1、聚丙烯酰胺凝膠電泳法 (1) 學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理。(2) 掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板及圓盤電泳的操作技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠為載體的一種區(qū)帶電泳。該凝膠由丙烯酰胺Acr和交聯(lián)劑N，N甲叉雙丙烯聚酰胺Bis聚合而成。聚丙烯酰胺凝膠電泳利用電泳和分子篩的雙重作用分別物質(zhì)。Acr和Bis單獨存在或混合在一同時是穩(wěn)定的，但在具有自在基團體系時就能聚合。引發(fā)自在基團的方法有化學(xué)法和光化學(xué)法兩種。化學(xué)法的引發(fā)劑是過硫酸胺Ap，催化劑是四甲基乙二胺TEMED；光化學(xué)法是以光敏感物核黃素來替代過硫酸胺，在紫外光照射下引發(fā)自在基團。聚丙烯酰胺凝膠電泳的凝膠體系有延續(xù)和不延續(xù)電泳之分。不延

2、續(xù)電泳系統(tǒng)由濃縮膠和分別膠兩種膠體組成，兩種膠體分別由不同的pH 的緩沖液和膠貯液配制而成，構(gòu)成孔徑不同的兩種膠體。不延續(xù)電泳系統(tǒng)電泳分別過程中包括三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)、電泳分別的電荷效應(yīng)和凝膠的分子篩效應(yīng)。本次實驗采用不延續(xù)電泳系統(tǒng)PAGE，經(jīng)過三種效應(yīng)將血清中各蛋白質(zhì)組分按其分子大小、電荷多少不同進展分別。聚丙烯酰胺凝膠電泳有圓盤電泳和垂直板電泳之分，但兩者的原理完全一樣，只是所用的電泳槽不同。由于時間問題，本次實驗將分兩組進展，一組運用圓盤，一組運用垂直板。夾心式垂直板電泳槽，圓盤電泳槽，電泳儀，直流穩(wěn)壓電源，玻璃板1313，注射器及微量注射器抽氣泵，枯燥器，培育皿，玻璃棒，吸

3、量管，燒杯，滴管，玻璃管，薄膜手套，濾紙，日光燈制備分別膠、濃縮膠有關(guān)試劑： 凝膠緩沖液，分別膠儲存液，0.8%過硫酸銨； 濃縮膠緩沖液，濃縮膠儲存液，40%蔗糖溶液，核黃素。Tris-甘氨酸電極緩沖液PH8.3已參與溴酚藍指示劑的血清樣品染色液氨基黑1%瓊脂糖溶液脫色液7%乙酸溶液由學(xué)生本人配制一、垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳1.凝膠的制備：1安裝夾心式電泳槽 將長短玻璃板分別插到U形硅橡框的凹形槽中留意勿用手接觸灌膠面的玻璃，在長玻璃板下端與硅膠橡框交界的縫隙內(nèi)參與已融化的1%瓊脂糖且兩玻璃板內(nèi)下端處處有瓊脂糖其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂中應(yīng)防止有氣泡，瓊脂凝固后，將硅膠橡框裝入電泳槽內(nèi)，以

4、對角線的方式將螺絲帽旋緊。 試劑稱號試劑稱號 用量用量ml) 分別膠緩沖液ph8.9 2.5ml 分別膠凝膠貯液 5.0ml 蒸餾水 2.5ml將以上三種試劑混合均勻后，置于真空枯燥器中 抽氣10min過硫酸銨，置于真空枯燥器中，抽氣10min 10.0ml按上表格配膠，二者抽氣后混合均勻，小心不要在溶液中攪出氣泡，以免過多接觸空氣。迅速用滴管將混合后的分別膠裝在二塊玻璃板之間至短板上端約3-4cm，并用注射器在起上面加一層水約1mm使凝膠構(gòu)成時有一程度面，留意加水時，不要引起膠面的大動搖。在室溫中放置，當(dāng)兩界面出現(xiàn)不同折射率時闡明已凝膠，時間大約40 分鐘，以出現(xiàn)折射率不同的界面為準(zhǔn)，再室溫

5、下放置非常鐘，使凝膠充分。將分別膠上層的水倒去，再用濾紙吸去多余的水留意不要碰破膠面，為下一步做預(yù)備。 試劑稱號試劑稱號用量用量ml) 濃縮膠緩沖液ph6.7) 0.5ml 濃縮膠貯液 1.0ml 40%蔗糖 2.0ml將以上三種試劑混合均勻后，置于真空枯燥器中， 抽氣10min 核黃素 0.5ml按上表所示配膠，抽氣后加核黃素0.5ml,混勻，立刻參與到已配制好的分別膠上面至短玻璃板上端約0.5cm，插入加樣梳，放于日光燈下10 分鐘左右濃縮膠就開場凝膠，3050分鐘左右凝好凝縮膠變?yōu)槿榘咨珵闇?zhǔn)，凝好后小心拔去加樣梳。將 Tris甘氨酸電極緩沖液稀釋10 倍后倒入電泳安裝的左、右槽中，短玻板

