1、第一章 緒論1.1埃博霉素介紹1.1.1簡介隨著人類受惡性腫瘤的威脅逐年增加，新穎抗腫瘤藥物的研發(fā)迫在眉睫。埃博霉素類藥物是一種微生物來源類藥物，具有微管穩(wěn)定作用，其選擇性高、活性強、毒性較低，有望取代紫杉醇成為新一代抗腫瘤藥物，具有巨大的市場前景。埃博霉素(epothilone)是一類由纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)產(chǎn)生的具有抗腫瘤活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。與傳統(tǒng)的抗癌藥物紫杉醇的抗腫瘤機制一樣，但埃博霉素的分子結(jié)構(gòu)簡單、水溶性好、毒副作用較小、抗腫瘤譜較廣，能夠更好地抑制腫瘤細胞的增殖，并且埃博霉素可發(fā)酵生產(chǎn)，是一種具有廣闊開發(fā)潛力的新型抗腫瘤化合物。因此，自從199

2、5年發(fā)現(xiàn)埃博霉素的抗癌活性后，其得到了包括生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等多方面的廣泛而深入的研究。 由美國施貴寶公司開發(fā)的埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物Ixabepilone（商品名伊沙匹隆），于2007年10月16日獲得食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration）批準在美國上市，這是迄今第一個上市的埃博霉素衍生物。主要的天然埃博霉素化合物   一些天然的埃博霉素從圖可見，埃博霉素是16元環(huán)的一類大環(huán)內(nèi)酯化合物，在C15位置連接了一個含噻唑環(huán)的側(cè)鏈。由發(fā)酵制備時，埃博霉素A和B是主要產(chǎn)物，埃博霉素CF是次要產(chǎn)物，但可以CF經(jīng)從A或者B一步反應(yīng)可以

3、得到可以。埃博霉素A、B和D對癌細胞的生物活性可以和紫杉醇媲美，甚至更強，尤其是埃博霉素B，其活性比紫杉醇強10100倍。在C12位上的有甲基取代，以及C12C13雙鍵換成環(huán)氧基團后，埃博霉素的活性得到極大地提高。埃博霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)是由Sorangium cellulosum（黏細菌纖維堆囊菌）產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)為16元內(nèi)酯大環(huán)為中心體，噻唑環(huán)配基為側(cè)鏈的一類細胞毒性化合物（如圖）   埃博霉素的活性示意圖   1.1.2應(yīng)用埃博霉素的抗腫瘤作用機理與紫杉醇相似，即抑制微管解聚。埃博霉素在p-糖蛋白表達型的多藥耐藥性

4、腫瘤細胞系中顯示很強的抗腫瘤活性，這種腫瘤細胞系紫杉醇是殺不死的，加之埃博霉素比紫杉醇有更好的水溶性，且毒副作用很小，被公認為21世紀最有效的抗癌藥物。 由美國施貴寶公司開發(fā)的埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物Ixabepilone（通用名為伊沙匹隆），于2007年10月16日由食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration）批準在美國上市，伊沙匹隆單藥用于治療蒽環(huán)糖苷類抗生素、紫杉烷衍生物和卡培他濱治療無效的轉(zhuǎn)移性或局部進展的晚期乳腺癌；可與卡培他濱聯(lián)用用于治療蒽環(huán)糖苷類抗生素和紫杉烷衍生物以治療無效的轉(zhuǎn)移性或局部進展的晚期乳腺癌，這是迄今第一個上市的埃博霉素衍生

5、物類藥物。 2007年9月24日，施貴寶公司向EMEA提出在歐盟集中上市的申請，2008年11月20日，歐洲人用藥品委員會（CHMP）對該申請做出負面裁定并建議其不上市，隨后公司提出復(fù)審，直到公司主動撤回該申請時，CHMP的審查仍一直在進行。在致EMEA官方信件中，百時美施貴寶公司稱撤回上市申請是由于他們在復(fù)審程序中提供的信息尚不足以改變委員會對伊沙匹隆做出利益小與風險的評價。  埃博霉素可能是目前所有藥物中最為昂貴的品種，以美國施貴寶公司的埃博霉素B衍生物（伊沙匹隆）注射劑為例，15mg/支平均批發(fā)價（AWP）921.96美元，45mg/支的平均批發(fā)價（AWP）

