1、五子衍宗方主要藥效學成分藥代動力學方法研究項目完成單位：國家藥物及代謝產物分析研究中心項目完成人： 馬 辰 五子衍宗方為中藥經典古方，源自唐代懸解錄。其功用主治為補腎益精，用于治療腎虛腰痛，尿后余瀝，以及不孕不育癥等。中國藥典以成方制劑五子衍宗丸形式收載，其處方組成為：菟絲子400g、枸杞子400g、覆盆子200g、車前子100g和五味子50g。在五子衍宗方中菟絲子和枸杞子為方中的君藥。目前中國藥典對五子衍宗丸僅有性狀和定性鑒別，未有含量測定。 菟絲子為旋花科植物菟絲子Cuscuta chinensis Lam. 的干燥成熟種子，為常用中藥，具有滋補肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉等作用，其中

2、黃酮類化合物為主要成分。目前從菟絲子中提取并鑒定出結構的黃酮類成分有金絲桃苷、槲皮素、紫云英苷、山奈酚等。目前中國藥典2000版一部中，未對菟絲子進行含量測定。菟絲子中含有的主要化學成分以槲皮素及其苷為主，其中金絲桃苷為含量較高的槲皮素苷，因此對菟絲子和五子衍宗方進行含量測定時，以金絲桃苷為指標成分，其理化性質及結構如下： 物理性狀：淡黃色針狀結晶（乙醇），熔點227230（237239分解），比旋度20D=-83。（C=0.2吡啶），易溶于甲醇、乙醇、丙酮及吡啶。 金絲桃苷化學結構：一、五子衍宗方及菟絲子中金絲桃苷的含量測定1 實驗材料及儀器設備1.1 藥品及試劑 金絲桃苷對照品：本所植化室

3、提供，純度達95%以上 五子衍宗方藥材（菟絲子、枸杞子車前子、覆盆子、五味子）：北京同仁堂藥店磷酸（分析純）； 無水乙醇（分析純）；乙腈（色譜純）；Fisher甲醇：（色譜純）；雙蒸水 1.2儀器設備 Waters 2690高效液相色譜儀及996-二極管陣列檢測器，Millennium32色譜軟件，有機相微孔濾膜（0.45µm）針頭濾器，BUCHI 461電熱恒溫水浴箱2 色譜條件選擇菟絲子及五子衍宗方中黃酮類成分較多，其中菟絲子中以槲皮素及其苷為主，五子衍宗方中除菟絲子含有黃酮類成分外，車錢子中也含有車錢苷等黃酮類成分。參考文獻對菟絲子及五子衍宗中的金絲桃苷測定的色譜條件進行了優選

4、。2.1檢測波長的選擇從金絲桃苷的紫外光譜Fig. 1可見，其在254nm和355nm均有較大的吸收，文獻中多以355nm作為對金絲桃苷的檢測波長，主要考慮其它干擾成分在此吸收較低。因此本論文對菟絲子中含量測定時，首先考慮了355nm作為檢測波長，而對五子衍宗方進行含量測定時，其他成分對主峰有干擾，而主要干擾成分在254nm卻有較低的吸收，并與主峰能實現基線分離。因此對五子衍宗方中的金絲桃苷進行含量測定時選用了254nm。圖1 金絲桃苷甲醇溶液的紫外光譜2.2流動相的選擇 首先以流動相甲醇0.5%磷酸（50：50，用三乙胺調pH至3.0），實驗中發現柱效下降很快，分析認為使用三乙胺調pH，對色

5、譜柱的損害太大。考慮到常規C18色譜柱的酸性適用范圍，在上述流動相基礎上分別考察了0.5%醋酸、0.05%三氟乙酸以及0.1%磷酸，從保留時間、分離度和拖尾因子角度進行評價，優選了最佳的流動相組成。最終確定甲醇：乙腈：0.1%磷酸 ( 40:5:55)作為金絲桃苷流動相條件。2.3色譜條件色譜柱：Alltech C18柱（5m，250mm×4.6mm i.d） 流動相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（40：5：55） 流速：0.8mL/min，柱溫：25，檢測波長：355nm（菟絲子含量）；254nm（五子衍宗方含量）3 實驗溶液制備3.1對照品溶液的配制精密稱取金絲桃苷標準品10m

6、g置于10mL的容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，備用。精確量取上述金絲桃苷溶液2mL于10ml容量瓶中，配成200µg/mL的標準溶液。色譜圖見Fig. 2（355nm）和Fig. 3（254nm）。圖2 金絲桃苷的HPLC圖（355nm檢測）圖3 金絲桃苷的HPLC圖（254nm檢測） 3.2菟絲子供試品溶液制備3.2.1提取方法考察（1）提取溶劑的選擇取菟絲子粉6份（過40目篩）各0.4g，精密稱定，置150mL三角瓶中，分別精密加入甲醇、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、50%乙醇和40%乙醇各50mL，稱重，加熱回流提取2h，冷卻至室溫，補重，搖勻，以0.45µ

