1、6桑蠶資源的生物活性成分藥理成份產業化工藝路線6.1桑資源的生物活性成分藥理成份產業化工藝路線6.1.1桑枝總黃酮提取工藝優化黃酮類化合物的生物活性。黃酮類化合物是藥用植物的主要活性成分之一，具有廣泛的生物活性。具有抗氧化、降低脂質過氧化反應、預防心血管疾病以及抗衰老等作用。隨著研究方法和技術的不斷提高，發現黃酮類化合物還具有清除自由基、抗菌消炎、抗過敏、抗病毒、抗癌和提高免疫力等作用。我國桑枝資源豐富，不管直接以桑枝作為藥材而進行初級開發，還是以其為原料，用以中藥制劑或者保健品的次級開發，或者用以天然藥物產品的深度開發，桑枝均具有重大的綜合利用價值。利用桑枝黃酮類化合物開發新藥或者保健品，更

2、具有廣闊的應用前景。(1)桑枝總黃酮提取工藝研究。本實驗探討了提取時間、乙醇濃度、料液質量濃度及溫度對桑枝總黃酮提取效果的影響，在此基礎上利用正交試驗，采用極差和方差分析法確定了黃酮的最佳提取工藝條件：溫度為80、料液質量濃度33g/L、乙醇濃度70、浸提時間120min。在該條件下，其提取率可達101。(2)桑枝總黃酮的分離純化研究。本試驗探討了聚酰胺分離純化桑枝總黃酮的靜態吸附和動態吸附兩方面的技術參數，靜態吸附上樣量1：274gg(凈黃酮量：樹脂量)、動態吸附上樣量l：61gg、上樣濃度2149mgmL、吸附流速和解析流速均為lmLmin、吸附時間lh、70乙醇作為洗脫劑。在此條件下黃酮

3、的洗脫量可達9229。(3) 桑枝中桑色素的分離純化及檢測。采用95乙醇浸提，乙酸乙酯萃取，聚酰胺樹脂吸附色譜法對桑色素進行分離純化。結果表明，該方法可提取分離到高純度的桑色素。薄層層析色譜法顯示，以氯仿：甲醇：醋酸(15：5：2)作為展開劑，用1硝酸鋁醇溶液顯色，可于波長為365nm的紫外燈下觀察到桑色素顯綠色熒光。用高效液相色譜作定性檢測，結果表明，用symmetryC-18(46x150mm)色譜柱，以甲醇：水：磷酸(50：498：O2)為流動相，流速為lmLmin，柱溫30，在波長370nm處桑色素具有良好的色譜吸收峰。（4）體外抗氧化活性研究。本試驗以VE做對照，從清除自由基能力和還

4、原能力兩方面評價了蘆丁、槲皮素、桑色素和桑枝總黃酮抗氧化能力。結果表明，槲皮素對DPPH·的清除能力最強，是VE的14倍，桑色素和桑枝總黃酮的清除能力相近且弱于槲皮素，蘆丁清除能力最弱；在002-008mgmL范圍內，槲皮素的還原能力最強，桑色素和桑枝總黃酮與VE的還原能力相近，且弱于槲皮素，蘆丁的還原能力最弱。（5）不同品種桑枝總黃酮含量比較。本試驗對本校桑樹種質資源圃中保存的幾種生產上廣泛種植的栽培品種的桑枝總黃酮含量進行了測定比較，結果顯示， 不同品種之間桑枝總黃酮含量差異較大。一、研究內容(1)研究xx桑樹種質資源圃中嘉陵20號的桑枝為材料，選擇提取時間、乙醇濃度、料液質量濃

5、度及溫度對桑枝總黃酮提取效果進行了單因素實驗，在此基礎上利用正交實驗，采用極差和方差分析法確定了桑枝黃酮的最佳提取工藝條件。(2)以聚酰胺為材料，通過靜態和動態吸附實驗，研究了聚酰胺分離純化桑枝總黃酮的最佳技術參數。(3)采用95乙醇浸提，有機溶劑萃取，聚酰胺樹脂吸附色譜法對桑色素進行分離純化，用薄層層析色譜與高效液相色譜相結合的方式進行定性分析，確定了分離純化及鑒定桑色素的技術路線和方法。(4)以VE做對照，從清除自由基能力和還原能力兩方面評價了蘆丁、槲皮素、桑色素和桑枝總黃酮的抗氧化能力。(5)利用NaN02-Al(N03)3-NaOH分光光度法測定了廣泛種植的幾種桑樹栽培品種桑枝總黃酮含

6、量并比較了其差異性。二、桑枝總黃酮提取工藝優化利用實驗室的常用的儀器設備條件對人工三倍體嘉陵20桑枝黃酮進行粗體工藝優化，技術路線如下：桑枝總黃酮提取工藝優化桑枝單因素條件下提取不同時間不同乙醇濃度不同溫度不同料液比提取液 提取液 提取液 提取液計算提取率設置正交實驗計算提取率正交實驗最優組合重現性實驗 精密度實驗 加樣回收實驗 穩定性實驗結果與分析桑枝95%乙醇浸提濾渣濾液減壓濃縮濃縮液萃取氯仿部分水部分乙酸乙酯部分薄層檢測棄去棄去濃縮液上樣樹脂柱床裝柱精制樹脂新樹脂預處理70%乙醇洗脫洗脫液薄層檢測無效成分洗脫液有效成分洗脫液減壓濃縮棄去濃縮液HPLC檢測上樣桑枝提取液濃縮濃縮液70%乙醇

