1、1植物組織培養培養基201303282上節課小結外植體的選擇1、基因型；2、取材部位；3、取材季節；4、生理狀態發育年齡；5、大小滅菌和外植體的消毒無菌操作技術細節決定成敗，良好操作習慣的養成外植體的褐化及預防外植體的玻璃化及預防3培養基種類和特點 離體培養條件下，不同種植物的組織對培養有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養的要求也不相同，只有滿足了它們滿足了它們各自的特殊要求各自的特殊要求，它們才能很好地生長。因此，沒有一種培養基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養系統時，首先必須找到一合適的培養基，植物組織培養才能成功。4培養基的發展簡史 最早是Sacks（168

2、0）和Knop（1681），他們對綠色植物的成分進行了分析研究，根據植物根據植物從土中主要是吸收無機從土中主要是吸收無機鹽營養，鹽營養，設計出了由無機鹽組成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作為基本的無機鹽培養基得到廣泛應用。5culture mediuml培養基：含有各種被培養生物材料所需要的營養成分的培養基質。l培養基是組織培養中最重要的基質，選擇合適的培養基對培養成功與否關系很大。l培養基有各種種類，不同的植物和培養部位及不同的培養目的需選用不同的培養基。l培養基的名稱，一直根據沿用的習慣。多數以發表人的名字來命名，再加上年號，如White(1943)培養基，Murashing和Sko

3、og(1962)培養基。6培養基的分類 培培 養養 基基 種種 類類完全培養基完全培養基 初代培養基初代培養基繼代培養基繼代培養基 固體培養基固體培養基 液體培養基液體培養基 基本培養基基本培養基 誘導培養基誘導培養基增殖和生根培養基增殖和生根培養基7培養基的分類 根據培養基的無機鹽成分和元素的濃度無機鹽成分和元素的濃度，可將培養基分為以下四類：1. 1. 富鹽平衡培養基：富鹽平衡培養基： MSMS培養基培養基；LS培養基；BL培養基；BM培養基；ER培養基等。2. 2. 高硝態氮培養基：高硝態氮培養基： B5B5培養基培養基；N6培養基；SH培養基等。3. 3. 中鹽培養基：中鹽培養基： M

4、illerMiller培養基培養基；H培養基；Nitsch培養基；Blaydes培養基。4. 4. 低鹽培養基：低鹽培養基： WhiteWhite培養基培養基；WS培養基；HE培養基；改良Nitsch培養基及HB培養基。8常見培養基及特點MSMS培養基培養基：1962年由Murashige和Skoog為煙草細胞而設計的。910MS培養基特點u特點是無機鹽和離子濃度較高（鉀鹽、鐵鹽、硝酸鹽含量均較高），特別是硝酸鹽含量較其他培養基高，離子平衡性好，具有較強的緩沖能力,是一種較穩定的平衡溶液。u微量元素種類齊全，濃度高；培養基營養豐富，在一般的培養中，無需額外加入氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及

5、椰子汁等有機附加成分。u養分的數量和比例較合適，可滿足植物的營養和生理需要。u能加速愈傷組織和培養物生長。廣泛用于植物的器官、花藥、細胞和原生質體培養效果良好。有些培養基是由它演變而來。11MS固體培養基可用來誘導愈傷組織，或用于胚、莖段、莖尖及花藥培養，MS液體培養基用于細胞懸浮培養,都能獲得明顯成功。MS培養基特點12B5培養基 1968年由Galmborg等為培養大豆根細胞而設計的。13較含有較高的硝酸鉀,較低的銨和較高較低的銨和較高VB1VB1，這可能對不少培養物的生長有抑制作用。實踐表明有些植物在B5培養基上生長更適宜，如南洋杉、葡萄及豆科與十字花科植物等的培養。B5培養基的特點高硝