6、2765.89美元，直至2008年銷售收入已突破1 億美元。 1.2丙酮酸激酶介紹1.2.1簡介 丙酮酸激酶縮寫式為ATP：丙酮酸-2-O-磷酸轉(zhuǎn)移酶。在糖酵解系統(tǒng)里，它是催化形成第二個ATP反應(yīng)的酶。能以磷酸烯醇（phosphoenolpyruv- ate）丙酮酸和ADP生成丙酮酸和ATPGo1-75kcal。除需要二價金屬離子外（Mg2和Mn2）外，還需要一價金屬離子（KRb，Cs），在生理上起作用的大概是K。分子量約25萬。是催化ADP為ATP的形成，結(jié)果是形成丙酮酸的終產(chǎn)物。丙酮酸激酶催化磷酸烯醇丙酮酸酯和ADP轉(zhuǎn)變成丙酮酸和ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移酶，是糖酵解過程中的主

7、要限速酶之一,因此丙酮酸激酶(PK)是糖酵解中的三大關(guān)鍵酶之一。在哺乳細胞株中，丙酮酸激酶有4種同工酶并呈組織特異性，分別為L型、R型、M1型和M2型，通常均以酶的活性四聚體形式存在，根據(jù)組織不同的代謝功能，它們具有顯著的不同調(diào)控機制與動力學(xué)特性，其中L型主要存在于肝臟和正常腎臟的近曲小管；R型存在于紅細胞；M1型主要存在于骨骼肌、心臟和腦；M2型主要表達于肺正常腎臟的遠曲小管、胚胎和未分化或增生的組織。其中PKL 和PKR 由基因L 編碼，通過不同的組織特異性啟動子而分別表達于肝細胞和紅細胞中。PKM1、PKM2 由M 基因編碼，在轉(zhuǎn)錄過程中由前體mRNA 經(jīng)不同選擇性剪切的產(chǎn)物 ，PKM1

8、 的外顯子為9，主要存在成熟組織如腦組織與骨骼肌，與PEP 底物的親和力最高，不能被磷酸化和被別構(gòu)化調(diào)控；PKM2 的外顯子為10，其負責二聚體轉(zhuǎn)化成四聚體的C 端56 個氨基酸與PKM1存在差別，主要存在一些分化組織、具有核酸合成特性的細胞中如胚胎細胞。但隨著胚胎形成，PKM2 被不同組織的同工酶替代，有趣是，腫瘤形成過程，其它同工酶消失，PKM2 酶則高度表達，這給癌癥治療奠定新的生物基礎(chǔ)。 研究表明，當惡性腫瘤發(fā)生時，PK的組織特異性同工酶(L型、R型、M1型PK等)表達減少，在癌基因編碼的激酶作用下，M2一PK可在腫瘤細胞中呈過度表達并且其絲氨酸（Serine，Ser）和酪氨酸（Tyr

9、osine，Tyr）位點均發(fā)生磷酸化，使得原先具有高度活性的四聚體解離為無活性的二聚體形式，并占據(jù)主導(dǎo)地位，即TU M2一PKt”。1.2.2作用丙酮酸激酶M2一PK以四聚體形式存在時活性高，與底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)親和力強，而以二聚體形式存在時則與之相反。TU M2一PK與PEP的親和力很低，導(dǎo)致磷酸烯醇類物質(zhì)的堆積，這有利于腫瘤細胞不是糖酵解供能而轉(zhuǎn)向核酸合成的方向進行，此相對于糖酵解的過程，可稱之為谷氨酸酵解過程，以保證細胞中的能量供給。細胞增殖是一個耗能過程，若細胞無限增殖，細胞會因能量供應(yīng)不上而死亡。PK在阻止細胞死亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重大作用。PK催化PEP是其磷酸轉(zhuǎn)移到二磷酸

