冇機高分子絮凝劑在含油廢水處理方面主要是作其它方 法的輔助劑罔。 電化學法：電化學法是用金屬鋁或鐵作陽極處理含油廢水，常用于廢水的二級 處理。電化學法（主要是絮凝）具冇處理效果好，占地而積小，操作簡單，浮渣相對較 少的優點，但是客觀存在陽極金屈消耗

14、量大，需大量鹽類作輔助藥劑，耗電量高，運 行費用較高等缺點。1.3.1.2含油土壤的物理化學處理方法含油土壤的物理、化學處理方法主要有：熱處理法和化學浸出法。熱處理法通過 焚燒或鍛燒破壞大部分污染物，但因造價過高而難以實施。化學浸出和土洗也稱為洗 滌法，洗滌法可以獲得較好的除油效果，但所采用的化學溶劑的二次污染的問題限制 了它的應用。1.3.2石油污染治理的生物方法生物處理方法是近年來發展起來的，在許多國家得到了應用，根據目前已有的研 究結果和應用實踐表明生物法具有處理效杲好、費用低、環境影響小、無二次污染及 應用范圍廣等優點，是迄今為止處理石油污染比較好的一種方法。1.3.2.1降解石油的微

15、生物口前，有關石油及其產品的微生物降解方面的研究常見報道，許多微生物能以坯 類為唯一碳源和能源牛長口在口然界分布廣泛，己經分離篩選出能夠降解原油的菌約 冇30屈100多種。能利用姪類微生物主要冇pseudomonas （假單細胞屈）、achromobacter （無色桿菌屈）、arthrobacter （節桿菌屈）、alcaligenes （產堿桿菌）、micrococcus （微球菌屬）、nocardia （諾卡氏菌屬）、vibrio （弧菌屬）、acinetobacter （不動細菌 屬）、brevibactrium （短頸細菌屬）、corynebacterium （棒狀桿菌屬）、flav

16、obactemun 黃菌屬）、candida （假絲酵母）、rhodotorula （紅酵母）、sporobolomyces （擲抱酵母屬）、 corynebacterium （棒桿菌屬）、spirillum （螺菌屬）、aspergillus（曲霉屬）等,在細菌、藻 類、酵母和真菌等分類群中都發現了能降解石油姪類的種屈0,22。1.4本課題研究的意義及內容目前，冇關右油及其產品的微生物降解方而的研究常見報道，許多能以坯類為唯 一碳源和能源生長的微生物在門然界分布較廣泛，已經分離篩選出能夠降解原油的菌 約冇30屬100多種。作為石油非常重要的一個憾分，機油的微生物降解卻鮮有報道。 機油作為制造

17、、機械維修等行業屮的潤滑油，在工業生產及機械維修屮被廣泛應用， 隨之產生了大量含機油廢水，嚴重污染了環境，但對如何處理這類廢水的相關研究卻 很少。本課題研究的內容：（1）機油降解菌的分離、篩選從機油污染的土壤屮分離篩選對機油具有降解能力的菌株。(2) 菌株的生物學特性研究從形態結構、生理生化特征等方面對菌株進行初步鑒定。(3) 菌株降解特性的初步研究研究不同接種量及不同原始機油濃度對菌株降油能力的影響。2實驗材料與方法2.1實驗材料與設備2.1.1實驗材料2.1.1.1菌株的來源汽車維修廠的油污土壤(污染時間約為5年)。2.1.1.2 機油污染土壤周圍油桶內取得的機油o2.1.1.3主要化學試