7、;m濾膜過濾，即得，進樣10µL，計算提取藥材含量。結果見表Tab.1，實驗數據表明以上溶劑中60%乙醇對金絲桃苷的提取率最高。表1 對菟絲子提取溶劑的比較表SolventMeOH40%EtOH50%EtOH60%EtOH80%EtOH95%EtOHsample weight(g)0.40070.40060.40130.39910.40170.4002Content(%)0.3420.3500.3520.3650.3530.297（2）提取時間的比較 精密稱取菟絲子粉4份各0.4g，加入50mL 60乙醇，稱重，加熱回流，分別提取0.5、1、2、3、4h，冷卻至室溫，補重，搖勻，以0

8、.45µm濾膜過濾，即得，進樣10µL，計算提取藥材含量。結果見表Tab.2，實驗數據表明熱回流提取2h已經將菟絲子中的金絲桃苷提取完全。表2 對菟絲子提取時間的比較Time0.5h1h2h3h4hsample weight(g)0.39930.40120.40060.40090.4006Content(%)0.3150.3130.3220.3180.311（3）溶劑用量比較 精密稱取菟絲子粉3份各0.4g，分別加入35、50、60mL 60乙醇，稱重，加熱回流提取2h，冷卻至室溫，補重，搖勻，以0.45µm濾膜過濾，即得，進樣10µL，計算藥材含量。結

9、果見表Tab.3。其中50mL溶劑即能提取完全表3 對菟絲子提取溶劑體積的比較Volume35mL50ml60mLsample weight(g)0.39950.40790.4008Content(%)0.4100.4110.3523.2.2菟絲子供試品溶液制備根據上述條件選擇確定確定菟絲子提取方法為：取菟絲子細粉（過40目篩）0.4g，精密稱定，置150mL三角瓶中，精密加入60%乙醇50mL，稱重，加熱回流提取2h，冷卻至室溫，補重，搖勻，以0.45µm濾膜過濾，即得，進樣10µL。色譜圖見Fig. 4圖4 菟絲子60%乙醇提取液的HPLC圖（355nm）3.3五子衍宗

10、方供試品溶液制備3.3.1五子衍宗方提取方法考察（1）提取溶劑的選擇按處方比例精密稱取菟絲子0.4g、枸杞子0.4g、覆盆子0.2g、車錢子0.1g和五味子0.05g，以上藥材均為細粉（過40目篩）4份，分別精密加入甲醇、80%乙醇、60%乙醇、50%乙醇和40%乙醇各50mL，稱重，加熱回流提取2h，冷卻至室溫，補重，搖勻，以0.45µm濾膜過濾，各進樣10µL，求算溶劑提取的含量。結果見表Tab.4，表明60%乙醇對五子衍宗方中金絲桃苷的提取率最高。表4 五子衍宗方提取溶劑的比較SolventMeOH50%EtOH60%EtOH80%EtOHsample weight

11、（g）1.1631.1661.1621.166content （）0.1130.1060.1150.113（2）提取時間 按處方比例精密稱取五子衍宗方1.15g，加入50mL 60乙醇，稱重，加熱回流，分別提取1、2、3、4h，冷卻至室溫，補重，搖勻，以0.45µm濾膜過濾，各進樣10µL，求算溶劑提取的含量。結果見表Tab.5，實驗數據表明熱回流提取2.0h已經將五子衍宗方中的金絲桃苷提取完全。表5 五子衍宗方提取時間的比較Time1h2h3h4hsample weight（g）1.1611.1571.161.162Content()0.1170.1190.1180.11

12、5（3）溶劑用量比較按處方比例精密稱取五子衍宗方1.15g，分別加入35、50、60mL 60乙醇，稱重，加熱回流提取2h，冷卻至室溫，補重，搖勻，以0.45µm濾膜過濾，各進樣10µL，求算溶劑提取的含量。結果見表Tab.6。其中50mL溶劑即能將復方中的金絲桃苷提取完全。表6 五子衍宗方提取溶劑體積的比較Volume （mL)35mL50ml60mLsample weight （g）1.1641.1611.159Content （）0.1120.1140.1143.3.2五子衍宗方供試品制備根據上述條件選擇，確定五子衍宗方中金絲桃苷的提取方法為：按處方比例精密稱取菟絲子