7、已知黃酮濃度樣品液聚酰胺靜態吸附實驗動態吸附實驗吸附時間的確定上樣量的確定洗脫劑的選擇吸附流速的選擇吸附濃度的選擇泄露曲線繪制乙醇濃度的選擇桑枝提取液濃縮濃縮液70%乙醇桑枝黃酮樣品液蘆丁槲皮素桑色素酶標儀清除DPPH能力的測定清除ABTS+能力的測定還原能力測定不同品種桑枝提取液計算黃酮含量比較與分析6.1.2 桑葉黃酮提取純化工藝及對尿酸代謝的影響 一 、桑葉黃酮是其中主要的生物活性成分，藥理學研究表明：桑葉黃酮具有調節-葡萄糖苷酶、降血糖、抗腫瘤等藥理活性。而且黃酮類化合物對高尿酸血癥有效。為深度利用資源，本文對黃酮的提取分離技術進行了工藝研究，并后研究了桑葉黃酮對高尿酸血癥模型的降尿酸

8、的作用。研究通過高壓液相色譜法對桑葉黃酮類化合物進行成分分析，結果表明，其主要成分為蘆丁，楊梅素，槲皮素，山奈素等。采用正交試驗法對提取桑葉黃酮的工藝進行優化，結果表明，最佳的浸提條件為：在80下70乙醇回流提取2次，每次15h，料液比為1：2 0(wv)。為得到純度較高的桑葉總黃酮，采用大孔樹脂吸附法進行黃酮純化，以桑葉總黃酮的得率和純度為指標，比較了五種大孔樹脂的吸附性能，結果顯示HPD826大孔樹脂對桑葉總黃酮吸附性能最好；進一步采用正交試驗法對HPD826大孔樹脂純化桑葉黃酮的工藝進行優化，所獲最佳條件組合為：取濃度為4mgml左右的桑葉提取液上樣，上樣體積為15樹脂體積數(BV)，上

9、樣速率控制在2 BVh左右，之后用3 BV， 60的乙醇， 以1 BVh的速率洗脫，純化后的桑葉黃酮得率為195，純度5541。 所以選擇體外實驗探討桑葉黃酮(MLF)對大鼠肝臟勻漿液中黃嘌呤氧化酶(XO)活性的影響，結果顯示：MLF劑量依賴性地抑制大鼠肝臟勻漿液XO活性，在10000 mgL抑制率與別嘌醇(AP)無顯著差異，提示MLF可能具有降尿酸活性。進一步研究其對正常小鼠血清UA含量和肝臟勻漿液XO活性的影響，以50、100、200 mg/kg*d_1劑量MLF灌胃正常小鼠14d，測定相關指標。結果顯示：MLF三種劑量與對照組相比對正常小鼠體內血清UA含量和肝臟勻漿XO活性均無顯著性影響

10、，對小鼠體重和臟器系數無顯著影響。采用氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥小鼠模型評價了MLF的降尿酸活性，以50、100、200 mg/kg*d_1劑量MLF灌胃正常小鼠14d，檢測相關指標，結果顯示：200mgkg bW MLF可極顯著(P<001)降低模型小鼠血清尿酸含量，下降1667；并能顯著(P<O05)抑制肝臟XO活性，抑制率達605。而50 mgkg bw MLF對肝臟XO活性的無明顯影響(P>005)，但能極顯著降低模型小鼠血清尿酸含量(P<001)。長期高尿酸血癥導致腎損害和痛風， 腎損害亦可致尿酸排泄障礙。為進一步探討桑葉黃酮對病理狀態下的尿酸代謝及相關腎損傷的

11、影響，本實驗繼續研究了MLF對腺嘌呤聯合高糖飼料誘導的大鼠高尿酸血癥、腎損傷的防治作用。在腺嘌呤聯合高糖飼料誘導的高尿酸病理狀態下，分別給予200、100、50 mg/kg*d_1的MLF，以別嘌醇為陽性對照藥物。結果顯示：MLF中、高劑量組在給藥1 w后，血清UA水平分別降低1783和2117；2w后降低2109和2715。3w后MLF中劑量組血清尿酸接近于正常大鼠水平，XO活力比HC組顯著降低2501。200mg/kg*d_1 MLF可使血清TG，FFA水平降低4195，4205，同時MLF可減小腺嘌呤造模引發的肝臟、心臟系數的異常。降低高尿酸病理狀態下肌酐和尿素氮含量，并通過電鏡觀察，M

12、LF對腺嘌呤所引起腎臟損傷有一定的保護作用。綜合以上結果：推斷MLF具有明顯的降尿酸活性，并對高尿酸病理狀態下的腎臟損傷有一定的保護作用；MLF可能通過抑制XO和調節脂質紊亂來調節血清UA水平。2、 桑葉黃酮的提取純化工藝研究 成分分析研究表明桑葉富含黃酮，為進一步利用桑葉資源，需研究其黃酮類化合物的提取、純化方法。大孔樹脂物理化學穩定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長，現已廣泛應用于天然產物的分離和富集。大孔樹脂的特性會影響黃酮分離的效果。因此， 本實驗進一步分析桑葉總黃酮含量，優化桑葉總黃酮提取工藝，就大孔樹脂純化桑葉黃酮的工藝條件作

13、研究。(一)、桑葉黃酮類物質提取方法研究1、材料、試劑和儀器11材料：桑葉(來源同前)，蘆丁標準品(上海試劑二廠)，其它試劑均為國產分析純。2、實驗方法21材料預處理：用粉碎機粉碎，石油醚脫脂，常溫揮干，備用。22黃酮含量測定標準曲線的制作準確稱取20mg蘆丁標準品置50mL容量瓶加60乙醇至刻度，搖勻。量取25mL置50mL容量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，即得02mgmL的蘆丁標準液，精密量取1OmL，2OmL，3OmL，4OmL，5OmL，60mL此標準液于25mL容量瓶中以30乙醇補足為6mL，搖勻，加5亞硝酸鈉1mL，放置6min后，加10硝酸鋁lmL，放置6min，再加4氫氧化鈉10m

