1、臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)一 人外周血單個核細(xì)胞分離（4學(xué)時）（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握人外周血單個核細(xì)胞分離的原理及操作方法；（二）實(shí)驗(yàn)原理密度梯度離心法。淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞的比重為1.0751.090，而紅細(xì)胞與分葉核白細(xì)胞的比重為1.092。淋巴細(xì)胞分離液的比重為1.077±0.001，與淋巴細(xì)胞比重相同，而紅細(xì)胞較之為重，通過離心，即可將淋巴細(xì)胞分離出來。（三）實(shí)驗(yàn)材料 肝素抗凝靜脈血； Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（密度為1.077±0.001）； D-Hanks液； 0.4%的臺盼藍(lán)染液；器材：離心機(jī)、恒溫水浴箱、顯微鏡、細(xì)胞計數(shù)板等。（四）實(shí)驗(yàn)方法 抽取

2、抗凝血2ml，與等量D-Hanks液混勻； 取分離液2ml，緩慢加入釋血液4ml； 2000 rpm離心20 min，觀察細(xì)胞分層情況； 取出PBMC，用4倍量D-Hanks液洗滌2次，每次1500 rpm離心10 min；用10%FCS的Hanks液還原體積至1 ml，取樣鏡檢計數(shù)；細(xì)胞存活率測定：取一個1.5ml EP管，加入等量的細(xì)胞懸液與臺盼藍(lán)染液，混勻后靜置5min，鏡檢；注意事項(xiàng)。細(xì)胞數(shù)/mL原液=（4大方格細(xì)胞數(shù)之和/4）×104×稀釋倍數(shù)（五）實(shí)驗(yàn)結(jié)果 PBMC的計數(shù)= xxx 個/ ml； 細(xì)胞存活率= 實(shí)驗(yàn)二 淋巴細(xì)胞檢測（4學(xué)時）（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握

3、免疫組化技術(shù)的原理、方法、結(jié)果判斷及實(shí)際應(yīng)用；2 熟悉E花環(huán)形成試驗(yàn)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的原理及結(jié)果判斷。（二）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 酶免疫組化技術(shù)測定CD3+T細(xì)胞數(shù)量（操作）（1）原理酶免疫組織化學(xué)技術(shù)是以細(xì)胞涂片或組織切片為檢測對象，應(yīng)用酶免疫技術(shù)對特定細(xì)胞表面抗原進(jìn)行顯色，通過普通光學(xué)顯微鏡觀察，判斷細(xì)胞表面有無特異抗原的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用鼠抗人CD3單克隆抗體，與待檢T細(xì)胞表面CD3分子結(jié)合，加入二抗，即聚合辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗小鼠IgG，通過HRP催化底物顯色判斷CD3分子的存在，從而確定T細(xì)胞。（2）材料人外周血單個核細(xì)胞懸液；鼠抗人CD3單抗（武漢博士德）； 兩步法免疫組化檢測試劑

4、盒（武漢博士德）； DAB顯色試劑盒（武漢博士德）； 0.01M PBS（PH 7.4）；器材：2 ml EP管、吸附載玻片、微量移液器、恒溫水浴箱、光學(xué)顯微鏡等。（3）方法 標(biāo)本片制備：取1-2滴PBMC懸液，滴在吸附載玻片上，用一塊潔凈普通載玻片進(jìn)行推片，制作細(xì)胞涂片，室溫風(fēng)干；滴加免疫染色固定液室溫固定10 min；甩掉多余的固定液，浸入PBS中，冷藏備用。 封閉：5% BSA，RT 10min 免疫反應(yīng)：加100l鼠抗人CD3單抗，置濕盒內(nèi)37 1h，PBS洗滌，2min*3次；加100l聚合HRP-抗鼠IgG，置濕盒內(nèi)37 30 min，PBS洗滌，2min*3次。 DAB顯色：取1

5、ml蒸餾水，加入ABC各一滴，混勻后加至涂片，室溫，鏡下控制反應(yīng)時間，約5-30分鐘，ddH2O漂洗終止反應(yīng)。 鏡檢：加蓋破片鏡檢計數(shù)。（4）結(jié)果將待測載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞呈棕黃色，計數(shù)200個細(xì)胞，計算CD3陽性細(xì)胞百分比。2 E花環(huán)形成試驗(yàn)（ERFC）（示教）（1）原理T淋巴細(xì)胞具有結(jié)合綿羊紅細(xì)胞（SRBC）的性質(zhì)，其分子基礎(chǔ)是T細(xì)胞表面存在CD2分子，也即E受體或SRBC受體。T淋巴細(xì)胞與SRBC在一定條件下作用，可環(huán)繞T細(xì)胞結(jié)合形成花環(huán)樣細(xì)胞團(tuán)，此即E花環(huán)形成試驗(yàn)，該試驗(yàn)可用于計數(shù)或分離E-花環(huán)形成細(xì)胞以及測定機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)。正常值：ET-RFC為 50%-80%。

