1、分子克隆技術實驗操作手冊 2005生命科學技術學院課程簡介分子克隆技術是指 DNA的無性繁殖技術。分子克隆技術課程主要是針對生物技 術專業、生物科學專業、生命科學與技術基地班本科生及生物學類專業研究生而開 設的實驗課。實驗內容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分 子克隆和分子雜交兩大部分：分子克隆技術： DNA重組技術是分子生物學的核心內容。本實驗利用質粒載體 克隆外源 DNA片段，通過這個實驗大家可以掌握質粒載體的抽提、 外源 DNA的準備、 酶切、連接及感受態細胞的制備、 連接產物的轉化以及陽性克隆子的鑒定和驗證等。分子雜交技術：實驗室常用的分子雜交技術主要有 Southe

2、rn blotting ， Northern blotting ， Western blotting 及 Dot blotting 等。 Southern blotting 是通過用一種或多種限制性內切酶消化基因組或其它來源的DNA，經過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離酶切所得的片段，隨后 DNA在原位發生變性并從凝膠轉移到一固相 支持物上（硝酸纖維素膜或尼龍膜） 。DNA轉移至固相支持物的過程中各 DNA的相對 位置保持不變，用一定方法 （如放射性同位素 ） 標記的 DNA探針與固著在膜上的 DNA 雜交，經 X-光片自顯影顯現出與探針 DNA互補的 DNA電泳條帶的位置，然后進行分 析。本實驗要求

3、掌握植物總 DNA的抽提、質量檢測、限制性內切酶操作、 DNA的瓊 脂糖凝膠電泳、轉膜、探針的制備、同位素操作等方面的實驗技術。在轉錄水平上 研究和了解基因的表達與調控是分子生物學和基因操作的重要內容。為讓學生初步 了解有關 RNA 的操作過程注意事項，我們還列出 Northern blotting 的操作步驟以供 選擇。目錄系列一 分子克隆技術 4實驗一 質粒的制備 4實驗二 DNA 的瓊脂糖凝膠電泳 5實驗三 外源 DNA 片段在質粒載體中的克隆 7實驗四 感受態細胞的制備 9CaCl2 感受態細胞的制備實驗步驟 9電轉化法制備大腸桿菌感受態細胞的實驗步驟 10實驗五 質粒的轉化及轉化子的

4、鑒定 11熱激法轉化實驗步驟： 11質粒電轉化大腸桿菌感受態細胞操作步驟 12實驗六 PCR技術 12系列二 Southern 雜交技術 14實驗一 植物總 DNA 的快速少量抽提( CTAB 法) 14實驗二 總 DNA 質量檢測及酶切 15實驗三 電泳、轉膜 16實驗四 Southern Blotting 18系列三 Northern Blotting 24實驗一 RNA Extraction (mini prep) 24實驗二 RT-PCR (Reverse transcription PCR) 26實驗三 RNA 的電泳，轉膜和雜交 28附錄 試劑配方 29一 細菌培養試劑 30二 質

5、粒抽提試劑 30三 DNA 操作試劑 31四 RNA 操作試劑 34Stock Solution: 34Work Solution 35系列一 分子克隆技術實驗一 質粒的制備質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有 重要作用。質粒的分離與提取是最常用、最基本的實驗技術。質粒的提取方法很多，大多包括 3 個主要步驟：細菌的培養、細菌的收集和裂 解、質粒 DNA 的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例，介紹質粒的抽提過程。實驗目的： 掌握堿裂解法抽提質粒的原理、步驟及各試劑的作用。實驗材料： 含有質粒 pUC18載體的大腸桿菌菌液，克隆有水稻外源片段的 BAC 的 大腸桿菌

6、菌液。實驗原理： 在 pH 12.0 12.6堿性環境中，細菌的線性大分子量染色體 DNA 變性分 開，而共價閉環的質粒 DNA 雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態。 將 pH 調 至中性并有高鹽存在及低溫的條件下， 大部分染色體 DNA 、大分子量的 RNA 和蛋白質在去污劑 SDS的作用下形成沉淀， 而質粒 DNA 仍然為可 溶狀態。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體 DNA 、RNA 及蛋 白質，質粒 DNA 尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質粒 DNA 。實驗步驟：1. 取含有 pUC18 質粒的大腸桿菌菌液于 LA 培養基上 37過夜培養；2. 用無菌牙簽挑取單菌落， 接種于含

7、有 Amp 抗生素的 LB 培養基中，37搖床 250 r/min 過夜培養；3. 吸取 1.5 ml菌液，12000 g離心 2 分鐘，收集菌體，倒掉菌液；吸取 1.5 ml菌液， 再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈；4. 加入 300 l 溶液 I 振蕩打勻，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應徹底打勻沉 淀或碎塊）；5. 加入 300 l 溶液 II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過 5 分鐘；6. 加入 300 l 溶液 III 顛倒混勻，放置于冰上 10 分鐘，使雜質充分沉淀；7. 12000 g 離心 10 分鐘；8. 吸取 800 l 上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質）至另一 Ep