6、一側(cè)要略微超越玻板，長玻板一側(cè)只需越過電泳絲的高度。用微量注射器經(jīng)過緩沖液在每個加樣凹槽中參與約5ul的樣品。將樣品端(短玻璃的一邊)接直流穩(wěn)壓電泳儀的負極，接通冷卻水，開場電泳。開場時電流控制在10mA，待樣品進入分別膠時，將電流調(diào)至30mA左右。當(dāng)藍色染料遷移至間隔橡膠框下緣瓊脂界面處0.5cm 左右時，電泳完成。將緩沖液回收至試劑瓶中，還可用1-2 次留意將正負級的緩沖液分開回收。4.剝膠 將固定螺絲旋松，取出硅橡膠框，將一塊玻璃板悄然剝開，然后用玻璃棒將膠板取下放入培育皿中。5.固定，染色 在培育皿中倒入氨基黑染色液至覆蓋膠板，染色分鐘左右，此時染色與固定同時進展。染色液要回收利用6.

7、脫色 用 7%乙酸浸泡數(shù)次，直至背景藍色脫去。1.凝膠的制備：1安裝圓形玻管 將洗凈的玻璃管烘 干后用橡膠玻璃頭封 嚴(yán)，放置在一邊等待 灌膠。 (2) 分別膠制備 按垂直板的方案進展配膠，混勻后迅速用滴管分裝在玻璃管中至玻璃管上端約2-3cm，并用注射器在起上面加一層水約1mm使凝膠構(gòu)成時有一程度面，在室溫中放置，當(dāng)兩界面出現(xiàn)不同折射率是闡明已凝膠，將分別膠上層的水倒去，再用濾紙吸去多余的水留意不要碰破膠面，為下一步做預(yù)備。(3) 濃縮膠制備同垂直板： 按垂直板的方案進展配制，配制好后，立刻參與到已配制好的分別膠上面至短玻璃板上端約1cm，然后放于日光燈下10 分鐘左右濃縮膠就開場凝膠，305

8、0 分鐘左右凝好凝縮膠變?yōu)槿榘咨珵闇?zhǔn)。2.加樣將 電極緩沖液稀釋10 倍后倒入電泳安裝的上.下槽中留意需沒過玻璃管的上下端，用微量注射器經(jīng)過緩沖液在每個玻璃管的凝膠外表加約5ul 的樣品3.電泳將樣品端(上槽)接直流穩(wěn)壓電泳儀的負極，下槽接直壓電泳儀的正極。開場時電流控制在1-2mA/管，待樣品進入分別膠時，將電流調(diào)至5mA 左右/管。當(dāng)藍色染料遷移至間隔玻璃管下緣1-2cm 左右時，停頓電泳。將緩沖液回收至試劑瓶中留意正負極分開回收。4.剝膠將玻璃管從電泳槽中取下，用注射器吸滿自來水后將針頭插到凝膠與管壁之間，推進注射器，使針頭在管壁和膠之間前進，膠條在水的壓力及光滑的作用下自玻管中脫出，將

9、其放入培育皿中。5.固定，染色，脫色同垂直板由于與凝膠集合有關(guān)的硅橡膠條、玻璃板外表不光滑干凈，在電泳時會呵斥凝膠板與玻璃板或硅橡膠條剝離，產(chǎn)生氣泡或滑膠；剝膠時凝膠板易斷裂，為防止此景象，所用器材均應(yīng)嚴(yán)厲地清洗。安裝電泳槽和鑲有長、短玻璃板的硅橡膠框時，位置要端正，均勻用力旋緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏。用瓊脂糖封底及灌凝膠時不能有氣泡，以免影響電泳時電流的經(jīng)過。灌膠時，假設(shè)擔(dān)憂瓊脂封底不結(jié)實，那么可在上、下貯槽中倒入蒸餾水，液面上面不能超越上貯槽的短玻璃板，防止蒸餾水進入凝膠中。其作用是添加壓力，防止凝膠液滲漏。濃縮膠凝膠完全聚合后，必需放置30min左右，使其充分“老化后，才干悄然取出樣品槽模