18、劑蛋白腺杭州微生物試劑冇限公司牛肉浸膏天津市德晟生物技術有限公司瓊脂條?；噭゜r上海分析化工科技有限公司磷酸氫二鉀分析純ar廣東汕頭市西隴化工廠氯化鈉分析純ar上海實意化學試劑有限公司氫氧化鈉分析純ar上海久億化學試劑有限公司無水硫酸鈉分析純ar無錫市亞盛化工有限公司磷酸二氫鉀分析純ar無錫市亞盛化工有限公司硫酸亞鐵七水分析純ar國藥集團化學試劑冇限公司硫酸猛化學純c上海化學試劑總廠硫酸鎂分析純江蘇省連云港市化學試劑廠無水氯化鈣分析純ar無錫市亞盛化工有限公司硫酸銅分析純上海試劑一廠明膠化學純上海光華化學試劑廠硝酸鞍分析純ar無錫市亞盛化工有限公司石油儲(3060°c)分析純ar無

19、錫市亞盛化工冇限公司2.1.2主要實驗儀器全自動不銹鋼雙層立式yx400z上海三申醫療器械有限公司電熱蒸氣壓力消毒器電熱恒溫鼓風干燥箱dgg-9420a上海森信實驗儀器有限公司電熱恒溫培養箱dnp-9052上海精宏實驗設備有限公司振蕩培養箱lrh-250-z廣東省醫療器械廠恒溫培養搖床qyc211上海福瑪實驗設備有限公司牛物凈化工作臺bcm-1000蘇州凈化設備有限公司不銹鋼恒溫電熱板tp-2金壇市榮華儀器制造有限公司生物顯微鏡ys100nikon紫外可見分光光度計725n上海精密科學儀器冇限公司2.2實驗內容與方法2.2.1機油降解菌株的馴化、分離和篩選2.2.1.1馴化、分離、降解培養基及

20、培養條件馴化、分離、降解培養基叫 機油 10ml> nh4no3 3g> kh2po40.5g> k2hpo40.5g> 微量元素液2ml、ph 7.0、蒸徭水1000ml。微量元素液組成：mgs042g. cuso40.5g mnso40.5g> feso4 7h2o 0.5g> cacl2 0.5g、蒸懈水 500mlo固體營養培養基：牛肉膏3g、蛋白月東10g、nacl 5g>蒸憾水1000ml、ph 7.2 7.4、瓊脂 20g。液體營養培養基：牛肉膏3g、蛋口豚10g、nacl 5g、蒸徭水1000ml、ph7.27.4o機油降解培養條件s：

21、250ml三角錐瓶每瓶裝50ml機油降解培養基，滴加0.5ml 機油。30°c搖床振蕩培養,轉速160r/mino2.2.1.2機油降解菌的馴化汽車維修廠邊采集到的油污土壤樣品加入50ml機油篩選培養基中，在溫度30 °c、轉速160 r/min搖床培養3d。待培養液乳濁后，吸取2ml培養液轉接入新鮮液體 培養基中，連續5次馴化培養。2.2.1.3機油降解菌的分離與篩選然后采用稀釋平板法進行分離，將富集培養液梯度稀釋后，取0.2ml稀釋液涂布 于固體營養培養基上，培養2d。待平板長出菌落后選擇不同顏色及形態的單菌落，重 新轉接到機油篩選培養基屮，搖床培養34d。培養液混濁后

22、，再用固體營養培養基 分離單菌落。取一點菌苔或一環細菌懸液，在平板一側邊緣處，反復涂抹在直徑約為 lcm大小的而積上；燒灼接種環，冷卻后，從上述涂菌處劃岀多條直線。將上述燒灼、 劃線操作再重復數次，倒置平板，于30°c培養12天，出現單菌落。將純化菌株接 種試管斜面培養后保存于冰箱。2.2.2機油降解菌株的初步鑒定參照伯杰氏細菌鑒定手冊第八版及相關資料文獻審】，對篩選出的機油降解菌 株進行形態觀察和生理生化兩方而的初步鑒定。2.2.2.1菌株的形態觀察將分離到的機油降解菌接種到固體營養培養基平板上，觀察菌落的菌苔形態和顏 色變化。挑取菌株細胞均勻涂布于載玻片上，染色后用10x100倍