13、0.4g、枸杞子0.4g、覆盆子0.2g、車錢子0.1g和五味子0.05g，以上藥材均為細粉（過40目篩）。精密加入60%乙醇50mL，稱重，加熱回流提取2h，冷卻至室溫，補重，搖勻，以0.45µm濾膜過濾，即得。色譜圖見Fig. 5（254nm）和Fig. 7（355nm），缺菟絲子藥材的色譜圖見 Fig. 6（254nm）和Fig. 8（355nm）。從色譜圖可以看到，在355nm處干擾組分的色譜峰與金絲桃苷主峰未能完全分離，在254nm處，由于干擾峰吸收較低，對金絲桃苷主峰的影響不大。圖5 五子衍宗方60%乙醇提取液的HPLC圖（254nm）圖6 缺菟絲子的五子衍宗方60%乙醇

14、提取液的HPLC圖（254nm） 圖7 五子衍宗方60%乙醇提取液的HPLC圖（355nm）表8 金絲桃苷的精密度(n=5)4 方法學考察4.1標準曲線的建立 精確量取1mL 200µg/mL的金絲桃苷標準溶液，分別置于25mL、20mL、10mL、5mL和2mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配成一系列的標準品溶液，依“色譜條件”分離，取10µL標準溶液進樣。以標準液濃度（C）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，標準曲線見Fig. 9。計算得回歸方程為Y=25590.84C-3511.23，相關系數R=0.9999，線性范圍為8.13203.20µg/m

15、L。表9 菟絲子測定精密度4.2 最小檢出限以信噪比（S/N）大于3測得金絲桃苷的最小檢出限，測定結果見表Tab.7表7 金絲桃苷的檢測限Hyperoside254nm355nmDetection limits (ng)1.361.744.3 精密度試驗配制高、中、低濃度的金絲桃苷對照品溶液（濃度分別為203.20µg/mL，20.32µg/mL，8.13µg/mL），進樣10µL，連續進樣5次，測得峰面積，金絲桃苷不同濃度的相對標準偏差在0.521.96之間。結果見表Tab.8表8 金絲桃苷的精密度(n=5)Concentration8.13g/mL2

16、0.32g/ mL203.20g/mLPeak area19876751290251747552070955056335109594203905505746514063319999252609551229322067975253165160806203311.2515138.45141744SD3823.8510089.6226654.43RSD%1.881.960.525 菟絲子中金絲桃苷含量的測定5.1菟絲子供試品精密度實驗取菟絲子細粉（過40目篩）0.4g，精密稱定，按“3.2.2菟絲子供試品溶液制備”項，制備供試品溶液，連續進樣5次，測得峰面積。結果見表Tab.9，其RSD為0.91%

17、。表9 菟絲子測定精密度Peak area886810891043883854874905872011Average area881724.6SD8032.57RSD%0.915.2 重復性實驗取同一批菟絲子樣品，精密稱取0.4g，共5份，各按“3.2.2菟絲子供試品溶液制備”項下制備，各進樣10µL，求算含量。結果見表Tab.10。其RSD為0.76%表10 菟絲子測定重復性 Sample12345Sample weigh(g)0.40120.40660.40220.40800.3991Content(%)0.4130.4190.4110.4150.416Average conte

18、nt0.415SDRSD%0.003160.765.3 穩定性實驗 取菟絲子細粉（過40目篩）0.4g，精密稱定，按“3.2.2菟絲子供試品溶液制備”項，制備供試品溶液，分別在2、4、6、8、10、12h連續進樣，測得峰面積。結果見表Tab.11，其RSD為1.29%，表明菟絲子供試品在測定時間12h內保持穩定。表11 菟絲子提取液的穩定性Time（h)24681012Peak area887410895655881845863950871081879336Average area879879.5SD11321.63RSD%1.295.4 回收率實驗精密稱取已測定含量的菟絲子粉9份，各 0.4

19、g，隨機分成3組，分別精密加入金絲桃苷對照品溶液（1.4mg/mL）1.2、1、0.8ml，按“3.2.2菟絲子供試品溶液制備”項下制備，各進樣10µL依色譜條件下進行測定。結果見表Tab.12，高、中、低加入量的平均回收率為98.8-100.0。 加入標準品后測得量（）樣品含量（）回收率（） × 100 加入標準品量表12 菟絲子中金絲桃苷的測定回收率Volume(mL)Sample weight(g)Amount in sample(mg)Amount added(mg)Total amount determined(mg)Recovery(%)Average(%)0.