10、腺苷(Adenosine diphosphate，ADP)或二磷酸鳥苷(Guanosine diphosphate，GDP)上，同時產(chǎn)生丙酮酸、三磷酸腺苷(ArIP)或三磷酸鳥苷(Guanosine triphosphate，GTP)，糖酵解過程中在PK的作用下導(dǎo)致能量的凈生成。因此丙酮酸激酶可調(diào)控ATP：ADP和GTP：GDP的比率以及一磷酸腺苷、腺苷酸激酶、磷酸果糖激酶的水平。一磷酸腺苷水平的提高可以減少輔酶A、三磷酸鳥苷以及三磷酸胞苷合成，從而抑制DNA的合成和細胞增生。M2一PK通過這種機制來調(diào)控細胞增生以及能量的轉(zhuǎn)換及供給。在腫瘤細胞中，M2一PK二聚體和四聚體的比例受腫瘤蛋白和能量

11、代謝介質(zhì)的調(diào)節(jié)而產(chǎn)生變化，以達到適應(yīng)腫瘤代謝的需要。研究表明，四聚體型與二聚體型M2一PK的比率由ATP、1，6一二磷酸果糖、絲氨酸（Serine，Ser）以及不同的癌蛋白(pp60v一8rc、HPV一16 E7)之間的相互作用來調(diào)控。在有足夠氧氣供應(yīng)的實體瘤中，谷氨酸酵解提供大量的丙酮酸。這些谷氨酸酵解和糖酵解中產(chǎn)生的丙酮酸用來合成乳酸、谷氨酸和脂肪酸，從而釋放出在糖酵解過程中甘油醛3一磷酸脫氫酶作用下產(chǎn)生的氫，進而保證腫瘤細胞中能量的供給。可見，TU M2一PK在腫瘤新陳代謝中是發(fā)揮及其重要的作用。1.3代謝調(diào)控1.3.1簡介 在工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域,發(fā)酵微生物學(xué)家研究探索發(fā)酵微生物的調(diào)控機制,通

12、過控制器代謝調(diào)控使其高產(chǎn)具有商業(yè)價值的產(chǎn)物(如:某種代謝物、酶)，即達到最佳的調(diào)控效果，從而產(chǎn)生最大的經(jīng)濟效益 。解除微生物的調(diào)控機制可以通過營養(yǎng)控制或經(jīng)典的基因手段以繞過或去除負調(diào)控而增強正調(diào)控機制來實現(xiàn),可用方法有:誘導(dǎo),碳源、氮源及磷酸鹽的營養(yǎng)調(diào)控和反饋調(diào)控。 微生物代謝一般首先將高分子的碳源分解為小分子,然后轉(zhuǎn)變?yōu)榘被帷⒑塑账帷⒕S生素、碳水化合物、脂肪酸,最后轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)、酶、核酸、多糖、脂用于生長。通過發(fā)酵可生產(chǎn)用一般化學(xué)方法合成難度大或成本高的物質(zhì)。微生物要生產(chǎn)出這些物質(zhì),首先必須合成大量的酶,然后使其協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。微生物的代謝必須保證這種協(xié)調(diào)性,在代謝過程中僅生產(chǎn)所需的合適濃度

13、的酶。當生產(chǎn)出了足夠量的這種特殊物質(zhì)后,微生物通過其調(diào)節(jié)機制就不再合成與其相關(guān)的酶,且原有酶的活性降低。因此細胞是根據(jù)環(huán)境情況適量地生產(chǎn)代謝產(chǎn)物,這使得一個物種能同自然界中其它生命形式相競爭而生存下來。具有調(diào)控功能的一些重要機制有:底物誘導(dǎo)、營養(yǎng)調(diào)控及反饋調(diào)節(jié)。發(fā)酵的本質(zhì)即從自然界中分離出特定的野生型微生物并在實驗室中進行調(diào)控修飾或定向修飾,由此可得到高產(chǎn)某種初、次級代謝產(chǎn)物的菌株。 代謝調(diào)控研究的主要對象是為人類生產(chǎn)大量的抗生素、酶、氨基酸、有機酸、溶劑、醇類、多糖、維生素、蛋白質(zhì)、生理活性物質(zhì)、色素等有用產(chǎn)物的工業(yè)微生物及培養(yǎng)技術(shù)，主要是細菌、放線菌、酵母、霉菌等，當然現(xiàn)在又擴大到藻類、病