23、油鏡觀察，觀察菌 體的形狀及大小。菌落形態觀察：形狀和大小、邊緣、表而、隆起形狀，透明度、菌落及培養基的 顏色等。2.2.2.2生理生化特征試驗(1) 革蘭氏染色試驗試劑：草酸鍍結晶紫染液a 液：結晶紫(crystal violet) 2g, 95%乙醇 20mlb 液：草酸鞍(ammonium oxalate) 0.8g,蒸憾水 80ml混合a、b二液，靜置48h后過濾使用。此染液較穩定，在密閉的棕色瓶 屮可儲存數月。 盧戈氏(lugol)(i典液碘片lg,碘化鉀2g,蒸傭水300ml,先將碘化鉀溶解在少量水屮，再將 碘片溶解在碘化鉀溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。 95%的乙醇溶液 番紅

24、復染液番紅(safranine 0)2.5g, 95%乙醇100ml,取上述配好的番紅乙醇溶液loinl 與80ml蒸水混勻即成。實驗步聚：用接種針挑取少許菌苔，涂布在干凈玻片上的一滴無菌水或蒸鎘水 中，風干固定。 用結晶紫的混合液染lniin后，用水洗。 碘液作用lmin,水洗，吸干。 用95%乙醇溶液脫色，流滴至洗脫液至無色(約30s)。 用番紅液染23 min,水洗、風干。鏡檢觀察細菌個體形態大小及芽砲有無和著生位置。紅色為革蘭氏陰性，紫色為 革蘭氏陽性。(2) 芽抱染色試驗試劑：5 %孔雀綠水溶液，0.5%番紅水溶液。操作步驟：采用改用的schaeffer-fulton氏染色法，加12

25、滴水于小試管中，用 接種環挑取23環菌苔于試管中，攪拌均勻，制成濃的菌懸液。加孔雀綠染液2-3 滴于小試管屮，并使其與菌液混合均勻，然后將試管置于沸水浴的燒杯屮，加熱染色 1520 mine用接種環挑取試管底部菌液數環于潔凈載玻片上，涂成薄膜，然后將涂 片通過火焰3次溫熱固定。水洗，直至流出的水無綠色為止。用番紅染液染色23 min, 傾去染液并用濾紙吸干殘液。干燥后用油鏡觀察。(3) 運動性采用半固體瓊脂穿刺法：根據有鞭毛的細菌可以在半固體培養基屮游動卻又不能 任意游走的現象，觀察細菌生長情況，判定試驗菌是否有運動性。操作步驟：可使用試驗菌能良好生長的培養基，在其中加入0.30.6 %的瓊脂

26、， 用直針穿刺接種試驗菌于半固體培養基內，適溫培養。細菌的運動性可用透射目測。如生長物只生長在穿刺線上，邊緣十分清晰，則表 示試驗菌無運動性；如生長物由穿刺向四周呈云霧狀擴散，其邊緣呈云霧狀，則表示 試驗菌株有運動性。對生長快的細菌應培養id后觀察。如試驗菌是好氧細菌，穿刺 線上生長物很少，可檢查從培養基表而向下滲入的生長物的情況。(4) 過氧化氫酶的產生試驗培養基：細菌采用固體營養培養基試劑：3%10% h2o2操作步驟：接菌種于斜面培養基上，30°c培養24h的斜面菌種，以鉗絲接種環取 一小環抹于已滴冇 出02的玻片上，若冇氣泡產生為陽性，表明冇過氧化氫酶生成， 無氣泡則為陰性。

27、(5) 淀粉水解試驗淀粉培養基:蛋白月東10g, nacl 5g,牛肉膏5g,可溶性淀粉2g,蒸餡水loooml, 瓊脂 1520g, 12tc滅菌 20min<>操作步驟：平板培養基點種，32°c培養25d,待形成明顯的菌落后，在平板上 滴加盧戈氏碘液。平板背景呈藍黑色。菌落四周若不變色，表明淀粉水解陰性，若變 成透明無色則為陽性，說明產生淀粉酶水解淀粉。(6) 明膠液化試驗明膠液化培養基:蛋白腺5g,明膠100150g,蒸憾水loooml, ph7.27.4, 115 °c 滅菌 30min。操作步驟：取明膠培養試管，取培養1824h的斜面培養基作穿刺接種，