6、（2）實(shí)驗(yàn)材料： E花環(huán)形成試驗(yàn)示教片； 顯微鏡。（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果（繪圖）3 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化（增殖）試驗(yàn)（示教）（1）實(shí)驗(yàn)原理體外培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞在有絲分裂原如植物血凝素（PHA）等的刺激下，可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，根據(jù)PHA刺激T細(xì)胞分裂的程度，可以間接估計T細(xì)胞識別特異性抗原的增殖反應(yīng)程度，從而反應(yīng)機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)。正常值：淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為60%80%。（2）實(shí)驗(yàn)材料： 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)示教片； 顯微鏡。（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果（繪圖）【補(bǔ)充】利用形態(tài)學(xué)方法判斷轉(zhuǎn)化率，掌握淋巴細(xì)胞的形態(tài)學(xué)至關(guān)重要，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的大小、核與漿的比例、胞漿的染色性、核結(jié)構(gòu)和核仁的有無等特征進(jìn)行判別。（1） 成熟的小淋巴細(xì)胞（未

7、轉(zhuǎn)化）：與未培養(yǎng)的小淋巴細(xì)胞一樣細(xì)胞直徑為68m，核染色致密，無核仁，核與胞漿比例大，胞漿染色為輕度嗜堿性。（2） 過度型淋巴細(xì)胞：比小淋巴細(xì)胞大，約1020m，核染色致密，但出現(xiàn)核仁，此為與成熟小淋巴細(xì)胞鑒別要點(diǎn)。（3） 淋巴母細(xì)胞：細(xì)胞體積增大，約2030m，形態(tài)不整齊，常有小突起，核變大，核質(zhì)染色疏散，有明顯核仁12個，胞漿變寬，常出現(xiàn)胞漿空泡。（4） 其它細(xì)胞：如中性粒細(xì)胞在培養(yǎng)72 h后，絕大部分衰變或死亡呈碎片。實(shí)驗(yàn)三 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（2學(xué)時）（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的基本原理和實(shí)際應(yīng)用；2 熟悉酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的操作方法。（二）實(shí)驗(yàn)原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA

8、）是將抗體（抗原）包被在固相表面后，按不同的步驟加入待測抗原（抗體）和酶標(biāo)抗體（抗原），充分反應(yīng)后用洗滌的方法，使固相上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分離，洗去游離的酶標(biāo)抗體（抗原），最后加入底物，根據(jù)酶對底物催化的顯色反應(yīng)程度，而對標(biāo)本中的抗原（抗體）進(jìn)行定性或定量。ELISA的技術(shù)類型有多種，常用的有間接法、夾心法和競爭法等。本實(shí)驗(yàn)以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測乙肝三系為例，驗(yàn)證其這一技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，包括雙抗體夾心法測HBsAg和HBeAg，雙抗原夾心法測HBsAb和競爭法測HBeAb和HBcAb。（三）實(shí)驗(yàn)材料待測血清；乙肝三系檢測試劑盒（上海科華）；器材：微量加樣器、恒溫水浴箱、酶標(biāo)儀等。（四）

9、實(shí)驗(yàn)方法（參考試劑盒說明書進(jìn)行）加入待測樣本：取待測血清加入酶標(biāo)板反應(yīng)孔中，每孔100l，置于37孵育30 min。注意應(yīng)做陰性對照和陽性對照。棄去孔中液體，用洗滌液洗3次，每次1min。于吸水紙上充分拍干；加入酶結(jié)合物：加1滴酶結(jié)合物至各反應(yīng)孔中，置于37作用30 min；洗滌同第2步；加入底物顯色：每孔加底物液A和B各1滴，振蕩混勻后置37避光顯色1020 min；終止反應(yīng)：當(dāng)陽性對照出現(xiàn)明顯顏色變化或陰性對照稍有顏色變化時，每孔加入1滴終止液終止反應(yīng)，于20分鐘內(nèi)測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（五）實(shí)驗(yàn)結(jié)果肉眼判定：夾心法檢測呈明顯顯色者為陽性，不顯色者為陰性，競爭法則相反；酶標(biāo)儀判定：采用反應(yīng)底物的最