14、L，30乙醇定容，搖勻，放置15min。以不加樣品作為空白，于505刪波長處測吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到以蘆丁計的總黃酮含量(x)與吸光度(y)之間的回歸方程：y：18222x一00016，r=0997723黃酮類化合物浸出率的計算浸出率()=桑葉中提取的黃酮含量桑葉的質量×10024桑葉總黃酮提取工藝單因素試驗分別研究乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間等因素對提取桑葉總黃酮含量的影響。精確稱取桑葉粉末2Og，加50ml酒精，在相同的條件下提取，過濾提取液，最后定容至50mL，并以浸提液中黃酮的吸光度為考察指標，在單因素水平研究桑葉黃酮的提取方法。2

15、5桑葉總黃酮提取工藝優化在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗方法，優化桑葉總黃酮提取工藝。選擇乙醇濃度、料液比、時間和溫度進行四因素三水平的正交試驗，試驗因素水平。三、試驗結論及桑葉黃酮的提取純化工藝 通過單因素試驗及正交試驗，優化了桑葉總黃酮提取工藝。本試驗設計的提取溫度、提取時間、提取次數、料液比四因素對總黃酮的提取效率都有顯著影響。各因素對提取效率的影響程度各異，影響桑葉總黃酮提取效率的各因素的主次順序為溫度>提取次數>料液比>提取時間。綜合各種因素，確定桑葉總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度7096、提取溫度80、料液比1：2 O、提取時間15h提取2次。 運用靜態吸附與解

16、吸實驗對對5種吸附樹脂的吸附和解吸特性的比較，發現樹脂的極性、比表面積和平均孔徑的大小直接影響樹脂吸附容量和解吸率。結果表明，考察的幾個大孔樹脂中，HPD826型大孔樹脂表現出最好的吸附性能與良好的解吸效果。因此選用HPD826型大孔樹脂對桑葉總黃酮進行純化。通過單因素實驗、正交實驗以及方差分析確定了桑葉總黃酮分離富集的最佳操作條件。研究結果表明，最佳工藝條件為：上樣體積為15 BV，上樣速率控制在2 Bvh左右。上樣結束后， 再用3 Bv， 60的乙醇， 以1 BVh的速率洗脫。 由本實驗室制備流程是：桑葉->干燥>粉碎>石油醚脫脂>乙醇提取>過濾>濃液離

17、心>石油醚萃取>下層水溶液上柱純化>水洗>乙醇洗脫>收集洗脫液>低溫干干燥。通過以上流程得到精制的桑葉黃酮，其純度為5541。 本文主要就桑葉的活性成分、桑葉黃酮的提取純化工藝研究、桑葉黃酮對正常小鼠尿酸代謝的影響和對高尿酸模型尿酸代謝的影響四個方面進行研究，現將主要成果總結如下： l在成分分析方面，桑葉中含量較多的天然產物為多酚、黃酮和多糖，進一步采用唧LC法測定，桑葉含有較多蘆丁，楊梅素，槲皮素，山奈素等黃酮類物質。 2通過桑葉黃酮的提取純化工藝研究，綜合各種因素，確定桑葉總黃酮的最佳提取純化工藝，得到精制的桑葉黃酮。 3桑葉黃酮對正常小鼠的實驗表明，M

18、LF對正常狀態下的小鼠無影響。4桑葉黃酮對氧嗪酸鉀致高尿酸血癥小鼠的實驗表明，MLF對于XO活性具有抑制作用，對高尿酸血癥有一定的改善效應。桑葉黃酮有效降低腺嘌呤誘導高尿酸血癥大鼠的血尿酸水平，緩解高尿酸對腎臟的損傷，其可能的作用機理為：一方面，本研究提示MLF組對肝臟XO有明顯抑制作用，提示XO是MLF在體內的藥物靶點之一。另一方面MLF能影響磷酸戊糖途徑，使uA生成減少，模型動物血清TG，UA水平均顯著降低。6.1.3 桑葉1-脫氧野尻霉素提取分離方法研究研究了從桑葉中提取分離1-脫氧野尻霉素(DNJ ) ,探討了提取劑、提取方法、料液比、提取次數、時間等因素對提取率的影響。實驗表明:提取

19、的最佳條件為以65%的乙醇為提取劑,按料液比18和14超聲強化細胞破碎20 min (功率1800W) , 732 H陽離子樹脂分離, 0. 25 mol /L 的氨水洗脫(洗脫速度1 2 mL /min) ,提取率為95. 8% ,得率為124. 54 mg/100 g,純度為92. 3%以上。本方法具有工藝流程簡單、快速、提取率高的優點,適合于工業生產。1實驗部分1. 1試劑與儀器桑葉,購于藥材市場(經檢測DNJ含量為130 mg/100 g) ; 732 H陽離子交換樹脂,鈉型;食用乙醇(95%) ;硫酸、鹽酸、氨水、正丁醇、碘化鉀等均為分析純。FZ102微型植物試樣粉碎機; JY98-