28、另有兩 支不接種作空白對照。于20°c培養箱中培養。培養2、7、10、14和30d的試管，在 20°c以下觀察菌的生長情況和明膠是否融化。如菌已生長，明膠表面無凹陷，且為穩 定的凝塊，則為明膠水解陰性。如明膠凝塊部分或全部在20°c以下變為可流通的液體, 則明膠水解陽性。表明有蛋白水解酶生成。(7) 甲基紅試驗(m-r)m-r試驗培養基:蛋白腺5g,葡萄糖5g, k2hpo45g,蒸憾水loooml, ph7.07.2, 115°c滅菌 30mino試劑：甲基紅o.lg, 95%乙醇300ml,蒸憾水300mlo操作步驟:接種試驗菌于培養基中置32

29、76;c培養2、4、6d后觀察，加入一滴甲基紅 試劑，紅色(ph4.4)為m-r陽性(說明細菌發酵葡萄糖產酸)，黃色(ph6.0)為 m-r陰性(說明細菌不能利用葡萄糖產酸或細菌不能進一步利用新產生的酸轉化為中 性化合物)。若測試的是芽孑包桿菌的細胞吋，則以5g nacl代k2hpo4因其有緩沖作用。(8) 乙酰甲基甲醇試驗(v-p試驗)v-p試驗培養基：蛋白月東5g,葡萄糖5g, k2hpo4 5g, ph7.07.2, 115°c滅菌 30mino試劑：肌酸 0.3%, naoh 40%o操作步驟：接菌種于培養基上，32°c培養24h。培養24h后取出，加入等量的40%

30、 的naoh相混，加少許肌酸(約0.5l.omg)。然后猛烈振蕩，2-10min內若培養液 出現紅色即為v-p試驗陽性。(9) 卩引味試驗蛋白豚水培養基:1%蛋白腺水溶液（蛋白月東10g, nacl 5g,蒸餡水loooml）, ph 7.07.6, 115°c滅菌加 30mino試劑：對二甲基氨基苯甲醛8g, 95%乙醇760ml,濃hc1160ml操作步驟:取蛋白豚水培養基試管分別接種，在32°c下培養2d或更長時間。取出 培養試管后，緩緩滴加眄i味試劑5滴，在液層界面發生紅色，即為陽性反應，黃色即 為陰性反應。若顏色不明顯，可加45滴乙醯，搖動，使乙瞇分散于液體中，酬

31、味 可被萃取到乙瞇層屮，濃縮眄i味和試劑，反應顏色就明顯。（10）硝酸鹽還原硝酸鹽液體培養基：蛋白月東10g,氯化鈉5g,牛肉膏3g,蒸纟留水1000 ml, kno3 lg, ph 7.07.6,每管分裝 45ml, 121°c滅菌 20mino試劑：格里斯氏（griess）試劑：a液:對氨基苯磺酸0.5 g,稀醋酸（10 %左右）150mlb液：曠蔡胺o.lg,蒸憾水20ml,稀醋酸（10%左右）150ml二苯胺試劑：二苯胺0.5g,濃硫酸looml,蒸諸水20ml操作步聚：將菌接種于硝酸鹽液體培養基中，置30°c培養1、3、5d,每株菌作 二個重復，另外留二管不接種作

