1、SD大鼠主動脈瓣間質細胞自發鈣化模型的建立及阿托伐他汀和 氨氯地平的影響 鈣化性主動脈瓣疾病是一個慢性進展性疾病 , 包括早期的主動脈瓣硬化 (aortic sclerosis, ASc)和晚期的鈣化性主動脈瓣狹窄 (calcific aortic valve stenosis, CAS)。在歐、美等發達國家,CAS己成為成人最常見的心臟瓣膜病； 且患者一旦出現臨床癥狀，預后較差。隨著研究的深入,對CAS的認識逐漸從“與 年齡相關的退行性過程”過渡到認為其是“主動調節的慢性炎癥過程” 。臨床來源的的主動脈瓣標本數量有限 , 且鈣化較嚴重；用豬、兔等建立的動 物模型 , 耗時較長且較繁瑣 , 故

2、建立有效的體外疾病模型顯得尤為重要。 主動脈瓣 間質細胞(aortic valve interstitial cells,AVICs)在CAS發生發展中起重要作用。目前用于CAS研究的AVICs多來源于豬，但由于缺乏相應一抗，使研究受限。在有關CAS的體外研究中，多通過不同種類或濃度的鈣化誘導劑或刺激因子 誘導AVICs鈣化，這使得試驗間結論的可比性較差。SD大鼠是一種常用的實驗動 物，具有體積小、易飼養、易購買等優點。目前以SD大鼠為研究對象對CAS進行 的研究較少,可能與大鼠主動脈瓣較小 ,不易分離培養有關。本研究欲分離培養SD大鼠AVICs,并觀察其在未給予鈣化誘導劑或刺激因子 的情況下

3、,隨著培養時間的延長是否自發形成鈣化灶；并檢測鈣化過程中鈣化相 關因子的表達情況 ,同時觀察阿托伐他汀及氨氯地平對自發鈣化的影響。第一部 分SD大鼠主動脈瓣間質細胞分離培養目的：建立快速有效的SD大鼠AVICs體外 培養方法。方法：通過組織塊法分離培養 SD大鼠AVICs,觀察細胞原代及傳代后 生長特性；并通過IF染色方法檢測a-SMA及vimentin表達情況；通過SEM和TEM對細胞表面和內部結構進行觀察。結果：1原代培養 2-3 天后, 部分組織塊周邊有細胞爬出 ,呈梭形、三角形或不規則形；原代培養78天后,細胞可達到7080%融合,進行傳代。2AVICS經IF檢測陽性，即SD大鼠AVI

4、Cs表達a-SMA及 vimentin 。3經SEM僉測可見,細胞 貼壁良好 , 多邊形 , 體積較大 , 細胞膜較薄且充分伸展。4經TEM檢測可見，細胞體積較大，不規則形，可見絨毛；胞內細胞器豐富，可 見大量擴張的粗面內質網及與細胞長軸平行的肌絲；細胞核不規則 , 可見核仁。 結論：1通過組織塊法對SD大鼠AVICs進行培養,方法簡單快速。2經過形態學、 細胞免疫學鑒定,SD大鼠AVICs為肌成纖維細胞。第二部分SD大鼠主動脈瓣間質細胞自發鈣化模型的建立目的：觀察體外分 離培養的SD大鼠AVICs是否可以自發形成鈣化灶。方法：通過組織塊法分離培 養SD大鼠AVICs,對不同培養時間的AVIC

5、s進行Von Kossa及茜素紅染色、細胞 內及其間質鈣離子檢測 , '評價其是否可以自發形成鈣化灶。 結果： 1 培養至 4 6天時,AVICs逐漸聚集成團,稱為“細胞灶”，此時細胞灶較小,散在分布；隨著 培養時間的延長 , 細胞灶體積逐漸增加 , 中心區亮度增加。2VonKossa染色顯示,6天時細胞灶染色陽性，即細胞灶處有鈣鹽沉積；并且 12天時陽性細胞灶個數及強度均大于 6天組。 3茜素紅染色顯示 ,6 天時細胞灶 染色陽性 ,即細胞灶處有鈣鹽沉積； 并且 12天時陽性細胞灶個數及強度均大于 6 天級。經統計分析顯示 , 茜素紅含量組間有統計學差異 (F106.167,P&am

6、p;lt;0.001),0 天及 6天組茜素紅含量較低 ,12 天組茜素紅含量較高 , 即隨著培養時間的增加鈣 鹽沉積增加。4 細胞及間質鈣含量經統計分析顯示 , 鈣離子含量組間有統計學差異 (F116.379,P<0.001),0 天及6天組鈣離子含量較低 ,12 天組鈣離子含量較高 ,即隨著培養時間的增加鈣鹽沉積增加。 結論：通過延長細胞培養時間能夠誘導其 自發形成鈣化灶。第三部分SD大鼠主動脈瓣間質細胞自發鈣化模型的機制研究目的：檢測 AVICs 在自發鈣化過程中某些成骨相關基因的表達情況。方法：通過組織塊法分離培養 SD大鼠AVICs,用RT-PCF和western-bl