6、態氮培養基五個桑樹品種芽再生的比較14White培養基低鹽培養基 是1943年由White為培養番茄根尖而設計的。1963年又作了改良，稱作White改良培養基，提高了MeSO4的濃度和增加了硼素。 無機鹽量較低；有機成分含量相對也較低。 適合生根培養、胚胎培養等。15SH培養基高硝態氮培養基 特點與B5相似，硫酸銨改用磷酸二氫銨。 無機鹽濃度較高。 16WPM培養基WPM(Woody Plant Medium)17N6培養基高硝態氮培養基是1975年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養而設計的,獲國家發明二等獎。在國內已廣泛應用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養基花藥培養基和其他組織培養。主要特

7、點： 成分簡單； 硝酸鉀和硫酸銨含量高； 適合花粉、花藥培養。18 KM-8P培養基 有機成分復雜，包括了所有單糖和維生素，呼吸代謝中的主要有機酸； 主要用于原生質體培養原生質體培養(包括原生質融合的培養)。1920培養基的組成成分培養基的成分培養基的成分 植物激素植物激素 無機鹽無機鹽 有機物有機物 培養體支持材料培養體支持材料 輔助物質輔助物質 水 分 21一、水培養基大部分是水，配制培養基時一般用三級水三級水(水中不含或少含某些離子)，保證培養基中成分完全人為控制。 水的作用 1.水是細胞原生質的主要組成成分； 2.水是重要代謝過程的反應物質和產物； 3.細胞分裂及伸長都需要水分； 4.

8、水是植物物質吸收和運輸及生化反應的良好溶劑； 5.水能使植物保持固有姿態，有利于光合作用和傳粉； 6.調節植物體周圍的溫、濕度，維持植物體溫穩定。 總之，水是植物原生質體的組成成分，是一切代謝過程的介質和溶液，是生命活動過程中不可缺少的物質。22二、無機鹽大量元素大量元素：N，P，K，Ca，Mg，S等元素。 以鹽的形式加在培養基中，它們對植物細胞和組織的生長都是必不可少的，需要量大于大于0.5mmol/L0.5mmol/L。其中特別說明的是：培養基中無機氮的供應可以有兩種形式，一種是硝酸鹽；另一種是銨鹽。微量元素微量元素：Fe，Mn，Zn，B，Cu，Co，I等。 對于植物細胞和組織的生長需要量

9、小于小于0.5mmol/L0.5mmol/L，但必不可少，其中Fe較為關鍵，以螯合形式提供，可使用FeSO4.7H2O和Na2-EDTA進行制備。23大量元素的功能（1）N 是蛋白質、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分。是生命不可缺少是生命不可缺少的物質。的物質。在制備培養基時以NO3N和NH4N兩種形式供應。大多數培養基既含有NO3N又含有NH4N，NH4N對植物生長較為有利，供應的物質有KNO3、NH4NO3等。也添加氨基酸來補充氮素。24（2）P 是磷脂的主要成分，而磷脂又是原生質、細胞核的重要組成部分。磷也是ATP、ADP等的組成成分。在植物培養過程中，向培養基內添加磷

10、、不僅增加養分、提供能量，而且也促進增加養分、提供能量，而且也促進對對N N的吸收，增加蛋白質在植物體中的積累的吸收，增加蛋白質在植物體中的積累。常用的物質有KH2PO4或NaH2PO4等。大量元素的功能25（3）K 對碳水化合物合成、轉移、以及氮素代謝等密切關系。K增加時，蛋白質合成增加，維管束、纖維組織發達，對胚的分化有促進作用。對胚的分化有促進作用。但濃度不易過大，一般為13mg/L為好。制備培養基時，常以KCL、KNO3等鹽類提供。大量元素的功能26（4）Mg、S和CauMg是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；uS是氨基酸和蛋白質的組成成分。它們常以MgSO47H2O提供。用量為1-