32、對照。取二支干凈的空試管倒入少許培養1、3、5d 的培養液，再滴一滴a液及b液。在對照管屮同樣加入a、b液各一滴。當培養液屮 滴入a、b液后，溶液如變為粉紅色、玫瑰紅色、橙色、棕色等表示有亞硝酸鹽存在, 為硝酸鹽述原陽性。如無紅色出現，則可加一、二滴二苯胺試劑。此時如呈藍色反應, 則表示培養液中仍有硝酸鹽，又無亞硝酸鹽反應，表示無硝酸鹽還原作用。如不呈藍 色反應，表示硝酸鹽和新形成的亞硝酸鹽都已還原成其他物質，故仍應按硝酸鹽還原 陽性處理。2.2.3機油降解菌降解特性的初步研究分別考察不同接種量、機油濃度等環境因素影響下菌株對機油降解的試驗，并測 定其降解率。2.2.3.1機油含量的測定木試驗

33、根據國標gb3838-88規定，采用紫外分光光度法測定機油含量。（1）最大吸收波長的確定取配制好的100 g/l的機油石油酉迷溶液，將其稀釋成濃度為40 mg/l的機油石油 瞇溶液10 ml,然后用紫外分光光度計，以石油瞇為參比溶液，確定最大吸收波長。（2）機油標準曲線的繪制配制一系列濃度的機油石油瞇溶液分別為4.0、8.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/l,以石油瞇為參比溶液，在最大吸收波氏處測定吸光度，繪制岀標準曲線。（3）機油降解率的計算機油降解率（）=初始濃度c。一測定濃度c初始濃度c。2.2.3.2不同接種量對降解率的影響分別將培養24h的菌液（pl、p2）

34、 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml接種到100 ml機 油質量濃度為10.0 g/l的無機鹽培養液+30°c. 160r/min搖床振蕩培養，7d后測定 降解率。223.3不同原始機油濃度對降解率的影響將培養24 h的菌液2ml （pl、p2）接種到looml機油質量濃度分別為0.5、1.0、 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/l的無機鹽培養液中30°c. 160 r/min搖床振蕩培養，7d 后測定降解率。3實驗結果與分析3.1機油降解菌株的篩選從馴化的機油培養液中篩選分離到兩株菌株，分別命名為菌株p1和p2。兩株機 油降解菌分別在平板上劃線分離，長

35、出得單-菌落及菌落形態見圖1。從圖1可見，菌株p1菌落特征為乳白色、濕潤光滑、不透明、圓形、邊緣整齊。 菌落p2的菌落特征為乳黃色、濕潤光滑、不透明、圓形、邊緣整齊。(a) pl菌株(b) p2菌株圖1菌株的菌落牛長情況3.2菌株的生理生化特征鑒定3.2.1革蘭氏染色試驗結果將菌株pl、p2革蘭氏染色后用生物顯微鏡（1000倍油鏡）觀察。菌株p1為短桿菌，革蘭氏染色為陰性菌；菌株p2也為短桿菌，革蘭氏染色的結果為陽性。兩株菌株的細胞形態見圖2。(a) pl菌株(b) p2菌株圖2革蘭氏染色后的細胞形態（汕鏡x 1000倍）3.2.2芽孑包染色試驗結果菌株p1和p2均被染成紅色，觀察沒有芽孑包（

36、有芽抱會被染成綠色）。見圖3。(a) pl菌株(b) p2菌株圖3芽孑包染色后的細胞形態（油鏡x 1000倍）綜合各菌落形態特征的結果如表1。表12株菌株的細胞形態觀察結果菌株菌落特征細胞形狀革蘭氏染色芽抱產色索p1乳片色，濕潤光滑，不短桿陰性無無透明，圓形，邊緣整齊p2乳黃色，濕潤光滑，不短桿陽性無無透明，【員1形，邊緣整齊323生理生化特征綜合兩株菌株生理生化特征的結果如表2o項目菌株p1菌株p2運動性+過氧化氫酶（接觸酶）+淀粉水解+明膠液化+甲基紅試驗（m-r）乙酰卩基屮醇試驗（v-p）眄際試驗+硝酸鹽還原試驗+備注：+表示為陽性，一表示為陰性鑒定結果為：菌株p1為假單胞菌屬（pseu