8、pendorf 管中，加 入 2/3 體積的異丙醇，室溫下放置 5 分鐘；9. 12000 g 常溫離心 15 分鐘；10. 倒盡上清，加 75乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心 3 分鐘后倒去上清）；11. 室溫放置或超凈臺上風干 DNA ；12. 加 40 l 滅菌超純水或 TE 溶解；13. 質粒、 BAC 的質量檢測，于 -20保存。附注： 質粒檢測電泳檢測：質粒電泳一般有三條帶，分別為質粒的超螺旋、開環、線型三種構型 吸光值檢測：采用分光光度計檢測260nm、 280nm 波長吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于 1.71.9之間，說明質粒質量較好， 1.8 為最佳，低于 1.

9、8 說明有蛋白質污染，大于 1.8說明有 RNA 污染。實驗二 DNA 的瓊脂糖凝膠電泳帶電荷的物質在電場中的趨向運動稱為電泳。電泳的種類多，應用非常廣泛， 它已成為分子生物學技術中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操 作簡單、快速、靈敏等優點，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。實驗目的： 掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理，學習瓊脂糖凝膠電泳的操作。實驗材料： 質粒 DNA 、BAC 、植物總 DNA 或它們的酶切產物。實驗原理： 在 pH 值為 8.08.3 時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負電，在電泳時向正極移動。采用適當濃度的凝膠介質作為電泳支持物，在分子篩的作用下

10、，使分子大小和構象不同的核酸分子泳動率出現較大的差異，從而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子 中嵌入熒光染料（如 EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位 置。實驗步驟：1用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好，水平放置在工作臺上；2調整好梳子的高度；3稱取 0.24 g瓊脂糖于 30 ml 0.5×TBE 中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解， 冷卻至 45-50oC 時倒入制膠板中；4凝膠凝固后，小心拔去梳子，撕下膠帶； 5將電泳樣品與溴酚藍混合后將樣品依次點入加樣孔中；pUC18 5l + ddH2O 3l + 溴酚藍 2l 共 10l于 0.5ml tube中混合后點

11、樣； 6將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開電泳儀，使核酸樣品向正極泳動； 7電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入 0.5 g/ml 的溴化乙錠（ EB）溶液中染色 1015 min ，清水漂洗后置于紫外透射儀上觀察電泳結果，并照相記錄。附注：1影響 DNA 在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：1）DNA 分子大小 遷移速率 U 與 logN 成反比 （N 為堿基對數目）。分子大小相等， 電荷基本相等（ DNA 結構重復性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結構緊 密的電泳快（超螺旋 線性 DNA ）2）瓊脂糖濃度： logU=logU 0 Kr 膠濃度， U為遷移率， U0 為 DNA 的自由電泳遷

12、 移率， 為膠濃度，Kr 為介質阻滯系數。不同的凝膠濃度， 分辨不同范圍的 DNA Agarose：0.5%： 1-30 kb；0.7%： 0.8-12 kb1.2%： 0.4-7 kb；1.5%： 0.2-3 kb.3）DNA 構象：一般遷移速率超螺旋環狀 線狀 DNA 單鏈開環。當條件變化時， 情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強度、離子強度及EB 含量有關。4）所加電壓：低電壓時，線狀 DNA 片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨 效果好，凝膠上所加電壓不應超過 5V/cm5）堿基組成與溫度：一般影響不大 4 -30 6）嵌入染料的存在：降低線性 DNA 遷移率， （不提倡加在電泳液中

13、 ）7）電泳緩沖液 （0.5×TBE）的組成及其離子強度影響 DNA 的遷移率， 無離子存 在時，核酸基本不泳動，離子強度過大產熱厲害，熔化凝膠并導致 DNA 變性， 一般采用 1×TAE， 1×TBE ，1×TPE（均含 EDTA pH8.0）。2溴化乙錠（ EB）為致癌劑，操作時應戴手套，盡量減少臺面污染。 3電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍（ bromophenol blue, Bb）呈 藍紫色；二甲苯晴（ xylene cyanol, Xc ）呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少， 在凝膠中的的遷移率比溴酚藍慢。實驗三 外源 DNA片段

14、在質粒載體中的克隆DNA 重組技術包括載體及外源 DNA 片段的酶切消化、目的片段的獲得及純化、 目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內容。 DNA 片段的克隆技 術是分子操作的核心部分。實驗目的： 學習 DNA 的酶切、純化及外源片段與載體的連接，將 BAC 克隆所攜帶 的外源 DNA 酶切片段亞克隆到 pUC18 載體上。實驗材料： 外源片段來自一個含有水稻 DNA 片段的 BAC 克隆的酶切片段；克隆載 體為 PUC18。實驗原理：限制性內切酶可識別特定位點并切割 DNA 產生粘性末端或平端的外源片 段，經 DNA 的純化處理后用于連接反應；選擇克隆載體 pUC18 多克隆