11、3mg/l較為適宜；uCa是構成細胞壁的一種成分，Ca對細胞分裂、保護質膜不受破壞有顯著作用，常以CaCl2H2O提供。大量元素的功能27微量元素的功能u鐵是一些氧化酶、細胞色素氧化酶、過氧化氫等酶的組成成分。同時，它又是葉綠素形成的必要條件。培養基中鐵對胚的形成、芽的分化和幼苗轉綠有促進作用。在制作培養基時不用FeSO4和FeCl3（因其在PH值5.2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀），而使用FeSO47H2O和Na-EDTA的結合成的結合物。uB，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物組織培養中不可缺少的元素，缺少這些物質會導致生長、發育異常現象。28三、有機物有機化合物（orga

12、nic compound）培養基中只含有大量元素與微量元素，常稱為基本培養基（basic medium）。為不同的培養目的往往要加入一些有機物以利于快速生長。常加入的的有機成分要以下幾類： 維生素維生素 肌肌 醇醇 氨基酸天然復合物天然復合物 碳水化合物碳水化合物 29碳水化合物最常用的碳源是蔗糖、葡萄糖和果糖，可支持許多組織很好生長。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養中也有應用。蔗糖使用濃度在2%3%，常用3%，即配制一升培養基稱取30g蔗糖，有時可用2.5%。但在胚培養時采用4%15%的高濃度，因蔗糖對胚狀體的發育蔗糖對胚狀體的發育起重要作用。不同糖類對生長的影響不同。從各種糖對水稻根

13、培養的影響來看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相當，麥芽糖差一些。不同植物不同組織的糖類需要量也不同，實驗時要根據配方規定按量稱取，不能任意取量。高壓滅菌時，一部分糖會發生分解，制訂配方時要給予考慮。在大規模生產時，可用食用的棉白糖代替。30維生素（vitamin） 這類化合物在植物細胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促進作用。雖然大多數的植物細胞在培養基中都能合成所必須的維生素，但在數量上還明顯不足，通常需要加入一至數種維生素，以便獲得最良好的生長。主要有VB(鹽酸硫胺素) 、VB6(鹽酸吡多醇)、VPP(煙酸)、VC(抗壞血酸)，有時還使用生物素、葉酸、VB1

14、2等。一般用量為0.11.0mg/L。有時用量較高。VB1對愈傷組織的產生和生活力有重要作用，VB6能促進根的生長，VPP與植物代謝和胚的發育有一定關系。VC有防止組織變褐的作用。31肌醇（myoinosltol）又叫環己六醇，在糖類的轉化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖轉化而成，還可進一步生成果膠物質，用于構建細胞壁。肌醇與6分子磷酸殘基相結合形成植酸，植酸與鈣、鎂等陽離子結合成植酸鈣鎂，植酸可進一步形成磷脂，參與細胞膜的構建。使用濃度一般為100mg/L，適當使用肌醇，能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。32天然復合物 天然

15、復合物的成分比較復雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復雜化合物。它對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用，它對器官的分化作用不明顯。它的成分大多不清楚，所以一般應盡量避免使用。33氨基酸 是很好的有機氮源，可直接被細胞利用。培養基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有時應用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它們是牛乳用酶法等加工的水解物，是含有20種氨基酸的混合物，用量在10-100mg/L之間。由于它們營養豐富，極易引起污染。如在培養中無特別需要，以不用為宜。34四、植物激素1）生長素類（auxin）：生長素主要被用于誘導愈傷組織形成，誘導根的

16、分化和促進細胞分裂、伸長生長。天然的生長素熱穩定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內也易受體內酶的分解，組織培養中常用人工合成的生長素類物質。2）細胞分裂素類（cytokinin）：這類激素是腺嘌呤的衍生物，多用于誘導不定芽的分化和莖、苗的增殖，而在生根培養中使用較少或用量較低。353）GA（gibberellic acid 赤霉素）： 有二十多種，組織培養中常添加的是GA3。它主要是促進幼苗莖的伸長生長，促進不定胚發育成小植株；赤霉素和生長素協同作用，對形成層的分化有影響，當生長素/赤霉素比值高時有利于木質部分化，比值低時有利于韌皮部分化；此外，赤霉素還用于打破休眠打破休眠，促進種子