20、超聲波細胞粉碎機; RE-52旋轉蒸發器; 752紫外可見光柵分光光度計。1. 2工藝流程圖1工藝流程圖Fig. 1Diagram of craft1. 3操作方法將桑葉粉碎過40目篩,稱取100 g于1000 mL燒杯中,加65%乙醇800 mL浸泡30 min,放入超聲波細胞破碎機中處理20 min,過濾,收集濾液,殘渣加入400 mL 65%乙醇重復處理一次,過濾,棄去殘渣,合并兩次濾液,將濾液用旋轉蒸發儀回收乙醇并濃縮至小體積,進行離心分離。收集上清液并通過內裝陽離子交換樹脂的交換柱,用蒸餾水沖洗至流出液無色為止。用0. 25 mol/L的氨水洗脫(洗脫速度12 mL /min) ,收

21、集洗脫液。將洗脫液用旋轉蒸發儀濃縮,用濃縮液一倍體積的正丁醇萃取3次,棄去水層合并正丁醇相,回收正丁醇,真空干燥即得成品。1. 4提取率計算提取率的定義為:a =m1m×100% (1)式中aDNJ提取率, %;m1 提取液中DNJ的含量,mg/100 g;m 樣品中DNJ的含量,mg/100 g。2結果與討論2. 1提取劑的選擇稱取粉碎過40目篩的樣品100 g三份,放入三個1000 mL燒瓶中,分別加入蒸餾水、0. 25%的稀硫酸、65%乙醇800 mL,在相同的條件下回流提取,過濾,定容至1000 mL容量瓶中。采用分光光度法測定DNJ的含量,結果見表1。表1不同提取劑與提取率

22、的關系Table 1Rela tion between extraction ra te and var iety of solven ts提取劑 提取劑方法 提取時間/h 提取次數 溫度/ 料液比/ ( g·mL - 1 ) DNJ 提取量/ mg·(100 g) - 1 提取率/%蒸餾水 回流提取 2 1 80 18 78. 26 60. 20. 25%的稀硫酸 回流提取 2 1 80 18 106. 99 82. 365%的乙醇 回流提取 2 1 80 18 103. 22 79. 2由表1可知, 0. 25%的稀硫酸提取率最高, 65%乙醇次之,蒸餾水最差。因為DN

23、J屬于生物堿類化合物,易溶解于酸性介質,形成可溶性鹽。從實驗結果來看65%乙醇與0. 25%的稀硫酸對DNJ的提取率相差不大,而稀硫酸提取液過濾及濃縮相對困難,故本方法采用65%乙醇作為提取劑。2. 2提取方法的選擇取樣品100 g兩份,一份加65%的乙醇800 mL于1000 mL燒杯中,放入超聲波細胞破碎機中提取,另一份放入1000 mL燒瓶中,加入相同濃度和相同體積的乙醇,在80下進行回流提取,圖2不同提取方法與提取率的關系Fig. 2Relation between extraction rate anddifferent extraction methods由圖2可知, 20 min

24、時,超聲強化細胞破碎提取法的提取率為92. 7%, 2 h時熱回流法的提取率為79. 2%。超聲強化細胞破碎法提取與常規熱回流相比,DNJ提取率高13. 5% ,時間僅為1 /6。這是因為當桑葉在溶劑中受到超聲作用后,超聲產生的空化效應,使溶劑隨超聲產生的空化泡的崩潰,很快滲透到桑葉內部細胞中,并使細胞內的DNJ 快速滲透、溶解并轉入溶劑,使細胞內外出現濃度差,促使DNJ從高濃度溶液向低濃度溶液中擴散,大大加速了提取過程。同時伴隨著空化泡崩潰瞬間釋放出來的能量,使桑葉中的細胞壁破裂,溶劑直接進入細胞內部,使細胞中的DNJ 在超聲作用下直接轉入溶劑中,通過溶劑將細胞中的DNJ在很短時間內全部提取

25、出來。與傳統提取法相比,增加了物質內部化學成分的提取率。而熱回流法隨著時間的延長,提取率開始增高后有所下降,是部分DNJ遭到破壞所致。2. 3提取時間的選擇將樣品100 g, 加入65%的乙醇800 mL 于1000 mL燒杯中,放入超聲波細胞破碎機中提取,測定不同時間的提取率,超聲強化細胞破碎提與提取率的關系見圖3。圖3超聲強化細胞破碎提取時間與提取率的關系Fig. 3Relation between extraction rate and ultrasonic time由圖3可知,提取率隨超聲波提取時間的增加而增大, 20 min時,隨著時間的增加,提取率趨于平緩。本實驗選取20 min作

26、為提取時間。2. 4乙醇濃度的選擇取樣品100 g四份,分別加入50% , 60% , 65%和70%四種不同濃度的乙醇800 mL于1000 mL燒杯中,在相同條件下進行超聲強化細胞破碎提取一次,測定DNJ含量,結果見表2。表2不同乙醇濃度與提取率的關系Table 2Rela tion between extraction ra te andd ifferen t concen tra tion of ethanol溶 劑 提取方法 超聲時間/min 提取次數 DNJ提取量/ mg·(100 g) - 1 提取率/%50%乙醇 超聲破碎提取 20 1 80. 86 62. 260%

27、乙醇 超聲破碎提取 20 1 90. 22 69. 465%乙醇 超聲破碎提取 20 1 120. 51 92. 770%乙醇 超聲破碎提取 20 1 116. 64 89. 5由表2可知, 65%乙醇提取效果最好。2. 5料液比及提取次數的選擇取樣品100 g四份,加入65%乙醇,按料液比(摩爾比) 14, 16, 18, 110進行超聲強化細胞破碎提取兩次,每次20 min,結果見表3。表3不同料液比與提取率的關系Table 3Rela tion between extraction ra te andd ifferen tma ter ia l liqu id ra tio料液比/ (

