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文檔簡介

1、TALEN活性檢測與基因型鑒定蘇幼紅2021.3.2基因敲除大鼠技術流程基因敲除大鼠技術流程.一、 TALEN活性檢測1.細胞轉染2.測序套峰實驗3. 錯配酶實驗.流程C6細胞轉染TALEN pair提取基因組PCR擴增靶位點測序錯配酶實驗.1. TALEN轉染C6細胞 構建好的TALEN質粒成對轉染細胞詳見SOP。 收細胞基因組，PCR擴增目的基因片段。.2. 2. 測序實驗測序實驗PCR并將產物送測序，測序結果分析，舉例如下：Rag2 wtTALEN Rag2-38.3. 3. 錯配酶實驗錯配酶實驗 (MSD assay)- (MSD assay)-原理及流程原理及流程錯配酶：一類可識別并

2、切割異源DNA錯誤配對位點的內切酶。NEB：T7EI5-tgcccagcagcagcggccttacggctatgagcaggca agctttgtgggtgctctgccga-3 3- acgggtcgtcgtcgccggaa tgccgatactcgtccgt tcgaaacacccacgagacggct -5TALEN-L target seq. TALEN-R target seq.SpacerF1R1E2E3E4Fragment 1Fragment 2.PCR擴增目的基因片段PCR產物純化純化產物變性、退火錯配酶切退火產物.UncleavedTALEN dependent bandw

3、t 39 41 55 64 66 78 89 99 91 38 wt 39 41 55 64 66 78 89 99 91 38 ApoA4 Rag2 ApoA4 Rag2T7EI-T7EI+3. 3. 錯配酶檢測錯配酶檢測 (MSD assay) - (MSD assay) - 結果例如結果例如.錯配酶檢測MSD assay結果分析.Origin Pro.二、 F0代基因型鑒定測序.峰圖：有無套峰？有無序列比對野生型純合復制套峰左側的單峰序列，在基因組中尋覓位置，在雙峰中能否找到下游WT序列？2種峰嵌合雙峰能找到雙峰中非WT序列在基因組的位置單克隆測序缺失雜合/嵌合根據峰高雜合/嵌合；插入/

4、(插入+缺失)雙等位基因的不同修飾注：無法完全分辨雜合與嵌合能否否鼠尾基因組提取及PCR測序結果分析.野生型野生型.缺失純合 Rat NO.16WTRat NO.16WTRat NO.16WT.嵌合2峰 .缺失雜合/嵌合？ WTRat NO.6WT G C C T T A A T T C A A C C A T C A T C T C A A A C T G .插入雜合？WT C T C C T G G C T G C T G C G C T C C T G G C T G C T G .插入+缺失?WT G A G A C A T T T T C A T G C T A G A C A T A C A C T T G C T T G G A A.F0代SD鼠優先選擇原那么普通為：純合 雜合 嵌

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