1、菌種傳代和保育1 目的 規范試驗用菌種的管理制度，保證菌種正常保存和傳代。2 范圍適用于廣州中大醫療器械有限公司質管部使用的菌種。3 責任 質檢部主管、經理、質檢員。4相關文件或表單菌種使用記錄 菌種卡片菌種檢查記錄菌種確認試驗記錄5 定義工作菌種：應用于日常實驗中的菌種，如培養基靈敏度檢查、驗證實驗等。傳代菌種：只用于菌種的接種和傳代、保存的菌種。6菌種的管理6.1 菌種的購買和接收可選購買方：廣東省微生物菌種保藏中心、廣東環凱微生物科技有限公司。購買的原始菌種管就是玻璃安瓿裝的凍干菌，接收同時應檢查是否有隨菌種附有的相關資料，包括菌種名稱、編號等。接收菌種時應檢查安瓿的完整性。在相應的菌種

2、接收記錄上記上關于菌種的所有信息，如名稱、數量和接收日期等。在菌種安瓿及菌種管上粘貼標簽，標明菌種名稱、編號、代次、接收日期、接收人、貯存條件、效期。6.2菌種的編號將菌種接種至一新鮮培養基上，每萌發一次即稱為一代，因此，當原始菌種復溫并轉至新培養基內生長，即認為已傳代一次。從菌種保藏中心獲得的凍干菌菌種為第0代，凍干菌菌種開啟轉種后為第1代。每次接種傳代，每支保存菌種需標明菌名、統一編號、傳代次數、接種日期、有效期。購進菌種若購進時有編號，延用原編號，于原編號前加菌種名稱前兩位漢字；若無，用購進日期代替（例：2012年4月9日購進無編號的大腸桿菌菌種，自編號為:大腸120409） 。傳代編號

3、包括原菌種號傳代支數順序號，每傳一代，在原先的菌種編號增加一個傳代號，菌種分為傳代菌種和工作菌種。每次接種傳代一般6支，傳代菌種1支，為編號1；工作菌種5支，如用量較大的菌種，可適量增加其傳代的數量。6.3菌種選用金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B)26003大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC(B)44102白色念珠菌（Candida albicans）CMCC(F)98001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC(F)98003銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC(B)10104生孢梭菌（

4、Clostridium sporogenes）CMCC(B)649416.4菌種保藏方法保藏方法大致可分為以下幾種：6.4.1 傳代培養保藏法有斜面培養、穿刺培養、皰肉培養基培養等（后者作保藏厭氧細菌用），培養后于46冰箱內保存。6.4.2 液體石蠟覆蓋保藏法是傳代培養的變相方法，能夠適當延長保藏時間，它是在斜面培養物和穿刺培養物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養基水分蒸發而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進入，以減弱代謝作用。6.4.3 載體保藏法是將微生物吸附在適當的載體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應用相當廣泛。6.4.4 冷凍保藏

5、法可分低溫冰箱（-20-30，-50-80）、干冰酒精快速凍結（約-70）和液氮（-196）等保藏法。6.4.5 冷凍干燥保藏法先使微生物在極低溫度（-70左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現象除去水分（真空干燥）。 備注：有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護劑來制備細胞懸液，以防止因冷凍或水分不斷升華對細胞的損害。保護性溶質可通過氫和離子鍵對水和細胞所產生的親和力來穩定細胞成分的構型。保護劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等。根據保藏方法的易操作性和經濟成本，下面重點介紹斜面培養保藏發和液體石蠟覆蓋保藏法6.4.6菌種保藏分四個階段：挑選特征典型的純菌菌落；確