14、毒、植物、動物等的培養(yǎng)技術(shù)。 代謝控制發(fā)酵的研究任務(wù)為掌握微生物的生長、繁殖、發(fā)育、分化、代謝等生命活動的規(guī)律，以及和周圍環(huán)境之間關(guān)系，從而控制工業(yè)微生物的生命活動（代謝途徑），為提高發(fā)酵過程的生產(chǎn)、效率和創(chuàng)立新的發(fā)酵過程奠定理論基礎(chǔ)。 1.3.2基本思路1、應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型突變株切斷代謝支路；2、滲漏突變株的應(yīng)用；3、抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的應(yīng)用；4、營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株的應(yīng)用；5、增加前體物質(zhì)的合成；6、增加細胞滲透性，去除細胞內(nèi)的終產(chǎn)物；7、一些特殊調(diào)節(jié)機制的利用；8、條件突變株的應(yīng)用；選育不生成副產(chǎn)物的菌株。1.3.3常用方法1、誘導(dǎo)：在一定的變化范圍內(nèi),微生物可以通過結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、毒

15、素、酶等形式的變化來適應(yīng)條件的變化,由此以適應(yīng)特殊的生態(tài)環(huán)境。微生物中的一種特殊物質(zhì)誘導(dǎo)物能誘導(dǎo)、啟動酶及代謝物的產(chǎn)生。2、碳源代謝物抑制(CCR)：CCR 廣泛分布于微生物中,其主要功能是:當環(huán)境中有多種碳源時,CCR 就選擇性利用碳源。在這種機制的調(diào)控下細胞首先代謝培養(yǎng)基中的最優(yōu)碳源,這時,利用其它底物來合成酶的反應(yīng)就會受到抑制,直到這種占主導(dǎo)地位的底物耗盡為止。3、氮調(diào)控：氮源調(diào)控的酶有:用于監(jiān)測和去除水中硝酸鹽的硝基還原酶、用于尿酸測定及其去除的尿酸酶、用于日用品和洗滌劑的蛋白酶等。4、磷酸鹽調(diào)控：磷調(diào)控包括特異調(diào)控和一般調(diào)控。無機磷酸鹽的特異性負作用是由于它能抑制磷酸酶。避免磷酸鹽抑

16、制效應(yīng)且最大限度地擾亂微生物生長的其它方法還有通過經(jīng)典遺傳學(xué)方法分離抗磷酸鹽負作用的突變株,有關(guān)這種方法的報道有:非多元大環(huán)內(nèi)酯抗生素復(fù)合物。5、反饋調(diào)控：反饋調(diào)控就是生物合成和代謝可以自己調(diào)控自己的機制。這種機制可以調(diào)控已存在的酶的活性(反饋阻化),也能終止合成(反饋抑制)。1.4立題目的、意義 世界衛(wèi)生組織公布，全世界每年患癌癥人數(shù)大幅度增長，至今每年檢驗出的新增癌癥患者數(shù)已經(jīng)超過1400萬名。這與2008年的統(tǒng)計結(jié)果1270萬人相比，人數(shù)明顯增加。同期，癌癥患者的死亡人數(shù)也有所增加，從過去的760萬人增加到820萬人。據(jù)WHO估計，到2025年，全球癌癥患者人數(shù)將達到1900萬。WHO稱