37、domonas sp.）,菌株p2為短小桿菌屬（ciirtobeicteriiim sp.）。3.3機油降解菌株降解特性的初步研究菌株pl、p2在機油培養液屮進行振蕩培養過程屮，分布在表層的油膜逐漸分裂 成小顆粒的油滴，最后有油滴懸浮在培養液中或完全被乳化，見圖4。3.3.1降解率的測定3.3.1.1機油最大吸收波長的確定測定結杲為入max=254 nm* ,y . b f . *yb fbr : ".j i了 . " , 一-a5& as圖4降解效果：左側為加入機油降解菌（p1）的機油培養液（機油分解為小顆粒）;右側為未加入機油降解菌的機油培養液（表血仍冇明顯油層

38、）3.3.1.2機油標準曲線的繪制按照上文中機油標準曲線繪制的方法，測定結果如表3。表3機油標準曲線的測定結杲序號空白1234567濃度（mg/l）0481020304050吸光度a00.0370.1510.1870.3660.5440.7230.833根據標準曲線測定的結杲繪制標準曲線，見圖50其標準曲線相關方程為y =0.017x4-0.003, r2 = 0.994,吸光度a與濃度c線性相關顯著。圖5機油標準曲線3.3.2接種量對降解率的影響實驗結果見圖6,由圖6可知，在無機鹽培養慕營養充足的情況下，菌株pl、p2 對機油的降解率是隨著菌株接種量的增加而上升的。其屮原因可能是由于接種的微

39、生 物菌種數量越大，催化反應的酶越多，從而使降解率提高。接種量（ml）圖6接種最對降解率的影響但是考慮到實際的經濟成本或是培養基營養物質的有限性兩方面的問題，單單增 大接種量以提高降解率同時會造成接種量過大，微牛:物大量牛長，菌體密度大大增加, 會造成營養物質的短缺并ii會不利于單個菌體的生長，從而影響菌體對機油的吸收降 解。因此，在達到一定接種量后，再增加接種量反而會導致新增細胞減少而使整個活 性下降。最終導致短期內降解率加快，但持續降解能力下降。因此將接種量初步定為 2ml,之后的研究屮均采用此接種量。后期可以結合關于降解菌生長特性的進一步的 研究，選擇最為合適的接種量。3.3.3初始機油

40、濃度對降解率的影響實驗結果見圖7,由圖7可知，pl、p2在不同機油質量濃度的含機油無機鹽培養 基中的降解率均隨著油的質量濃度的升高而降低；在質量濃度低時，菌體對機油有較 高的降解效果，但當機油質量濃度升高時，降解率隨z下降。圖7原始機汕濃度對降解率的影響這種現彖是因為在機油濃度升高時，其會在培養基表層形成一層較厚的汕膜，油 膜會影響空氣中的氧氣向水體內部擴散，導致水中的溶解氧不足，從而抑制菌體的生 長，而機油的質量濃度過高其至對機油降解菌有毒害作用，機油降解率因此下降。另 一方面，機油質量濃度增大時，氮磷等營養鹽的濃度和對不足，難以達到菌株充分降 解機油的要求，也會造成機油質量濃度增高的情況下

41、，菌株對既有的降解率最終到達 一定的水平而不再提高。由此可以得出，機油質量濃度對石油姪的降解率有明顯的影 響。4討論我國的石油工業無論是從先期的開采，還是后期的石油化工生產目前均處于高速 發展階段。但是在開采作業中產生的落地石油，加工過程中產生的污水亦或是在運輸 過程中發生的石油泄漏，均對水質、土壤、大氣等多方面造成了十分嚴重的污染。機 油是重耍的石油加工產品之一，現作為潤滑油的機油在使用過程中更會不可避免地產 生泄漏和廢齊。解決這一類污染現狀目前最可行的方法就是生物降解，因為英不會在 處理過程中產生二次污染。通過篩選以機油為唯一碳源生長的微生物可以獲得機油降解菌。木實驗篩選得到 的菌種可以在