6、定保藏的合適菌體形態，孢子和芽胞代謝作用較弱，同時對惡劣環境有很強的抵抗力，因此對凡是能產生孢子或芽胞的微生物都用孢子和芽胞進行保藏；選擇最適宜的保藏法進行保藏；定期對保藏菌種進行檢查，觀察是否發生變化，若有變化，需改變保藏方法，保藏期滿應及時進行移種。6.5真空冷凍干燥菌種的恢復培養安瓿瓶開封：用浸過75酒精的脫脂棉擦凈安瓿瓶，用火焰加熱其頂端，滴少量無菌水至加熱頂端使之破裂，用銼刀或鑷子敲下已破裂的安瓿瓶頂端。用無菌吸管吸取0.30.5ml適宜的液體培養基，滴入安瓿瓶內，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。吸取全部菌體懸浮液，接種于12支建議的斜面培養基上，并在建議的溫度下培養。菌種活化前，

7、請將安瓿瓶保存在610的環境下。6.6菌種的確認試驗在菌種購買后傳第一代前進行菌種的確認，包括目測菌落生長情況、染色鏡檢和生化試驗,其中，生物試驗可選取12個項目進行試驗。假如在該平板上發現有其他菌落生長，則說明或操作有污染或菌種不純。將此被污染了的培養物滅菌處理?？蓪ふ以蛑匦路蛛x挑選純菌落轉接斜面菌種作為下一代。見附表A：試驗用菌種的確認試驗。6.7 菌種的保藏采用瓊脂斜面低溫保藏法，將經常使用的菌種的典型菌落接種在新鮮的瓊脂斜面（生孢梭菌用庖肉培養基）上，按細菌：溫度35、時間1824小時，真菌：溫度25、時間4872小時，待充分生長后，把培養好的新鮮菌種管用硅膠塞密封好，再用牛皮紙包好

8、，放在46左右的冰箱內保藏。本法適用于經常使用的細菌、酵母菌、放線菌和霉菌保藏。為了延長保藏時間，試驗用細菌可采用菌懸液冷凍保存法。取生長健壯的第3代新鮮斜面菌種，加入23ml營養肉湯培養基，輕輕將菌苔洗下，制成菌懸液或營養肉湯培養菌液，分裝至幾支滅菌小管。保存溫度：20以下冷凍保存。冷凍保存菌融化后，轉種一次，即可使用，其余的菌液廢棄。見附表B：試驗用菌種的保藏條件與時限。采用液體石蠟保藏法，將液體石蠟分裝于三角燒瓶內，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，105kg/cm2>，1213滅菌30分鐘，然后放在40溫箱中，使水汽蒸發掉，備用。將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養基中培養，使得到健壯的

9、菌體或孢子。用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還要長）。法實用而效果好。霉菌、放線菌、芽孢細菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏12年，一般無芽孢細菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37溫箱內，亦可保藏3個月之久。此法的優點是制作簡單，不需特殊設備，且不需經常移種。缺點是保存時必須直立放置，所占位置較大，同時也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養物移種后，接種環在火焰上燒灼時，培養物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應特別注意。6.8每周檢查一次保

10、存菌種的冰箱溫度，并作記錄，每周檢查菌種管的硅膠塞是否松動，菌種外觀及干燥狀態，如有異常應及時處理，并填寫菌種檢查記錄。6.9每次移植培養后，要與原種的編號、名稱逐一核對，確認培養特征和溫度無誤后，再繼續保存。7.0菌種的傳代、接種和使用7.1每株菌種應建立菌種使用及傳代記錄，斜面菌種應根據其特性決定傳代時間間隔。7.2 傳代時使用須核對名稱、編號，傳代代數及日期，所用培養基。7.3 傳代和接種步驟7.3.1 先點燃酒精燈，在火焰旁的上部空間操作，燒灼接種環。7.3.2 再將原有的菌種斜面培養基（簡稱菌種管）與待接種的新鮮斜面培養基（簡稱接種管），持在左手拇指、食指及中指之間，要注意能清楚地觀