17、、塊莖、鱗莖等提前萌發。 一般在器官形成后，添加赤霉素可促進器官或添加赤霉素可促進器官或胚狀體的生長。胚狀體的生長。36五、輔助物質抗生素（antibiotic） 添加抗生素可防止菌類污染，減少培養中材料的損失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丟棄成百上千瓶的培養物，采用適當的抗生素便可節約人力、物力和時間； 抗生素各有其抗菌譜，要選擇加以利用，也可兩種抗生素混用； 應當注意抗生素對植物組織的生長也有抑制作用； 不能因添加抗生素，而放松滅菌措施； 此外，在停止抗生素使用后，往往污染率顯著上升，這可能是原來受抑制的菌類又滋生起來。37活性碳（Active carbon） 活性炭為木炭粉碎經加工形成的

18、粉末結構，它結構疏它結構疏松，孔隙大，吸水力強，有很強的吸附作用。松，孔隙大，吸水力強，有很強的吸附作用。 它的顆粒大小決定著吸附能力、粒度越小，吸附力越強；溫度低吸附力強，溫度高吸附力弱，甚至解吸附。 它可以吸附非極性物質和色素等大分子物質，包括瓊脂中所含的雜質，培養物分泌的酚、琨類物質以及蔗糖在高壓消毒只產生的5-羥甲基糖醛，極少量的活性炭就可以完全吸附培養基的激素。 活性炭加入會削弱瓊脂的凝固能力，因此要多加一些瓊脂。活性炭易沉淀，通常在瓊脂凝固之前，要輕輕搖動培養瓶。 因此，在使用時不能隨意添加，要有量的意識，物盡其用。38六、培養體支持材料 瓊脂（agar）：在固體培養時瓊脂是最好的

19、固化劑。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40C即凝固為固體溶膠。通常所說的“煮化”培養基，就是使瓊脂溶解于90C以上的熱水。瓊脂的用量在6-10g/L之間，若濃度太高，培養基就會變得很硬，營養物質難以擴散到培養的組織中去。若濃度太低，凝固性不好。 顏色淺、透明度好、潔凈的為上品瓊脂。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關外，還與高壓滅菌時的溫度、時間、PH值等因素有關。長時間的高溫會使凝固力下降，過酸過堿會加之高溫會使瓊脂發生水解，喪失凝固力。時間過久，瓊脂變褐，也會逐漸喪失凝固能力。39第二節、培養基母液的配制和保存 經

20、常配制培養基時，為減少工作量，減少稱量的誤差，一般配成比所需濃度高10100倍的母液，用時可按比例稀釋。 配好的母液需要貯存于2-4的冰箱中，定期檢查有無沉淀和微生物污染，如果出現沉淀或微生物污染，則不能使用。40母液配制流程圖確定培養基確定培養基稱量稱量計算計算溶解溶解分裝分裝定容定容貼標簽貼標簽保存保存41母液成分規定量（mg）擴大倍數稱取量（mg）母液體積（ml）配1L培養基吸取量編號種類1大量元素KNO3190010190001000ml100mlNH4NO316501016500MgSO4.7H2O370103700KH2PO4170101700CaCl2.2H2O440104400

21、2微量元素MnSO4.4H2O22.310022301000ml10mlZnSO4.7H2O8.6100860H3BO36.2100620KI0.8310083Na2MoO4.2H2O0.2510025CuSO4.5H2O0.0251002.5CoCl2.6H2O0.0251002.53鐵鹽Na2-EDTA37.310037301000ml10mlFeSO4.7H2O27.810027804有機物甘氨酸2.050100500 ml10ml鹽酸硫胺素0.1505鹽酸吡哆醇0.55025煙 酸0.55025肌 醇10050500042母液配制視頻43培養基配制流程量取母液量取母液 調調pHpH值值