28、g·mL - 1 ) 提取次數 DNJ提取量/ mg·(100 g) - 1 提取率/% 14 1 110.76 85. 2 2 119. 73 92. 1 16 1 117. 39 90.3 2 121. 94 93.8 18 1 120.51 92.7 2 126.49 97.3 110 1 122.98 94.6 2 127.53 98.1 由表3可知,隨著料液比的增加,溶解出來的產物也增多。當料液比為1 8 一次提取時, 已有92. 7%的DNJ被提取出來,兩次為97. 3% ,但過多的乙醇會給后工序的乙醇回收造成負擔。故選用料液比為18 和1 4 各一次提取,這時

29、的提取率為95. 8%。2. 6成品分離及純度檢測取樣品100 g于1000 mL 燒杯中,按照上述實驗得到的最佳提取條件進行超聲強化細胞破碎提取,DNJ得率為124. 54 mg/100 g。將得到的DNJ 提取液上內裝陽離子交換樹脂的交換柱, 用蒸餾水洗至流出液無色為止。用0. 25 mol/L的氨水洗脫(洗脫速度1 2 mL /min) ,收集洗脫液。將洗脫液用旋轉蒸發儀濃縮,正丁醇萃取,回收正丁醇,真空干燥得到成品。經檢測純度為93. 2%。3結論(1)上述實驗證明, DNJ 提取的最佳生產條件為: 65%乙醇作為提取劑,按料液比18和14各一次進行超聲波提取20 min。提取液通過陽

30、離子交換樹脂,以0. 25 mol/L 的氨水洗脫,流速控制在1 2 mL /min,洗脫液經正丁醇萃取,濃縮、干燥后得到成品。(2)DNJ提取率為95. 8% ,得率為124. 54 mg/100 g,純度可以達到93. 2%。(3)超聲強化細胞破碎提取法具有快速、簡便、提取溫度低、提取率高的優點,不會使桑葉的有效成分破壞。( 4)本方法工藝流程簡單、快速、提取率高,適合于工業生產,為桑葉的綜合利用及糖尿病的預防和治療藥物的開發奠定了一定的基礎。6.1.4 桑葉中1-脫氧野尻霉素的檢測、提取及其生理活性研究 DNJ之所以被人們越來越重視，主要由于它具有治療糖尿病、抑制腫瘤轉移、抑制病毒、抗濾

31、過性病原體、高純度麥芽糖的酶合成、在大鼠體內的代謝、減肥和增加胰島素敏感性等作用。目前國際市場主要需要的桑葉提取物產品DNJ含量基本都在10以上甚至有些要20以上，而國內生產的桑葉提取物中DNJ的含量大都在5以下，由此可以看出我國在這方面的發展空間還是比較大的。其實在高純度DNJ產品上同樣有較大的發展空間，5mg純度為95DNJ標準品其市場售價可達1500元人民幣,而純度為99，99同樣重量的DNJ產品更能賣到3000元以上，故進行較高純度桑葉中DNJ分離純化研究具有相當的經濟價值。在干桑葉中的DNJ含量一般為01左右，在桑根部位會略高一些為014。其實，DNJ不僅在桑樹不同部位含量有差異，即

32、使是相同部位比如桑葉，不同品種其中的含量差異也是很大的。DNJ的提取：1乙醇浸泡提取法，先用65乙醇浸泡樣品粉末20min，然后過慮取濾液，剩下的殘渣再用的65乙醇再重復處理一次所得濾液和前一次合并。用旋轉蒸發儀蒸發濾液，回收乙醇并將濾液濃縮到小體積。離心后取上清液，并使其通過陽離子交換樹脂。先用蒸餾水沖洗直到流出液為無色，然后再用025 molL的氨水洗脫（洗脫速度l2 mlmin)，收集洗脫液。用旋轉蒸發儀濃縮洗脫液，再用洗脫液相同體積的正丁醇萃取3次。取正丁醇相棄去水相，真空干燥就可得成品提取率為958，得率為12454 rag100 g，純度為923以上。2蒸餾水提取法，把桑葉粉碎后放

33、進蒸餾水中進行回流加熱，225小時間后過慮取水溶液然后再重復一次合并兩次提取液，再利用陽離子交換柱(00lx7型)層析對DNJ進行了初步純化，收集pH為94105的洗脫液。3微波輔助提取法，把一定量桑葉粉末加入無菌過濾水中其固液比例為1：40(gm1)。在微波爐中加熱15min，提取兩次。其中微波爐的功率為406W。然后乘熱洗滌殘渣，濃縮，置于50mL容量瓶中，作為供試品溶液待用，最后得DNJ提取率為0024。4超臨界流體萃取法，超臨界流體是物質在臨界溫度和臨界壓力以上的一種特殊狀態，它既不是氣體也不是液體而是具有二者雙重優點的流體狀態。在超臨界狀態下，超臨界流體與待分離的物質接觸后，其能有選

34、擇性地把極性大小、沸點高低和分子量大小不同的成分依次萃取出來。可作超臨界萃取溶劑的物質有很多如：乙烯、乙烷、甲醇、N20和C02等。超臨界萃取一般都以C02為溶劑，這主要是由于C02超臨界壓力約為737MPa，臨界溫度在3 11左右可以在常溫的環境下進行萃取且它無毒無味、化學惰性能夠使產品無溶劑殘留。而生物堿的超臨界萃取一般不用C02，這是由于C02是非極性物質而生物堿尤其是DNJ的極性卻很強這就決定著DNJ在C02中的溶解度會很低，所以超臨界萃取生物堿一般選用極性較強的N20作為溶劑。為了讓超臨界萃取法對生物堿的萃取效果更加有效，有時會用上堿化劑和夾帶劑等輔助手段。在對生物堿的超臨界苯取過程