17、眾多癌癥中，肺癌是最常見的癌癥，它主要是由吸煙引起的。肺癌患者人數(shù)在全球已經(jīng)達到180萬例，約占患癌總?cè)藬?shù)的13%。并且，乳腺癌也顯示出一種“急劇上升”的趨勢，從2008年之后，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率就一直呈上升狀態(tài)，目前已經(jīng)成為140多個國家中女性的常見癌癥之一。在發(fā)展中國家普及乳腺癌的診斷和治療技術(shù)是一件迫在眉睫的事情。癌癥的高發(fā)危險性是抗癌治療藥物的研發(fā)、生產(chǎn)和市場狀況受到了愈來愈廣泛的關(guān)注。微生物來源的抗癌藥物近年來不斷涌現(xiàn)，發(fā)展廣譜、低毒、高效、新型的抗癌藥物已經(jīng)成為研究的方向。 埃博霉素被譽為最具有潛力的抗腫瘤新藥之一，埃博霉素與紫杉醇一樣具有穩(wěn)定微管蛋白的活性。在 20 世紀 9

18、0 年代，紫杉醇廣泛應(yīng)用于臨床，臨床實驗表明，紫杉醇對不同的實體瘤細胞有明顯的抗腫瘤活性，但由于其副作用多而受限制。如引發(fā)嗜中性白細胞減少癥，外周神經(jīng)病和脫毛癥等，并且紫杉醇的低水溶性使 得它必需由乳化方式給藥，紫杉醇還可能影響心臟功能，導(dǎo)致過敏反應(yīng)，此外，它還是 P-糖蛋白的底物。P-糖蛋白可以將許多細胞毒性物質(zhì)從細胞中泵出，是腫瘤細胞產(chǎn)生多藥物質(zhì)抗性的最主要原因。然而，紫杉醇復(fù)雜的結(jié)構(gòu)阻礙了通過化學(xué)修飾改善其可溶性和降低毒性副作用的發(fā)展，因此，激發(fā)了人們對研究與其作用模式相近但卻具有更好特性的化合物興趣。埃博霉素離體抑制的效果比藥物紫杉醇強2000-5000 倍，并且甲基化的EPO B作用

19、效果更大，作用的有效濃度為 1020ng/mL。比起紫杉醇來，埃博霉素是一種更不易受 P-糖蛋白作用的物質(zhì)。因而埃博霉素的抗腫瘤性能要比紫杉醇強的多，且其抗腫瘤譜要廣的多。埃博霉素具有比紫杉醇水溶性更好，毒副作用更小，同時化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單，易于進行修飾等優(yōu)點，引起了生物、醫(yī)學(xué)、制藥及有機合成等學(xué)科領(lǐng)域的高度重視，是目前學(xué)術(shù)界密切關(guān)注的、醫(yī)藥界寄予厚望的、前景廣闊的一類新型抗腫瘤藥物。另外，紫杉醇從太平洋的紫杉樹皮中提取，但這種樹生長極慢，來源有限。通過纖維堆囊菌發(fā)酵獲得的埃博霉素，極有可能解決抗癌藥物不足的問題，然而纖維堆囊菌具有多變的形態(tài)，次級代謝產(chǎn)物種類繁多，并且埃博霉素產(chǎn)量低且不穩(wěn)定，因此埃

20、博霉素高產(chǎn)量發(fā)酵具有很大的挑戰(zhàn)性。本論文主要通過在發(fā)酵條件下，添加抑制劑、促進劑，進行搖床培養(yǎng)，（纖維堆囊菌發(fā)酵周期是7天）測定這發(fā)酵7天不同條件下每天的菌體干重、pH、還原糖含量及酶活力、埃博霉素產(chǎn)量；同時提取每天的RNA，對每天的樣品RNA進行反轉(zhuǎn)錄，最后進行PCR。選擇研究的主題主要是丙酮酸激酶，這是糖酵解途徑的一個關(guān)鍵酶。通過增加丙酮酸激酶效應(yīng)（活化劑，抑制劑），然后測量丙酮酸激酶的活性和埃博霉素的產(chǎn)量的改變，同時也檢測添加酶制劑后，對基因組和合成的埃博霉素的基因表達過程中的變化的影響。第二章 丙酮酸激酶酶活的測定和埃博霉素的定量分析2.1實驗方法2.1.1纖維堆囊菌的培養(yǎng)2.1.1.