10、大吸收波長測定OD值，本實(shí)驗(yàn)底物為TMB，最大吸收波長為450nm，故應(yīng)測定OD450值。附：斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn) 尿HCG測定（操作）（1） 實(shí)驗(yàn)原理抗HCG免疫金復(fù)合物干片粘貼在近下端，抗HCG單克隆抗體和抗小鼠IgG抗體分別固化于NC膜的測試區(qū)和質(zhì)控參照區(qū)。當(dāng)試紙條下端浸入液體標(biāo)本中，下端吸水材料即吸取液體液體向上端移動，流經(jīng)干片時，使免疫金復(fù)合物復(fù)溶，并帶動其向膜條滲移。若標(biāo)本中有HCG，可與抗HCG免疫金復(fù)合物結(jié)合。此抗原抗體復(fù)合物流至測試區(qū)時即被固相抗體所獲，在膜上顯出紅色反應(yīng)線條。（2） 實(shí)驗(yàn)材料：待測尿液；早早孕妊娠診斷試劑條。（3） 實(shí)驗(yàn)方法：參考試劑盒說明進(jìn)行。（4） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

11、：參考試劑盒說明進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)四 沉淀反應(yīng)（2學(xué)時）（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握沉淀反應(yīng)的原理、種類及用途；2 熟悉單向和雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的操作方法。（二）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容4 單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（僅作原理與方法介紹）（1） 實(shí)驗(yàn)原理單向擴(kuò)散系定量試驗(yàn)，通常以已知抗體測定未知抗原。試驗(yàn)中首先將一定的抗血清（抗體）混合于瓊脂內(nèi)，制成含抗體的瓊脂板，再于瓊脂板上打孔，將一定量的抗原加入孔中，抗原向孔四周擴(kuò)散，與相應(yīng)抗體結(jié)合，在抗原抗體比例合適處形成白色沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的直徑大小與抗原的濃度呈正比。以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原與固定濃度的抗血清反應(yīng)測得沉淀環(huán)的直徑作為縱坐標(biāo)，以抗原濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，量取待檢抗原的沉淀環(huán)直

12、徑，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得其含量。該實(shí)驗(yàn)主要用于檢測標(biāo)本中各種Ig含量和血清中補(bǔ)體成分的含量。實(shí)驗(yàn)材料：待測血清；羊抗人IgG診斷血清；生理鹽水；1.5%瓊脂凝膠；器材：載玻片、打孔器、針頭、微量加樣器、試管、濕盒、恒溫水浴箱等。（2） 實(shí)驗(yàn)方法：待測血清的稀釋：用生理鹽水將人血清稀釋成1:4、1:8、1:16、1:32、1:64；免疫瓊脂板制備：取5ml 試管，加入4ml含羊抗人IgG診斷血清的3%瓊脂，倒板制成瓊脂板，用3mm的打孔器在瓊脂板上打孔，孔距11.5cm，孔內(nèi)瓊脂用注射器針頭挑出；加樣：用微量移液器取10L各種不同濃度的待測血清加入孔內(nèi)；反應(yīng)：將加樣的瓊脂板置水平濕盤內(nèi)，于37溫

13、箱反應(yīng)2448小時后，取出反應(yīng)板，用標(biāo)尺測其沉淀環(huán)直徑并記錄。5 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（操作）（1） 實(shí)驗(yàn)原理雙向擴(kuò)散為定性試驗(yàn)。將可溶性抗原與相應(yīng)抗體分別加入瓊脂板上相對應(yīng)的孔內(nèi)，兩者相互擴(kuò)散，在比例適宜處形成沉淀線。如抗原與抗體無關(guān)則不形成沉淀線。此實(shí)驗(yàn)用來檢測抗原或抗體的純度，亦可用已知的抗原（抗體）來測未知的抗體（抗原）。臨床上常用于檢測甲胎蛋白（AFP），作為原發(fā)性肝癌等的輔助診斷。（2） 實(shí)驗(yàn)材料：待測血清；羊抗人IgG診斷血清；生理鹽水；1.2%瓊脂凝膠；器材：載玻片、打孔器、針頭、微量加樣器、試管、濕盒、恒溫水浴箱等。（3） 實(shí)驗(yàn)方法：待測血清的稀釋：用生理鹽水將人血清稀釋成1:4、1:8、1:16、1:32、1:64；瓊脂板制備：取5ml 試管，加入4ml 1.2%瓊脂凝膠，倒板制成瓊脂板，用