35、中萃取時間、萃取溫度和萃取壓力很重要。在短時間的超臨界苯取中實際得率值往往高于預計得率值，而在長時間的超臨界萃取中實際得率值又往往低于預計得率值，這個原因主要是由于生物堿是結合態和游離態共存的狀態。當萃取壓力在低水平時，隨著萃取壓力的升高萃取得率的增速也會相應提高而在萃取壓力較高時這種增速就會較為緩和。這是因為在低水平的萃取壓力下，壓力的小幅度變化對密度影響很大。上述常規方法中數乙醇浸泡提取法比較成熟可行，其他的方法都過于簡單對DNJ都只是進行很簡單的初步分離而且效率不高很難得到比較純的DNJ。但乙醇浸泡提取法也有很多不足之處，這種提取方法也只是稍微更叫純化了些但也很難滿足現對DNJ的使用要求

36、。與之相比超臨界流體萃取法可能就有些優勢了，它不僅操作簡單只要加入干粉調好條件即可而且純度比較高，但是它的缺點是具體條件很難把握比如溫度、壓力等所以這中方法也不是很成熟，有待進一步研究。目前，DNJ的檢測方法很多，但都不能兼顧檢測靈敏度和儀器使用的方便性。本實驗建立了檢測DNJ的柱前衍生化反高效液相紫外檢測法，并對檢測條件進行研究，結果表明該方法不僅可以精確的檢測DNJ的含量而且操作起來也很簡單。它既比高效液相-熒光檢測器經濟又比碘碘化鉀方法精確，而且它的準確性、重現性、穩定性都比較好，所以它可以作為一種普遍的定量檢測DNJ的方法。研究表明硼酸鹽緩沖液pH值對衍生化反應影響最大，影響RP-HP

37、LC檢測時的峰型，緩沖液pH值為850時檢測效果最好。RPHPLC流動相中乙腈和01醋酸的比為55：45時，分離效果與峰型最好。桑葉和桑根皮中DNJ含量相對較高，但桑樹體內中DNJ的含量，因葉位、品種、發育階段、季節、地理氣候等因素的不同而存在很大差異。桑枝皮層中DNJ含量最高，其次為桑葉和桑枝木質部。桑葉品種資源1脫氧野尻霉素含量調查:1材料與方法,11實驗原料及其主要試劑桑葉：本次研究共132個桑品種，ll7個品種于2009年8月采自湖北武漢經濟作物研究所桑園，15個桑品種于2009年5月和8月采于安徽農科院蠶桑研究所桑園。為了保證每個品種具有可比性，全部桑品種的桑葉采桑枝下部的成熟的3眼

38、葉，每個品種采約500g，烘干后粉碎過60目篩保存。主要試劑：DNJ標準品： 純度99，Sigma公司;色譜乙腈： 上海凌峰化學試劑有限公司;芴甲氧酰氯(FMOC-C1): 純度99，揚州寶盛生物化工有限公司,其他化學試劑均為分析純。12主要儀器設備。高效液相色譜系統： 包括2487雙波長檢測器、2410折光指數檢測器、2996二極管陣列檢測器、515反相高效液相色譜泵和Waters授權軟件，Waters公司電熱恒溫鼓風干燥箱：上海躍進醫療器械廠分析天平：精確度000lg，上海奧豪公司HH-2恒溫水浴鍋：國華電器有限公司JY92-II超聲波細胞粉碎機： 寧波新芝生物科技股份有限公司。13桑葉樣

39、品處理:新鮮桑葉70。C烘干至恒重，粉碎后過60目篩。稱取132種不同品種干燥桑葉粉末各90mg，加入25ml 005molL的鹽酸溶液，冰浴中超聲波破碎30min(功率400W，工作時間3s，工作間隙7s，工作次數180次)，然后17000×g離心15min(10)，取上清液，把沉淀再重復提取一次，合并兩次上清液，加蒸餾水定容至6ml(于10ml刻度離心管中)，該樣品提取液4保存備用。然后通過:標準曲線制作、樣品衍生化過程、樣品的檢測和結果與分析:標準曲線的建立,得到不同產地不同品種桑樹品種資源的DNJ含量。桑葉中DNJ的提取和純化方法，1脫氧野尻霉素(DNJ)對葡萄糖苷酶的抑制作

40、用很強，被人們當作糖尿病的克星。隨著對它研究越來越深入透徹它也越來越被人們重視，但目前缺乏高純度的的有效的工業化生產DNJ的方法，以至DNJ現在的市價遠遠高于毒品的價格。所以，建立一種快速、有效、便宜的分離提取純化DNJ的方法就非常重要。1脫氧野尻霉素(DNJ)在桑葉中含量很低，目前多篇文章報道對其提取工藝進行優化，但是其在干桑葉中的含量僅僅1多一點，因此，本研究重點考察不同純化步驟對DNJ純度和產量的影響，期望為工業化生產高純度的DNJ建立基礎。1材料與方法11試驗原料及其主要試劑桑葉：采自XX蠶種場桑園，烘干粉碎后過60目篩制成的干燥桑粉，保存備用。石油醚(分析純)： 無錫市展望化工試劑有

41、限公司；氨水(分析純)： 上海中試化工總公司；乙腈(分析純)： 山東禹王實業有限公司化工分公司；冰醋酸(分分析純)： 國藥集團化學試劑有限公司；芴甲氧酰氯(FMOCC1)： 揚州寶盛生物化工有限公司；甘氨酸： 上海源聚生物科技有限公司；DNJ標準樣品： 純度99，Sigma公司。12主要儀器設備高效液相色譜系統：包括2487雙波長檢測器、2410折光指數檢測器、2996二極管陣列檢測器、515反相高效液相色譜泵和Waters授權軟件，Waters公司；SHZ-IIID型循環水真空泵： 上海亞榮生化儀器廠；旋轉蒸發器RE一52： 上海亞榮生化儀器廠；BTl-200恒流泵： 上海琪特分析儀器有限公