21、1纖維堆囊菌的種子培養(yǎng)將在甘油管中保存的纖維堆囊菌2161菌株在CNST培養(yǎng)基條件下進行活化。將已滅菌的CNST培養(yǎng)基倒平板，等凝固后貼上小片濾紙片，然后用移液槍吸取甘油管中的菌液滴加到濾紙片上，在32的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約3-4天至濾紙片呈現(xiàn)透明狀，并且長滿黃色的菌體。將生長狀態(tài)良好的菌體用接種環(huán)或接種鏟接入盛有50mL液體M26培養(yǎng)基的300mL搖瓶中，進行搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：32，130r/min，培養(yǎng)3-4天到達對數(shù)生長期。2.1.1.2纖維堆囊菌的發(fā)酵培養(yǎng)將在M26種子培養(yǎng)基中生長了3-4天處于對數(shù)期的菌體打散混勻后分別接種到已配好的發(fā)酵培養(yǎng)基中。在接種的同時將溶于介質(zhì)中的抑制劑和促

22、進劑分別用已滅菌的0.22µm濾頭過濾除菌后分別加入到搖瓶中進行搖床培養(yǎng)，每個條件做3個平行。培養(yǎng)條件為：32，130r/min，培養(yǎng)7天，發(fā)酵結(jié)束。2.1.2粗酶液的提取和酶活的測定2.1.2.1收集菌體收集每天生長的菌體，每天不同生長條件做三個平行，吸取菌體于10mL離心管中，每個搖瓶吸取約1mL。7500r/min條件下離心10分鐘，去除上清，然后每個離心管中加入5mL三乙醇胺-鹽酸緩沖液（pH 7.6）懸浮菌體，然后7500 r/min條件下離心10分鐘，洗滌菌體，洗去發(fā)酵培養(yǎng)基，去上清，然后再加入5mL三乙醇胺-鹽酸緩沖液（pH 7.6）懸浮菌體。2.1.2.2破碎菌體將上

23、步得到的菌懸液進行冰浴超聲波細胞破碎，破碎條件為：工作3s，間歇6s，全程5min，破碎溫度為0。2.1.2.3收集粗酶液將破碎后的細胞液進行低溫離心，離心條件為：12000r/min，20min，4，收集上清液。上清液即粗酶液。2.1.2.4蛋白含量測定1、配置考馬斯亮藍染色液，將研磨好的考馬斯亮藍G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000mL，濾紙過濾。2、標準蛋白溶液，配置牛血清白蛋白的濃度為100µg/mL。3、在粗酶液蛋白濃度測定中，以1mL三乙醇胺-鹽酸緩沖液為空白對照，將粗酶液稀釋一定倍數(shù)，取稀釋后的粗酶液1mL

24、，然后分別加入考馬斯亮藍染色液4mL，搖勻，靜止2-5分鐘后，在595nm條件下測定其吸光值。根據(jù)標準曲線得出粗酶液的蛋白濃度。2.1.2.5酶活測定按照考馬斯亮藍法測定粗酶液蛋白濃度，然后用三乙醇胺-鹽酸緩沖液將粗酶液稀釋到蛋白濃度約為1mg/mL進行酶活測定。取0.98ml實驗混合物（見表2.1）在25水浴10min，然后加到石英比色皿中，用微量進樣器加入0.02ml酶液，立即啟動時間掃描，波長為340nm，掃描時間為5min。由于反應(yīng)后在340nm處吸收值發(fā)生變化，NADH的吸收系數(shù)為340=6.3×103l/(mol·cm)，根據(jù)單位時間內(nèi)吸收值的變化計算酶含量。定

25、義每分鐘內(nèi)消耗1 mol NADH所需要的酶活力為一個酶活單位。根據(jù)酶活曲線計算酶活力及酶比活力：根據(jù)公式算出酶活力：= =比活力=酶活力/酶液蛋白濃度表2.1 PK酶活反應(yīng)混合物反應(yīng)混合物組分體積（mL）0.1 mol/L三乙醇胺-KOH緩沖液（pH7.6）8.200.5 mol/L KCl0.200.25 mol/L MgCl20.100.01mol/L PEP0.500.1mol/L ADP0.500.1mol/L NADH0.20LDH（150U）0.102.1.3埃博霉素標準曲線的測定1、分別稱取埃博霉素A/B純品為0.045mg/0.02mg，然后用1mL純甲醇充分溶解作為母液，然