7、ot 方法，檢測不同培養時間細胞的 ALP活性、成骨相關因子(a-SMA、Cbfal、Osteocalcin、ALP BMP-2 BMP-4) mRN股蛋白表達情況。結果：1ALP活性檢測結果表明,0天、6天、12天組ALP活性有統計學差異(x2=139.396,P<0.001),12天組ALP活性最低,0天組ALP活性較高,6天組ALP活性最高，即隨著培養時間的增加，ALP活性從0天開始逐漸升高，至第6天達峰，之后逐漸下降。 2Cbfal mRN、AOsteocalcin mRN、ABMP-4mRN、 ALPmRN、ABMP-2mRN、A a -SMA mRNA RT-PC檢測

8、結果 2.1Cbfal mRNA、Osteocalcin mRNA、BMP-4mRNA RT-PCF結果表明,0 天、6 天、12 天組 Cbfal mRNAOsteocalcin mRNABMP-4mRNA 表達水平有統計學差異 (F=410.106, x 2=7.200,F=38.463,P<0.005),0 天組 最低,6 天組較高,12 天組最高, 即隨著培養時間的增力 (?)Cbfal mRNA、Osteocalcin mRNA、BMP-4mRN表達水平逐漸增高。2.2ALP mRNART-PCR結果表明,0天、6天、12天組ALP mRN表達水平有統 計學差異 (x

9、2=7.200,P=0.027),0 天最低,12 天較高,6 天最高, 即隨著培養時間 的增加,ALP mRNA勺表達水平先增加后下降。2.3BMP-2mRNA RT-PC吉果表明,0 天、6天、12天組BMP-2mRN表達水平有統計學差異(F=56.565,P<0.001),0 天組較低,6天組和12天組較高，即隨著培養時間的增加，BMP-2mRN的表達水平 逐漸增加。2.4a-SMA mRNA RT-PC結果表明,0天、6天、12天組a-SMA mRNA表達水平有統計學差異 (F=89.886,P<0.001),12 天最低,6 天較高,0 天最高隨著培養時間

10、的增加a-SMA mRN的表達水平逐漸下降。3ALP BMP-2BMP-4western-blot 結果 3.1ALP western-blot 結果表明 ,0 天、6 天、12 天組ALP蛋白表達水平有統計學差異(x 2=7.261,P=0.027),0天組最低,12天組較 高,6天組最高，即隨著培養時間的增加，ALP蛋白表達先增高后降低。3.2BMP-2、 BMP-4western-blot結果表明,0天、6天、12天組BMP-2 BMP-4蛋白表達水平 有統計學差異 (x2=7.200,F=452.482,P<0,05),0 天組最低,6 天組較高,12 天 組最高,即隨著

11、培養時間的增加BMP-2 BMP-4蛋白表達逐漸增高。結論：AVICs向成骨細胞表型轉化可能是自發鈣化模型形成的細胞學基礎。 第四部分阿托伐他汀和氨氯地平對 SD大鼠主動脈瓣間質細胞自發鈣化的影響目 的：觀察阿托伐他汀和氨氯地平對 SD大鼠AVICs自發鈣化的影響。方法：采用 組織塊法分離培養SD大鼠AVICs,檢測不同濃度的阿托伐他汀和氨氯對平對 AVICs自發鈣化程度及ALP活性的變化情況。結果： 1 通過延長培養時間 , 各組均形成直徑大小不同的鈣化灶。 2Ato 和 Aml 對AVICs自發鈣化程度的影響2.1在控制了組別因素的情況下,時間因素在不同 水平有統計學差異：0天和6天較低,

12、12天較高(F=116.379,P<0.001),髓著培養時間的增加各組Ca2+含量均逐漸增高。2.2在控制了時間因素的情況下,組別 間有統計學差異,10-6mol/L Aml組比10-6mol/L Ato 組鈣含量高，兩組間有統計 學差異 (F=3.655,P=0.023), 其他組間均無統計學差異 , 即在相同的培養時間情況 下，除 10-6mol/L Aml 組和 10-6mol Ato 組 Ca2+含量有差別外(10-6mol/L Aml 組Ca2+含量高于10-6mol/L Ato組)，其余各組均無差別。3Ato和Aml對ALP的影響3.1在控制了組別因素的情況下，時間因素在不同水平有統計學差異：12天最低,0天較高,6天最高(F=139.396,P<0.001),即 隨著培養時