22、 加入蔗糖加入蔗糖/ /激激素素 滅菌滅菌加瓊脂/活性炭分裝分裝 定容定容加抗生素/激素確定配方確定配方分裝備用分裝備用 44 當培養基配制好以后，應隨即進行pH值的調整。最好用酸度計測試，既快又準，也可用精密pH試紙(應在干燥器中保存)，培養基pH值調整可用1mol/L HCl或1mol /LNaOH。經高壓蒸汽滅菌后，由于某些成分的分解，如蔗糖的分解或氧化，酸度會增加，即pH值可降低0.2。因此在實際操作中，經常在滅菌前將培養基的pH調節至比所需pH高0.2個單位。 培養基的pH值(培養基的酸堿度)，直接影響到培養物對離子的吸收，所以過酸或過堿都對植物材料的生長有很大影響，此外，瓊脂培養基

23、的pH值還影響到凝固情況。一般來說，當pH值高于6.0時，培養基將會變硬；低于5.0時，瓊脂不能很好的凝固。pH值的調整45培養基配制視頻46培養基的選擇 首先查找文獻，找出同種或近源種外植體組織培養所用的培養基。成熟的培養基無相關報道有種內或種間報道47植物再生能力的種間差異Morus alba L. White Mulberry (E Asia)Morus australis Poir. Chinese Mulberry (SE Asia)Morus celtidifolia Kunth (Mexico)Morus insignis (S America)Morus mesozygia S

24、tapf African Mulberry (S and C Africa)Morus microphylla Texas Mulberry (Mexico, Texas (USA)Morus nigra L. Black Mulberry (SW Asia)Morus rubra L. Red Mulberry (EN America)Morus notabilis 48Morus indica cv. K2 49201304255051建立新培養基的原則 在建立一個新的實驗體系時，為了能研制出一種適合的培養基，最好先由一種已被廣泛使用的基本培養基(如Ms培養基或B5培養基)開始。當通過一系

25、列的實驗，對這種培養基做了某些定性和定量的小變動之后，即有可能得到一種能滿足實驗需要的新培養基，選擇最佳培養基。常用試驗方法主要有單因子試驗、多因子試驗單因子試驗、多因子試驗及廣譜實驗及廣譜實驗等。 52一、單因子試驗 在單因子試驗中由于培養基中其他成分都維持在一般水平上，所以只變動一個因子，就可以找出這一因子對試驗的影響和影響的程度。例如MS基本培養基的其他成分和用量都不變，只變動NAA用量對某一培養物生根的影響，這種只研究一個因素的試驗就是單因子試驗。 生物學試驗不同于物理學或化學試驗，最顯著的差別是在生物學試驗中必需設置對照組與試驗組，試驗組可以有一組或幾組，隨試驗的復雜性而設置，對照組

26、也可能有一組以上。53 試驗中要求對照組與試驗組中的試驗個體，即植物組織塊或其他培養物，必須在遺傳性、生理狀態、前培養條件等方面，盡可能完全一致。以保證試驗結果是來源于試驗因子，而不是由于試驗材料的不一致導致的。 試驗中各處理一般都要設有一定的重復，以取得可靠的試驗結果。隨試驗規模和要求不同，大多每個項目要有410瓶，每瓶至少3塊培養物或3叢小幼苗。54 二、多因子試驗二、多因子試驗 對培養基中兩個或兩個以上因素進行研究的試驗稱為多因子實驗，試驗可采用完全試驗方案，也可選用正交設計方案，完全試驗方案具有均衡完全的特點，各個因子的每個水平都相互搭配，構成了所有可能的處理組合，如研究NAA和6BA

27、的最佳濃度組合，每個因子各設5個濃度水平(0，0.5，2.5，5，10mgL)，這兩種因子各種濃度的所有組合，就構成了一個具有25項處理的試驗,如下表：552 2種激素種激素5 5種水平的實驗組合種水平的實驗組合6-BA（mg/L） 0 0.5 2.5 5 1 0NAA 0 1 2 3 4 5(mg/L) 0.5 6 7 8 9 10 2.5 11 12 13 14 15 5 16 17 18 19 20 10 21 22 23 24 25 5657現實與理論的沖突58正交實驗的概念596061 完全試驗方案試驗因子越多，處理數越多，試驗越復雜，消耗的精力、物力越多。為了減少試驗處理，但又能準