42、司；數控計滴自動部份收集器： 上海滬西分析儀器廠有限公司；GL-20G-II離心機： 上海安亭科學儀器廠；JY92一II超聲波細胞粉碎機： 寧波新芝生物科技股份有限公司；真空冷凍干燥機： 北京松源華豐發展科技有限公司。13提取純化工藝流程圖Fig4-1 The flow chart of extracting DNJ in mulberry通過桑葉中DNJ提取溶液的制備、大孔樹脂純化、陽離子交換樹脂純化、硅膠純化、樣品的檢測環節具體處理，再通過標準曲線的制備及純化前樣品粗提液的DNJ含量與大孔樹脂純化后DNJ含量、陽離子交換樹脂純化后DNJ含量、硅膠純化后DNJ含量不同純化步驟產物檢測圖譜比較

43、，說明陽離子交換樹脂純化和硅膠純化后是純化DNJ有效的步驟。 實驗考慮到桑葉中DNJ的含量約01左右，沒有進行提取工藝的優化，而重點考察了純化步驟對DNJ純度的影響。樣品粗提后，純度為12842，比桑葉中的純度提高了1252倍，說明乙醇提取和超聲波破碎對提取DNJ是有效的方法。利用大孔樹脂純化后，樣品DNJ純度比上一步驟提高260倍，陽離子交換樹脂純化可以進一步提高370倍，兩步合計提高樣品純度964倍。硅膠柱純化后，樣品純度達到19085，比粗提液提高了1486倍。以上不同的純化步驟各自作用也各不相同，其中：大孔樹脂主要去除黃酮類物質、色素等雜質；732型陽離子交換樹脂主要去除一些蛋白類雜質

44、；至于硅膠主要是起到去除多糖和桑葉中其他種類的生物堿等雜質的作用。從本次純化的結果看，產品中DNJ的純度得到了19085，能夠滿足作為食品添加劑使用的要求。若需要進一步提高產品的純度到90以上，反復重復3個純化步驟，可能達到目的純度，但考慮到每一步對DNJ都有損失，因此，建議使用制備型HPLC直接進行制備。 實驗并用桑葉提取的的DNJ添加到飼料中，調查提取的DNJ對糖尿病小鼠的抑制作用。 結論與展望。1結論：實驗建立了一種既不是很昂貴而靈敏度又高的檢測DNJ的方法一一反相高效液相紫外線檢測法，并用該方法對132不同品種和5個不同葉位的干桑葉粉中DNJ含量進行了檢測；另外還使用了乙醇浸泡、超聲波

45、破碎及過大孔樹脂、陽離子交換樹脂和硅膠柱等方法從桑葉中分離提取純化DNJ；最后用本實驗室提純的含DNJ的桑葉提取物喂養高血糖模型小鼠和健康小鼠，來考察DNJ對糖尿病的抑制作用。主要的研究結果如下：(1) 建立的檢測方法其最佳條件是：硼酸鹽緩沖液pH值為850，流動相(乙腈和01醋酸混合液)配比為55：45，此條件下峰的分離效果和峰型最佳。(2)檢測132種樣品和5個不同時位的中DNJ含量所得標準曲線方程為：Y=10×108x+15328，回歸系數為：R2=O994，線性性顯著；132種樣品中DNJ含量平均值為007511，標準差為0028428，其中竹場2號的DNJ含量最高，為014

46、72；觀音桑的DNJ含量最低，為001 34。5個不同葉位桑葉的DNJ含量不同，隨著桑葉隨著發育成熟，DNJ的含量逐漸降低。(3) 可以得出在乙醇浸泡和超聲波處理后所得桑葉提取物中DNJ含量為12842；在用大孔樹脂去雜純化后DNJ含量達到33452，提高了260倍；用732陽離子交換樹脂進一步純化，選取pH值在9。5011。0之間的洗脫液干燥后提取物中DNJ的含量又提高了37倍可達123873，最后用60100目硅膠純化并用不同比例的石油醚甲醇混合液進行梯度洗脫最終可將干燥提取中DNJ含量提高到l 90857。(4) 食用低劑量DNJ(20mgkg)的糖尿病小鼠(DLD)和食用中劑量DNJ(

47、30mgkg)的糖尿病小鼠(DMD)血糖降低效果不顯著；食用高劑量DNJ(40mgkg)的糖尿病小鼠(DHD)和食用中劑量阿卡波糖(30mgkg)的糖尿病小鼠(DA)在第33天和第40天血糖效果的效果已經顯著且DHD效果是高于DA的；與空白對照組比較發現DNJ對健康小鼠的血糖沒有負面影響。2展望蠶桑起源于我國，目前桑葉主要作為養蠶的飼料，桑葉含有的DNJ等功能成分具有非常重要的生理功能，因此，開發桑葉的食用價值和藥用價值非常具有意義。DNJ已經被證明有很多活性比如：可以抑制葡萄糖苷酶、葡萄糖淀粉酶和腫瘤轉移，還可以抗病毒、減肥和增加胰島素敏感性的等，相信它一定還有更多有重大意義的作用。所以還有