20、40131.681.122.81101.010.8(n=3)0.40651.701.122.82100.02100.00.40381.691.122.8099.070.40011.671.403.0699.291.0(n=3)0.40101.711.403.13101.0299.60.40211.681.403.0698.590.40901.691.683.3397.611.2(n=3)0.40791.711.683.3798.7798.80.40861.711.683.39100.035.5 菟絲子樣品測定采用外標法，每次實驗以隨行標準計算含量，計算公式如下： MrAi菟絲子中金絲桃苷的含量

21、（） ×100%MArMr： 標準物質的量（g）Ar： 標準物質峰面積M: 菟絲子樣品重量（g）Ai： 樣品中成分金絲桃苷的峰面積精密稱取菟絲子粉6份各0.4g ，按“菟絲子供試品溶液制備”項下操作。各進樣10µL，按外標法計算含量。菟絲子結果見表Tab.13，菟絲子中金絲桃苷的平均含量為0.419%（g/g），RSD為2.98%。表13 菟絲子中金絲桃苷的含量測定結果(n=6)Sample123456Sample weigh(g)0.40030.40800.40690.40820.40400.4008Content（）0.4140.4170.4190.4110.4440.

22、411Average content（）0.419RSD%2.986. 五子衍宗方中金絲桃苷含量的測定6.1五子衍宗方供試品精密度實驗按處方比例精密稱取五子衍宗方樣品1.15g，按“3.3.2五子衍宗方供試品溶液制備”項，制備供試品溶液，連續進樣5次，測得峰面積。結果見表Tab.14，其RSD為0.32% 表14 五子衍宗方測定精密度Peak area10289441020762102298610223661021543Average area1023320SD3253.93RSD%0.326.2五子衍宗方供試品重復性實驗 按處方比例，精密稱取五子衍宗方樣品1.15g，共5份，按“3.3.2五

23、子衍宗方供試品溶液制備”項下制備，各進樣10µL，求算含量。結果見表Tab.15。其RSD為1.43%.表15 五子衍宗方測定重復性sample12345sample weigh（g）1.15431.15651.15691.15591.1612Content（）0.1160.1170.1140.1140.113Average content（）0.115RSD%1.436.3五子衍宗方供試品穩定性實驗按處方比例精密稱取五子衍宗方樣品1.15g，按“3.3.2五子衍宗方供試品溶液制備”項，制備供試品溶液，分別在2、4、6、8、10、12連續進樣，測得峰面積。結果見表Tab.16，其RS

24、D為0.55%，表明五子衍宗方供試品中測定時間12h內保持穩定。表16 五子衍宗方測定溶液穩定性Time（h）24681012Peak area102981810128101023534101994910232651024561Average1022323SD5651.03RSD%0.556.4 回收率實驗按處方比例精密稱取五子衍宗方樣品1.15g，共9份，隨機分成3組，分別精密加入金絲桃苷對照品溶液（1.414mg/mL）1.2、1.0、0.8ml，按“3.3.2五子衍宗方供試品溶液制備”項下制備，各進樣10µL依色譜條件下進行測定。按下列公式計算，結果見表Tab.17，高、中、低

25、加入量的平均回收率為99.2-102.7。 加入標準品后測得量（）樣品含量（）回收率（） × 100 加入標準品量表17 五子衍宗方中金絲桃苷的測定回收率Volume(mL)Sample weight(g)Amount in sample(mg)Amount added(mg)Total amount determined(mg)Recovery(%)Average(%)1.1511.6851.1312.864104.10.8(n=3)1.1531.6801.1312.848102.7102.71.1481.6861.1312.824101.21.1531.6891.4143.093

26、99.31(n=3)1.1551.6821.4143.136103.4101.11.1511.6901.4143.118100.61.1581.6931.6973.431102.31.2(n=3)1.1541.6781.6973.37299.599.21.1501.6771.6973.30195.76.5 五子衍宗方的樣品測定 同“5.5 菟絲子樣品測定”項，亦采用外標法，每次實驗以隨行標準計算含量，計算公式如下： MrAi復方中金絲桃苷的含量（） ×100%MAr式中：Mr-標準物質的量（g）；Ar- 標準物質峰面積；M-五子衍宗方樣品重量（g）；Ai-樣品中成分金絲桃苷的峰面積按

27、處方比例精密稱取6份各1.15g ，按“五子衍宗方供試品溶液制備”項下操作。各進樣10µL，按外標法計算含量。結果見表Tab. 18，在五子衍宗方中金絲桃苷的平均含量為0.116%（g/g），RSD為1.76。表18 五子衍宗方中金絲桃苷含量測定結果Sample123456Sample weight（g）1.15501.15751.15491.15511.16081.1613Content（）0.1170.1190.1150.1150.1160.113Average content（）0.116RSD%1.76二、菟絲子及五子衍宗方大鼠血漿藥代動力學研究本研究通過建立RP-HPLC法