28、確全面地獲得試驗信息，通常采用正交試驗。例如，采用正交設計，在使用此表時就可以安排4個因子，3種水平的試驗，一共做9種不同搭配的試驗，其結果相當于做了2727次種種搭配的試驗。正交試驗雖然是多因素搭配在一起的試驗，但是在試驗結果的分析中，每一種因素所起的作用卻又能夠明白無誤地表現出來。因此，一次系統的試驗結果，就可以把問題分析得清清楚楚，用有限的時間取得成倍的收獲。在組織培養研究中，可用于同時探求培養基中適宜的幾種成分的用量，如細胞分裂素、生長素、糖和其他成分的用量。626364三、逐步添加和逐步排除的試驗方法 在植物組織分化與再生的研究中，在沒有取得可靠的分化與再生之前，往往添加各種有機營養

29、成分，而在取得了穩定的再生之后，就可以逐步減少這些成分。在逐步添加時是使試驗成功，在逐步減少時是縮小范圍，以便找到最有影響力的因子，或是為了實用上的需要竭力使培養基簡化，以降低成本和利于推廣。在尋求最佳激素配比時，也經常用到這種加加減減的簡單方法。 65四、廣譜實驗法在廣譜實驗法中，把培養基中所有組分分為4大類：無機鹽有機營養物質(蔗糖、氨基酸和肌醇等)生長素細胞分裂素 66 對每一類物質選定低(L)、中(M)、和高(H)3個濃度,4類物質各3種濃度的自由組合即構成了一項包括81個處理的實驗。在這81個處理中最好的一個可用4個字母表示,例如，一個包含中等濃度無機鹽，低等濃度生長素、中等濃度細胞

30、分裂素和高等濃度有機營養物質的處理即可表示為MLMH。達到這個階段，再試用不同類型的生長素和細胞分裂素即可找到培養基的最佳配方。這是因為不同類型的生長素和細胞分裂素對不同植物的活性有所不同。 67思考與練習如何配制MS培養基母液？配制培養基有哪些流程，哪些地方需要特別注意？如何篩選理想的培養基配方？12368培養基的選擇 在建立一個新的實驗體系時，為了能研制出一種適合的培養基，最好先由一種已被廣泛使用的基本培養基(如Ms培養基或B5培養基)開始。當通過一系列的實驗，對這種培養基做了某些定性和定量的小變動之后，即有可能得到一種能滿足實驗需要的新培養基，選擇最佳培養基。常用試驗方法主要有單因子試驗

31、、多因子試驗及廣譜實驗等。 69一、單因子試驗 在單因子試驗中由于培養基中其他成分都維持在一般水平上，所以只變動一個因子，就可以找出這一因子對試驗的影響和影響的程度。例如Ms基本培養基的其他成分和用量都不變，只變動NAA用量對某一培養物生根的影響，這種只研究一個因素的試驗就是單因子試驗。 生物學試驗不同于物理學或化學試驗，最顯著的差別是在生物學試驗中必需設置對照組與試驗組，試驗組可以有一組或幾組，隨試驗的復雜性而設置，對照組也可能有一組以上。70 試驗中要求對照組與試驗組中的試驗個體，即植物組織塊或其他培養物，必須在遺傳性、生理狀態、前培養條件等方面，盡可能完全一致。以保證試驗結果是來源于試驗因子，而不是由于試驗材料的不一致導致的。 試驗中各處理一般都要設有一定的重復，以取得可靠的試驗結果。隨試驗規模和要求不同，大多每個項目要有410瓶，每瓶至少3塊培養物或3叢小幼苗。71 二、多因子試驗二、多因子試驗 對培養基中兩個或兩個以上因素進行研究的試驗稱為多因子實驗，試驗可采用完全試驗方案，也可選用正交設計方案，完全試驗方案具有均衡完全的特點，各個因子的每個水