11、察到斜面，菌種管在前，接種管在后，應斜持試管呈45°角，使試管內斜面向上，兩試管口平齊，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸濕培養基表面。7.3.3 首先，以右手在火焰旁轉動兩管的硅膠塞，以便接種時易于拔取。再以右手持接種環的柄端，垂直或稍斜地把接種環在火焰上燒灼。頂端的環必須燒紅，以徹底滅菌。環以上凡接種時可進入試管的部分，也應通過火焰燒灼。燒灼時，應把環置于酒精燈的外焰上，因外焰的濃度比內焰高，容易燒紅。7.3.4 使用右手的小指和手掌之間以及無名指與小指之間，在火焰旁分別拔出兩支試管的硅膠塞，持住，再將試管口在火焰上通過，以殺滅管口可能沾污的細菌，但勿燒燙。7.3.5 先將燒灼過

12、的接種環插入菌種管內，先接觸無菌苔生長的培養基土，如有熔印則表明接種環未冷卻能燙死細菌。一定待冷后，再從斜面上挑取菌苔少許，取出時接種環不能通過火焰，應從火焰旁迅速插入接種管，在斜面上輕輕劃線接種。劃線時，一般先由下而上劃一直線后，再由下而上劃曲線。操作過程應迅速，勿使菌苔粘至管壁或管口。7.3.6 當接種完畢，立即將管口通過火焰滅菌，右手到火焰旁塞上硅膠塞，不要將管口離開火焰旁去迎接右手的硅膠塞。最后將接種環燒灼滅菌放置原處，再把可能未塞緊的硅膠塞塞緊，即可進行培養。7.3.7 傳代和接種使用后，應填寫菌種卡片及使用記錄。7.4 控制傳代次數，傳代次數越多，突變的幾率越大，因此要盡量少傳代；

13、根據菌種特性和實際保存情況，一般最多傳代不超過5代，超過此次數應滅活處理，并于菌種檢查記錄上進行記錄。7.5 做完試驗的菌液以及測量完抑菌圈后的培養皿，陽性菌對照廢棄物，要滅活處理。7.6菌種有異常情況或有雜菌生長，則應隨時更代，并可在傳代中，選擇典型菌種作傳代菌種。附表A：試驗用菌種的確認試驗菌種名稱 試驗項目目測鏡檢生化試驗（可選做）大腸埃希菌營養瓊脂斜面上菌苔通常白色，有時帶黃白色，濕潤，閃光，蔓延生長為成對和呈短鏈排列的近球形的桿菌一般不形成莢膜革蘭氏染色為陰性明膠穿刺：不液化明膠靛基質試驗：陽性甲基紅試驗：陽性V.P.試驗：陰性檸檬酸鹽利用試驗：陰性金黃色葡萄球菌營養瓊脂斜面上菌苔生

14、長茂盛，半透明，光滑，平坦，濕潤，白色至淺黃色或橙色為單個或成對呈短鏈和不規則堆團狀排列的球菌，革蘭氏染色為陽性明膠穿刺：呈囊狀液化硝酸鹽還原：陽性過氧化氫酶試驗：陽性銅綠假單胞菌營養瓊脂斜面上菌苔生長旺盛，薄，白色，閃光，培養基變為綠色至暗褐色或黑色，發熒光為單個，成對或呈短鏈排列的桿菌，有運動性革蘭氏染色為陰性明膠穿刺：迅速液化明膠，液體呈淺黃綠色或淺藍綠色吲哚試驗：陰性硝酸鹽還原試驗：陽性生孢梭菌/菌體粗大單獨存在或呈短鏈排列，芽孢比菌體寬，芽孢呈梭形，革蘭氏染色為陽性過氧化氫酶試驗陽性白色念珠菌改良馬丁瓊脂斜面上菌苔生長茂盛，光滑，濕潤，菌落呈乳白色可見卵形細胞，有多邊芽殖現象，有假菌絲/黑曲霉可見分隔菌絲體，分生孢子穗球形，黑色可見分隔菌絲體，分生孢子穗球形，黑色/附表B：試驗用菌種的保藏條件與時限菌種培養基培養溫度傳種時間大腸埃希菌營養瓊脂斜面營養肉湯菌懸液46201個月3個月2年大腸埃希菌不得多次冷凍