26、后分別用純甲醇將母液稀釋到不同濃度。埃博霉素A的稀釋濃度（mg/L）分別為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50；埃博霉素B的稀釋濃度（mg/L）分別為3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、35。2、將配置好的不同濃度的標準品在10000r/min條件下離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一干凈的離心管中，然后用HPLC進行測定。檢測條件：檢測波長249nm；色譜柱Elite C18m，4.6×250 mm；流動相為甲醇：水=7:3；流速為1.0mL/min；柱溫40；進樣量為10µL。2.2實驗結(jié)果2.2.1埃博霉素標準曲線的測定分別以Epo

27、A，EpoB的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線如圖2.2。EpoA標準曲線方程為：y=8×106x+24325（R2=0.9979），EpoB標準曲線方程為：y=7×106x+124336（R2=0.9986）。在樣品濃度測定中，根據(jù)其峰面積換算出埃博霉素濃度（g/L）。圖2.2 埃博霉素的標準曲線（A：EpoA B：EpoB）第三章 抑制劑和促進劑的添加對酶活和產(chǎn)量的影響3.1實驗方法3.1.1效應(yīng)劑濃度的可行性實驗3.1.1.1抑制劑VK3濃度的可行性實驗根據(jù)文獻70中數(shù)據(jù)，對人類的PKM2型的半抑制率為13µM，因此設(shè)計濃度為1.3,13,130&

28、#181;M范圍，測定其是否對纖維堆囊菌中的丙酮酸激酶有抑制作用。確定其對纖維堆囊菌中的丙酮酸激酶有抑制作用之后，然后設(shè)計濃度確定一個濃度，在此濃度條件下對菌體生長影響不大，但對酶活有顯著抑制作用。設(shè)計的濃度為1.3，7，13，20，25，30µM進行實驗，測定這些濃度條件下菌體干重及酶活力，與空白對照進行比較。3.1.1.2激活劑果糖-1,6-二磷酸濃度的確立 根據(jù)文獻74中研究，當其濃度為0.5mM時對丙酮酸激酶的激活作用最明顯，濃度過高或過低會對酶活力的促進作用不明顯，可能還會產(chǎn)生抑制作用。在本實驗中選擇果糖-1,6-二磷酸的濃度梯度為0.05mM，0.5mM，5mM。3.1.

29、2丙酮酸激酶酶活的測定此處酶活測定方法與2.1.2測定方法一致。收集每天不同生長條件下的菌體，離心收集菌泥，然后進行破壁處理，之后測蛋白含量及丙酮酸激酶酶活力。3.1.3埃博霉素產(chǎn)量的測定3.1.3.1樹脂的收集 將每天的發(fā)酵液與樹脂的混合物進行抽濾，得到的樹脂在40條件下烘干，收集于10mL離心管中，分別加入1mL甲醇進行搖床震蕩萃取過夜，然后將液體轉(zhuǎn)移到離心管中40烘干，取200µL甲醇重新溶解后10000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液于新管中待用。3.1.3.2HPLC分析條件檢測條件：檢測波長249nm；色譜柱Elite C18m，4.6×250 mm；流動相

30、為甲醇：水=7:3；流速為1.0mL/min；柱溫40；進樣量為10µL。3.2實驗結(jié)果3.2.1抑制劑和促進劑濃度的選擇3.2.2丙酮酸激酶酶活的測定從圖4.1中可以看出在添加VK3和FBP后，酶活力明顯發(fā)生變化，空白組從第三天到第四天菌體生長迅速，酶活力達到最大，在VK3條件下其酶活力受到顯著抑制，添加VK3后其酶活力是對照的0.40倍。而在果糖-1,6-二磷酸存在的條件下，其酶活力受到顯著的促進作用，是對照組的1.43倍。從圖4.1中可以看出，在發(fā)酵第3天到第4天，PK酶活力增長迅速，在第四天時酶活力達到最大，然后開始慢慢下降。而在第3章中已得出，菌體在第3天到第4天時生長迅速