48、以下的研究方向值得我們去注意：(1)研究一種不需要昂貴設備比如制備型高效液相設備，而又能將DNJ的純度提高到90以上的方法。(2) 研究DNJ在抗衰老方面的生理活性，從而為延長人類壽命的事業做貢獻。(3) 研究DNJ促進腫瘤細胞凋亡的作用，以此來和人類的大敵癌癥相抗爭。(4) 研究DNJ對血脂的的降低作用，看是否可以用來治療心血管疾病。6.1.5 1脫氧野尻霉素合成路線的工藝優化 現在研究表明，1-脫氧野尻霉素（DNJ）屬于強效-葡萄糖苷酶抑制劑，DNJ通過對二糖類分解酶活性產生抑制作用，從而抑制小腸對雙糖的吸收，降低食后血糖的高峰值。DNJ吸收優于阿卡波糖；抑制人體糖分的轉化，降低空腹血糖和

49、餐后血糖水平優于磺脲類藥物而發生低血糖和其它副作用的可能性大大低于其它藥物，安全性好，可不改變飲食結構。脫氧野尻霉素是目前糖尿病治療市場上唯一的國際公認的零傷害生物制劑。 德國Bayer公司以1-脫氧野尻霉素為模板開發出第一個亞氨基糖類藥物：N-羥乙基-1-脫氧野尻霉素（米格列醇），用于非胰島素依賴型（II型）糖尿病，減少復合糖消化率，從而控制餐后葡萄糖吸收、防止血糖升高、米格列醇與1998年7月率先在德國獲準，而后又在美國和歐盟各國、日本等注冊或上市，我國有進口，并已有仿制產品獲準上市。英國牛津大學和Oxford Glycoscience 公司在1-脫氧野尻霉素的基礎上合成了N-丁基-1-脫

50、氧野尻霉素（米格魯特）。它是一種糖類轉移酶抑制劑，口服有效，2003年3月率先在英國獲準，用于治療糖脂儲存疾病（如不宜以酶替代法治療的輕到中度I型高雪病）。其作用機理在于通過抑制參與鞘磷脂糖基化的一種酶，減少可能引起高雪病的神經組織細胞內糖脂過度儲存。它在美國和歐盟多國上市或注冊。另外將其用于尼曼-匹克氏癥、戴薩克斯癥處于III期臨床，用于菲比氏病則處于II期臨床試驗階段。本研究以甲基-D-吡喃葡糖苷(methyl -D-glucopyrauoside)為起始反應原料，設計了一條合成1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)的工藝路線，然后根據這條工藝路線，以適應工業化大

51、生產為標準，對其進行了優化，并在實驗室條件下進行小試實驗對優化工藝的可行性進行驗證。而后，在實驗室小試實驗取得成功的基礎上，對該優化工藝進行了中試放大試驗，探索其工業化生產的可行性，結果如下：1、 通過調研文獻，研究反應，設計了一條合成1脫氧野尻霉素的工藝路線。這條工藝路線以甲基-D-吡喃葡糖苷為起始反應原料，經過芐基保護，脫甲基反應，開環形成雙醇，通過Pfitzaer-Moffatt氧化反應形成雙羰基后再進行醛酮還原胺化反應關環，脫芐基保護等五步反應最后制得目標產物。然后通過實驗室小試來對該設計路線的可行性進行實驗驗證，并取得了成功。小試投料776g，經過五步反應，最后得到679g目標產物D

52、NJ，總收率為294，各步收率分別為75，65，985，72和85。2、 通過實驗室小試實驗，驗證了該反應路線的可行性之后，本研究以能夠進行工業化生產為標準對該條路線進行了工藝優化。優化內容有：驗證了工藝中第一步反應生成的芐基醚副產對于第二步的反應沒有影響，因而可以簡化反應的后處理步驟；優化了原工藝中第二，四，五步反應的溶劑體系；將原工藝里的催化劑LiAlH4，改變為NaBH4；將原工藝里第五步反應在工業化生產中操作比較困難的使用液氨和金屬鋰的反應條件，改變為使用Pd(OH)2和H2進行脫芐基保護。然后對優化后的工藝路線可行性進行了實驗室小試驗證，并取得了成功。小試投料195g，經過五步反應，

53、最后得到74g目標產物DNJ，總收率為798，各步收率分別為65，52，902，35和748。3、 根據優化后的工藝路線進行了兩批中試放大試驗，進一步驗證該優化路線的工業化生產可行性。兩批中試試驗均投料20kg，經過反應，分別得到目標產物067kg和163kg，總收率分別為803和795，平均收率為799，與實驗室小試收率相似。同時，兩批中試試驗所得到的產品能夠達到100的純度，驗證了優化工藝的可行性與穩定性。通過兩批中試放大試驗的結果可以看出，這條優化后的工藝，實驗設計合理，反應條件適合，具備工業化生產的條件。程鳳銀【14】報道稱桑葉中抗糖尿病活性成分主要是桑葉多糖(TPM)、總生物堿以及總黃酮，這三類活性成分可通過抑制一糖苷酶活性、促進胰島素釋放、促進外周組織對糖的利用、增加糖尿病動物肝糖原含量而起到降血糖作用，且桑葉總黃酮可阻斷蛋白非酶糖化，對減緩或阻止糖尿病并發癥發展具有重要意義。 自從哌啶烷類多羥基生物堿被發現以后，由于其與吡喃糖極其相似的結構，使人們對多羥基生物堿的生理活性產生了濃厚的興趣。研究發現大部分的多羥基生物堿都可以有效的抑制糖苷酶和糖基轉移酶，與此相關的疾病有癌癥、糖尿病、艾滋病(H)等。人們通過研究多羥基生物堿中的相關機理，發現一些新藥來治療這些嚴重危害人類健康的疾病