28、，以金絲桃苷為指標成分，對五子衍宗方藥代動力學進行了可行性研究。測定了五子衍宗方80乙醇提取物，菟絲子80乙醇提取物，及純品金絲桃苷大鼠腹腔給藥后，不同時間的血漿藥物濃度。并以中國藥理學會數學藥理專業委員會編制的3P87軟件處理時間平均血藥濃度數據，以擬合優度（goodness of fit）和AIC判斷曲線擬和程度，選擇房室模型，計算得到了藥代動力學參數。1 實驗材料及儀器設備1.1 藥品及試劑 金絲桃苷對照品 本所植化室提供，純度達95%以上五子衍宗方藥材 （菟絲子、枸杞子車前子、覆盆子、五味子） 購自北京同仁堂藥店無水乙醇（分析純） 北京化工廠肝素鈉 常州新華活性材料研究所 磷酸（分析純

29、） 北京化工廠丙二醇（分析純） 北京化工廠乙腈（色譜純） Fisher公司產品；甲醇（色譜純） 江蘇淮安塑料制品廠；雙蒸水 北京協和藥廠；氯化鈉注射液 石家莊制藥集團。1.2 動物 Wistar 雄性大鼠 200-220g，購自中國藥品生物制品檢定所動物中心，許可證編號：SCXK11-00-00101.3儀器設備Waters 2690高效液相色譜儀及996-PDA型檢測器，北京醫用離心機廠制造的LD5-2A離心機，江蘇醫療器械廠制造的液體快速混合器，微量移液器（20-200mL,德國Fisherbrand）2色譜條件的選擇2.1檢測波長的選擇 根據金絲桃苷的紫外吸收，對254nm和355nm兩

30、波長進行了考察。實驗中發現，在254nm下，血漿中的內源性物質對金絲桃苷有較強的干擾作用。在五子衍宗方中測定金絲桃苷含量時采用了254nm，目的是消除其他組分的干擾，但在大鼠腹腔注射五子衍宗方乙醇提取物后取得的血漿樣品中，由于復方的干擾組分進入血漿中含量較低，對血漿中金絲桃苷主峰未有影響，而內源性物質在254nm下確對主峰干擾較大，因此在五子衍宗方藥代動力學研究中亦選取355nm作為檢測波長。2.2流動相的選擇 參考“第二章 菟絲子及五子衍宗方金絲桃苷含量的測定”中優選的流動相條件，以甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（40：5：55）為流動相，對金絲桃苷純品、菟絲子乙醇提取物和五子衍宗方乙醇提取

31、物大鼠腹腔給藥后血漿中金絲桃苷的色譜條件進行了考察。實驗發現，大鼠腹腔注射五子衍宗方提取物的血漿樣品，在給藥40min后出現代謝產物，在上述流動相條件下，與金絲桃苷不能實現基線分離，因此在原流動相甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（40：5：55）基礎上，進行了流動相比例的調整，其中在甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（16：14：70）流動相下，金絲桃苷與五子衍宗方中的代謝產物成分實現基線分離。色譜圖見Fig.10和Fig.11。圖10 Wistar大鼠腹腔注射菟絲子80%乙醇提取物40分后血漿的HPLC圖tR=10.86min 金絲桃苷（流動相：甲醇乙腈-0.1%磷酸40：5：55）圖11 Wis

32、tar大鼠腹腔注射五子衍宗方80%乙醇提取物40分后血漿的HPLC圖tR=15.31min 金絲桃苷（流動相：甲醇乙腈-0.1%磷酸16：14：70）2.3內標的選擇 根據內標選擇的原則，選擇理化性質與金絲桃苷相近的化合物。對野黃芩苷、蘆丁等20多種物質進行了測試，未找到符合條件的內標物。曾經澤在生物藥物分析中指出，一定要明確不是所有內標法都能提高分析結果的精密度，在某些情況下，如樣品沉淀蛋白后直接進樣、柱切換進樣，外標法反而比內標法好且省事，即使樣品經萃取處理，如內標選擇不合適，同樣外標法會比內標法好。由于未找到合適的內標，樣品處理又采用甲醇沉淀蛋白后直接進樣，在這種情況下本論文采用外標法進