42、機油為唯一碳源的無機鹽培養基中生長代謝，經過初步鑒定，確定兩株 菌分別為假單-胞菌屬（pseudomonas sp.）和短小桿菌屬（cmobacf亦勁sp.）。查閱其 它相關文獻后，發現從取口不同地點的石油類化合物污染土壤屮分離篩選出的菌株屮 假單胞菌屬pseudomonas sp.）岀現的比例較高，可見假單胞菌屬（pseudomonas sp.） 類菌株在降解石油類化合物方面具有很廣的作用范圍，接下來可對兩株菌株貝體作用 底物范圍進行深入分析。國家石油化工污染物排放標準羽規定，石油化工廠和工廠污水處理廠排放口水污 染物最高允許排放濃度（石油類）一級、二級分別為10、20 mg/l；國家城鎮污

43、水處 理廠污染物排放標準2®規定，最高允許排放濃度（石油類）一級、二級分別為3、5 mg/l。試驗篩選至ij的菌株對丁機油具有降解能力，表示該菌在含機油廢水的生物處 理中具有潛在的應用價值。木試驗中，機油最高濃度0.5 g/l吋，菌株pl、p2的降解 率分別為47.5%、43.4 %o基丁石油化工廠產生的均為高濃度石油類污水，若將菌株 投入至石油化工廠產生的污水中，菌株并不能適應高濃度環境。但經石油化工廠處理 后排出的含油污水進入污水處理廠z后再次處理，在這一過程屮的污水石油類含量與 實驗中0.5 g/l濃度較為接近，使用菌株進行處理具有一定的可行性。本試驗對篩選出的菌株做了初步鑒定

44、，后可對其進行16srdna序列分析。對石 油類化合物污染進行牛物修復，必須先獲得具有高效降解能力的菌株。雖然目前菌株 降解率不高，但是可通過各種方法加強菌的降解率，如表血活性劑的使用，投加親油 的營養鹽，構建混合菌群等。下一步可對菌株采用誘變等實驗手段進行降解性能的提 高，對其降解底物范圍進行分析，弄清其對機油等石油桂類化合物進行降解的途徑，并對其進行實驗室模擬生物反應器和降解試驗，為具體的應用打卞基礎。結論木試驗通過選擇性培養，篩選分離出兩株機油降解菌，通過初步鑒定，確定兩株 菌分別為假單胞菌屬(pseudomonas sp.)和短小桿菌屬(curtobacterium sp.)o機油濃

45、度為 10.0 g/l、接種量分別為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml 時，溫度 30°c、160 r/min 搖床振蕩培養7d后,菌株pl、p2的降解率分別為22.1 %、25.3%、29.6 %、33.3 %、 35.1 %和 20.4 %、24.6%、29.3 %、35.5 %、36.7 %；接種量為 2ml,機油濃度分別為 0.5、 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/l,溫度 30°c、160 r/min 搖床振蕩培養 7d 后，菌株 pl、p2 的降解率分別為 47.5%、44.3%、41.0%、39.8%、37.3 %、35.6%

46、、33.3 %和 43.4 %、42.0%、39.7%、3&5 %、37.3 %、36.4 %、35.5 %。結果表明接種量與機油濃度均對 降油效果產生一定影響。本論文是在指導老師張國良的悉心指導下完成的。從論文的選題、試驗的設計到 論文的寫作與修改宜至最終成文，都凝結著張老師的心血和汗水。張老師廣博的專業 知識以及對我試驗期間的嚴格要求與精心指導，使我無論在理論知識上還是在試驗操 作上都有了很大的進步。在此我向他表示我衷心的感謝！同時我也要感謝同學陳啟明、楊刀蘭、郭燕紅在試驗過程屮對我的幫助，正是有 了這些老師與同學對我的幫助，才使得我的論文能夠得以順利進行。參考文獻1 betts, w. b.bioremediati