31、，進入指數(shù)期。可以得出在菌體迅速增長時PK酶活力也迅速增大，酶活力與菌體生長成正相關(guān)。圖4.1 不同條件下丙酮酸激酶酶活力變化3.2.3效應(yīng)劑對埃博霉素產(chǎn)量的影響我們也分析了每天埃博霉素的積累量（圖3.2 A,B）。在對照組中從第三天到第四天埃博霉素的積累量達到最大。在抑制劑VK3存在的條件下，埃博霉素的積累量明顯低于對照組，在激活劑果糖-1,6-二磷酸存在的條件下，埃博霉素積累量明顯高于對照組。然后又分析了不同條件下單位菌體埃博霉素的產(chǎn)量（圖3.2C,D）。在第7天時，添加VK3的條件下埃博霉素A和B分別只是對照組的43.36%和43.31%，而在果糖-1,6-二磷酸的條件下，單位菌體埃博霉

32、素A和B卻是對照組的132.2%和145.91%。添加果糖-1,6-二磷酸對埃博霉素合成起到了促進作用。圖3.2不同條件下每一天的和單位菌體埃博霉素產(chǎn)量變化（A,C 埃博霉素A；B,D 埃博霉素B）第四章 抑制劑和效應(yīng)劑的添加對相關(guān)基因表達量的影響4.1實驗方法 4.1.1 RNA提取由于空氣中以及人呼出的氣體中含有大量RNase，RNase無處不在，因此RNA極易降解，因此在提取RNA的過程中特別小心。首先選擇在比較偏僻的角落，避免人經(jīng)常走動，在做實驗之前將實驗臺用DEPC水擦拭數(shù)遍，實驗所用的移液槍，槍盒也要是提RNA專用的，實驗中所用的槍頭，離心管也要是滅RNase的，槍盒要在125條件

33、下干熱滅菌1h，試劑瓶，稱溶菌酶所用的稱量紙及藥匙要在180條件下干熱滅菌4h，已徹底滅活RNase。在提取RNA過程中要戴口罩和滅菌手套，在提取過程中要盡量避免說話以及人員走動，操作速度要快。4.1.2 cDNA的合成根據(jù)提取的RNA濃度，選擇合適的RNA模版量進行反轉(zhuǎn)錄，從而確保進行定量PCR時cDNA的量一致。在本實驗中每個反轉(zhuǎn)錄體系選取RNA的量為200ng。反轉(zhuǎn)錄體系見表4.1。表5.2 反轉(zhuǎn)錄體系組成試劑用量Total RNAXRandom Primer (N9)(0.1 g/ L)1 L2×TS Reaction Mix10 LTransScript RT/RI Enz

34、yme Mix1 LRNase-free Water to20 L按照表5.2將反應(yīng)體系加入到200µL離心管中，蓋好蓋子然后在25條件下孵育10min，使隨機引物充分與RNA結(jié)合；在42條件下孵育30min達到充分逆轉(zhuǎn)錄；最后在85條件下孵育5min，充分滅活TransScript®RT酶。在進行反轉(zhuǎn)錄之前將操作臺及移液器用DEPC溶液擦拭幾遍，使RNase失活，實驗過程中所使用的槍頭，離心管都是經(jīng)過去RNase處理的。在實驗過程中佩戴口罩和一次性滅菌手套 ，操作過程要穩(wěn)，準，快，避免被空氣中的RNase降解。反應(yīng)完畢將cDNA放于-20條件下保存?zhèn)溆谩?.1.3 Q-PCR分析通過Rotor-Gene 6軟件使用熒光閾值手動設(shè)定為0.02決定CT值，然后輸入到微軟Excel中，比較delta-delta CT進行了分析。計算根據(jù)下列等式, C T=（CT，目的基因-CT，16S rDNA）D2-7-（CT，對照基因-CT，16S rDNA）D2，空白.F=2-CT。以發(fā)酵第二天的對照組的