33、行定量計算。2.4 色譜條件 根據“2.1檢測波長的選擇”和“2.2流動相的選擇”項下篩選的波長和流動相，對金絲桃苷純品、菟絲子提取物和五子衍宗方提取物大鼠腹腔給藥后的血漿樣品分別采取的色譜條件如下：色譜柱：Alltech C18柱（5m，250mm×4.6mm i.d）流動相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（40：5：55）適用于金絲桃苷和菟絲子乙醇提取物大鼠腹腔給藥的藥代動力學研究。流動相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（16：14：70）適用于五子衍宗方乙醇提取物大鼠腹腔給藥的藥代動力學研究。流速： 0.8mL/min，檢測波長355nm。在上述色譜條件下，空白血漿、空白血漿加

34、金絲桃苷標準品和大鼠腹腔給藥金絲桃苷純品及菟絲子提取物腹腔給藥和五子衍宗方提取物灌胃給藥的HPLC譜圖如Fig.12，Fig.13（流動相） ，Fig.14（流動相），Fig.15，Fig.16和Fig.11所示。結果顯示金絲桃苷純品，以及菟絲子提取物和五子衍宗方提取物中的色譜峰均不受內源性雜質峰的干擾，測定的專屬性強。圖12 HPLC圖圖13 空白血漿加金絲桃苷的HPLC-DAD圖tR=15.44min 金絲桃苷（流動相：甲醇乙腈-0.1%磷酸16：14：70）圖14空白血漿加金絲桃苷的HPLC-DAD圖tR=10.80min 金絲桃苷（流動相：甲醇乙腈-0.1%磷酸40：5：55）圖15

35、Wistar大鼠腹腔注射金絲桃苷40分后血漿的HPLC- DAD圖（流動相：甲醇乙腈-0.1%磷酸40：5：55）圖16 Wistar大鼠腹腔注射菟絲子80%乙醇提取物40分后血漿的HPLC-DAD圖（流動相：甲醇乙腈-0.1%磷酸40：5：55）3 血漿樣品預處理方法的選擇3.1 提取條件及提取溶劑選擇 采用蛋白沉淀試劑沉淀血漿蛋白，過濾后直接進樣和混合溶劑（含蛋白沉淀劑）沉淀蛋白，上清液吹干復溶進樣比較。（1） 沉淀蛋白過濾后直接進樣蛋白沉淀試劑選擇對金絲桃苷溶解性較好的甲醇、乙醇、丙酮和乙腈。提取方法為：以含有金絲桃苷 1.0µg/mL溶液0.1mL為待提取液（加入空白血漿0.

36、2mL），加入0.5mL溶劑，渦流震蕩1min。超聲提取10min，3000轉/min離心10min(分離有機相中的蛋白)，取上清液，微孔濾膜過濾，進樣30µl。所測得金絲桃苷色譜峰面積，與標準溶液直接進樣分析所得峰面積值對比，提取率見表19。表19 不同蛋白沉淀試劑對金絲桃苷的提取率Deproteined SolventCH3OHC2H5OHCH3COCH3CH3CNExtract percent(%)71653534（2） 上清液吹干復溶進樣 考察了甲醇和乙酸乙酯混合溶劑沉淀蛋白后氮氣吹干，殘渣復溶進樣，比較了甲醇與乙酸乙酯2:1，1:1和1:2不同比例下的提取率。 提取方法為：

37、以含有金絲桃苷 1.0µg/mL溶液0.1mL為待提取液（加入空白血漿0.2mL），加入3ml溶劑，渦流震蕩1min，3000轉/min離心10min，取上清液，氮氣吹干溶劑，殘渣用500µl甲醇復溶，微孔濾膜過濾，進樣30µl。所測得金絲桃苷色譜峰面積，與標準溶液直接進樣分析所得峰面積值對比。提取率見表20。表20 不同比例甲醇-乙酸乙酯混合溶劑對血漿中金絲桃苷的提取率比較Extract solvent（MeOH：EtOAc）2: 11: 11: 2Extract percent(%)676054綜合比較兩種方法，甲醇沉淀蛋白后直接進樣，方法簡單，回收率相對較高

38、，因此以其作為血漿中金絲桃苷的提取方法。3.2血漿樣品處理根據“3.1 提取條件及提取溶劑”項下，血漿樣品的處理方法為：取大鼠血漿0.2mL，置于0.5mL Epphendorf 塑料管中，加入甲醇溶液0.3mL，渦流振蕩3min，混勻，離心10min（3000轉/min），取上層溶液，用0.45m微孔針頭濾器過濾，取濾液30L進行HPLC分析。4 方法學考察4.1 標準曲線與線性范圍 取大鼠空白血漿0.2mL，置于1mL Epphendorf塑料管中，加入金絲桃苷系列標準溶液300L，分別配制成相當于濃度為0.30，0.60，1.20，1.50，3.00，6.00和15.00g/mL的血漿樣

39、品，按照“3.2.血漿樣品處理”項下操作，建立標準曲線。以血漿中待測物濃度（C）為橫坐標，待測物的峰面積為縱坐標，進行回歸計算，求得直線回歸方程，建立標準曲線。以流動相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（40：5：55），計算得到的回歸方程為Y=27436.38C4300.45，R=0.9997，標準曲線見Fig.17，線性范圍在0.30-15.00g/mL。以流動相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（16：14：70），計算得到的回歸方程為Y=21242.47C3721.16，R=0.9985，標準曲線見Fig.18。上述方法在0.30-15.00g/mL范圍內線性良好，為減少日間誤差，測定樣品

40、時，均做隨行標準。圖17 血漿中金絲桃苷測定標準曲線（流動相：甲醇乙腈-0.1%磷酸40：5：55）圖18 血漿中金絲桃苷測定標準曲線（流動相：甲醇乙腈-0.1%磷酸16：14：70）4.2 最低檢測限以信噪比（S/N）大于3，以兩種流動相條件測得金絲桃苷在血漿中的最低檢測濃度均為為0.30g/mL。4.3 絕對萃取率實驗取金絲桃苷標準溶液0.4、1.0和10.0g/mL三個濃度各300L(平行做三個)，加入5mL具塞離心管中，各加入200L空白血漿，其它按“3.2血漿樣品處理”項下操作，所測得金絲桃苷的色譜峰面積值，與標準溶液直接進樣分析所得峰面積值對比，求得各濃度點的平均絕對萃取率。見表T

41、ab.22表22 不同濃度的絕對萃取率ConcentrationExtraction percent(%)MeanRSD(%)0.4µg/ml60.862.168.863.96.711µg/ml69.373.968.570.64.1210µg/ml79.282.276.679.33.534.4精密度試驗配制高、中、低濃度的金絲桃苷對照品溶液（濃度分別為200µg/mL，20µg/mL，8µg/mL），進樣10µL，連續進樣5次，測得峰面積，金絲桃苷不同濃度的相對標準偏差在0.521.96之間。結果見表Tab.23.表23 H

42、PLC法測定血漿中金絲桃苷的精密度(n=5)Concentration8g/mL20g/ mL200g/mLPeak area19876751290251747552070955056335109594203905505746514063319999252609551229322067975253165160806203311.2515138.45141744SD3823.8510089.6226654.43RSD%1.881.960.525 給藥提取物的制備與測定 5.1金絲桃苷純品給藥溶液的制備精密稱取40.0mg金絲桃苷于20mL容量瓶中，加入20%丙二醇超聲助溶，加生理鹽水配成2mg/

43、mL的金絲桃苷注射液供大鼠腹腔給藥，按照0.5mL/100g給藥，相當于根據大鼠體重10mg/kg給藥。5.2 菟絲子、五子衍宗方樣品處理方式 五子衍宗方中五味藥材均為種子類藥材，其中含有大量的油脂、多糖及各種色素等，首先考察了60，80，95乙醇的提取物，其中60乙醇提取物中含有大量多糖，及部分油脂。提取烘干過程中呈粘稠狀，無法做成制劑形式。部分提取物干粉采用純品金絲桃苷制劑形式形成混懸物，無法給藥。曾嘗試采用大孔樹脂進行分離純化提取物，由于提取物中含有多糖，水溶性粘液質等成分，無法進行洗脫，洗脫柱堵塞。選擇以80乙醇提取，減少對多糖及其他水溶性色素的提取。提取前以石油醚脫脂2h，去除大部分

44、的油脂，利于提取物制成干粉。比較了80和95乙醇對金絲桃苷的提取率，以80乙醇提取率較高，因此選擇其作為提取溶劑。5.3菟絲子乙醇提取物大鼠腹腔給藥溶液的制備與測定稱取80g菟絲子粉，加入800mL石油醚脫脂2h，殘渣以2000mL80乙醇提取3h，過濾，再加入1000 mL80乙醇提取3h。減壓回收溶劑，得干粉11.47g,出膏率為14.34%。5.3.1菟絲子提取物干粉含量測定精密稱取0.102g干粉于10mL容量瓶中，加入甲醇，超聲提取30min后，定容至10mL。提取液經0.45m濾膜過濾后，進樣10L，按“第二章 菟絲子及五子衍宗方金絲桃苷含量的測定”中優選的流動相條件，以甲醇-乙腈

45、-0.1%磷酸水溶液（40：5：55）為流動相，按外標法定量。結果菟絲子提取物干粉中金絲桃苷的含量為28.6mg/g。5.3.2菟絲子提取物給藥溶液的制備精密稱取3.5g提取物干粉于100mL三角瓶中，加入20%丙二醇超聲助溶，加生理鹽水配置成40mL相當于2.5mg/mL的金絲桃苷注射液，給藥前以0.45µm濾膜過濾，按照體重0.5mL/100g給藥，折算為菟絲子藥材為3g/kg腹腔給藥，相當于純品金絲桃苷12.5mg/kg給藥。5.4五子衍宗方乙醇提取物大鼠腹腔給藥溶液的制備與測定按處方比例稱取菟絲子粉80g，枸杞子粉80g，覆盆子粉40g，五味子粉10g，車前子粉20g。加入1

46、500mL石油醚脫脂2h，殘渣提取兩次，各3h，溶劑用量為2500mL和1500mL 。減壓回收溶劑，得干粉70.8g，出膏率為30.78%。5.4.1五子衍宗方提取物干粉含量測定精密稱取0.104g干粉于10mL容量瓶中，加入甲醇，超聲提取30min后，定容至10mL。提取液經0.45m濾膜過濾后，進樣10L，按“第二章 菟絲子及五子衍宗方金絲桃苷含量的測定”中優選的流動相條件，以甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（40：5：55）為流動相，按外標法定量。五子衍宗方干粉中金絲桃苷的含量為2.07mg/g。5.3.2五子衍宗方提取物給藥溶液的制備精密稱取10g五子衍宗方80乙醇提取物于100mL三

47、角瓶中，加入20%丙二醇超聲助溶，加生理鹽水配置成40mL相當于0.52mg/mL的金絲桃苷注射液，給藥前亦以0.45µm濾膜過濾，按照體重1mL/100g給藥，折算為五子衍宗方原藥材為8.12g/kg腹腔給藥，以菟絲子藥材折算為3g/kg腹腔給藥，相當于純品金絲桃苷5.2mg/kg給藥。6 金絲桃苷純品、菟絲子提取物、五子衍宗方提取物大鼠體內藥代動力學研究6.1金絲桃苷大鼠腹腔給藥實驗取雄性Wistar大鼠12只，按體重隨機分成2組，給藥前置代謝籠禁食14h，稱重，腹腔給藥10mg/kg，根據預實驗結果，設定11個采血時間點：2，5，8，12，15，20，30，40，50，75，9

48、0（min）。兩組動物交替取血，每點自眼眶靜脈叢采血約0.5mL，置肝素化塑管中，3500/min離心10min，分離血漿，按“3.2.血漿樣品的提取”進行樣品處理后，進行HPLC分析。金絲桃苷的藥代動力學數據及藥時曲線分別見Tab.25和 Fig .19。圖19 Wistar大鼠腹腔注射金絲桃苷的藥時曲線表25 Wistar大鼠腹腔注射金絲桃苷后金絲桃苷的血藥濃度Time（min)AverageSDPlasma concentration（g/mL)(g/mL)(g/mL)12345622.191.053.682.612.642.131.430.6753.230.433.023.863.09

49、2.9485.422.206.187.395.965.916.021.07126.123.1511.65.956.465.215.701.82155.211.853.464.075.727.59204.651.475.734.685.175.604.931.76303.370.503.463.194.012.81403.261.344.663.392.663.534.360.95502.290.721.841.623.222.49751.340.511.150.872.21.351.15901.270.601.241.551.490.772.130.44用中國藥理學會數學藥理專業委員會編制的3

50、P87軟件處理時間平均血藥濃度數據，以擬合優度（goodness of fit）和AIC判斷曲線擬和程度，選擇房室模型。金絲桃苷大鼠血漿濃度時間曲線符合一室開放模型，以平均值擬合的主要藥動學參數見Tab.26。表26 Wistar大鼠腹腔注射金絲桃苷的藥代動力學參數ParameterUnitValuesAµg/mL7.17kemin-10.0211kamin-10.204T1/2(Ka)min3.39T1/2(Ke)min32.77T(peak)min12.41C(max)µg/mL4.95AUC304.05CL/F(s)0.0329V/F（c）1.566.2 菟絲子乙醇提取物在大鼠體內藥代動力學研究取雄性Wistar大鼠18只，按體重隨機分成3組，給藥前置代謝籠禁食14h，稱重，菟絲子乙醇提取物腹腔給藥(相當于金絲桃苷12.5mg/kg)，根據預實驗結果，設定10個采血時間點：2，5，8，10，12，20，30， 50，60，90（min）。三組動物交替取血，每點自眼眶靜脈叢采血約0.5mL，置肝素化塑管中，3500轉/min離心10min，分離血漿，按“3.2.血漿樣品的提取”進行樣品處理后，進行HPL