15、 位點上相應的限制性內切酶切割，并用堿性磷酸酶處理防止載體自連； 在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實現外源片段的克隆。實驗步驟：1載體 pUC18 和外源 DNA 片段的限制性酶切：（50 l 反應體系，用 1.5ml tube，冰上操作）：DNA30 lR.E1 l10×buffer5 lddH2O14 l37反應 1hr，分別取 8 l 外源片段酶切產物和 5 l PUC18 酶切產物于 1.0%凝 膠檢測酶切是否完全；按 25 步純化、回收 DNA2加入 ddH2O 150 l （擴大體積），加入等體積氯仿 /異戊醇（ 24:1），顛倒混勻， 12000g離心 10 m

16、in；3吸取上清，加 1/10體積 3M NaAc 和兩倍體積無水乙醇， -20放置 15分鐘以上； 412000g 4冷凍離心 15 分鐘；5倒去上清，用 75乙醇浸洗沉淀， 風干后外源 DNA 溶于 10 l ddH2O（0.5ml tube 中）， PUC18溶于 20 l ddH2O（1.5ml tube中）；6按以下反應去除載體 PUC18 的 5'磷酸基團， 50反應 30 min 以上20 l0.5 l4.0 lDNACIAP（TaKaRa）10 buffer770水浴 10 min, 使 CIAP 失活；8按 25 步純化載體，溶于 10 l ddH2O；9 連接反應（

17、 15 l 體系）：DNA10 lpUC182.5 l5 buffer1.5 lT4 ligase (3U/ l)1 l16水浴過夜10 轉化大腸桿菌感受態細胞11 轉化子的鑒定 附注：1. 根據試驗目的和外源片段的不同可選用不同的載體，采用不同粘性末端的雙酶 切可實現外源片段的定向克隆。2. 克隆中用到的幾種工具酶：（1）限制性內切酶限制性內切酶的一個活性單位（ 1U）：指在 50 l 反應體系中， 37下，經過 1 小時的反應將 1 g DNA 完全切割所需要的酶量。限制性內切酶的 star 活性：限制酶在某些條件下使用時對 DNA 切割的位點特 異性可能降低， 即可以切割與原來識別的特定

18、 DNA 序列不同的堿基序列， 這種現象 叫限制酶的 star 活性。它的出現與限制酶、底物 DNA 以及反應條件有關。（2）堿性磷酸酶細菌堿性磷酸酶（ BAP）和牛小腸堿性磷酸酶（ CIAP）都能催化水解 DNA 、 RNA 、dNTP和NTP上的 5'磷酸殘基。比較而言，CIAP 更常用，因其可在 70 10' 內加熱滅活或通過苯酚抽提而變性失活，同時 CIAP 的活性比 BAP 的高 1020 倍。 它主要用于：（1）克隆時去除載體的 5'-P，以防載體自連；（2）在用 Kinase進行 5' 末端標記前，去除 DNA 的 5'-P。（3）連接酶體

19、外催化磷酸二酯鍵的形成可使用兩種酶：大腸桿菌連接酶和T4 噬菌體連接酶，但幾乎在所有的克隆中 T4 噬菌體連接酶都是首選的酶，因其能在正常的反應條 件下能有效的將平端連接起來。3. 氯仿對眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和腎臟，操作時需戴手套、安全鏡并在通風櫥中進行。苯酚是強腐蝕劑，能引起 嚴重燒傷。操作時應戴手套、安全鏡、穿防護服，并在通風櫥中進行。實驗四 感受態細胞的制備體外連接的 DNA重組分子導入合適的受體細胞才能大量增殖。為了提高受體菌 攝取外源 DNA的能力，提高轉化效率以獲得更多的轉化子，人們摸索出了不同的方 法處理細菌，使其處于感受態。 目前主要采用

20、電轉化法和 CaCl2法將外源 DNA導入受 體細胞中，并需要相應地制備電轉化感受態細胞和 CaCl2 感受態細胞。實驗目的： 學習感受態細胞的制備過程實驗材料： 大腸桿菌菌株 DH5 或 DH10B實驗原理： 電轉化法是利用瞬間高壓在細胞上打孔，因而需用冰冷的超純水多次洗 滌處于對數生長前期的細胞，以使細胞懸浮液中應含有盡量少的導電離子。轉化效 率為 1091010 轉化子/g DNA；對于熱激法，是利用冰冷的 CaCl2 處理對數生長 期的細胞，可以誘導其產生短暫的“感受態”，易于攝取外源DNA。轉化效率為106 107轉化子/ g DNA。CaCl2 感受態細胞的制備實驗步驟1前夜接種受

21、體菌 （DH5 或 DH10B），挑取單菌落于 LB 培養基中 37搖床培養過夜 （約 16 小時）；2取 1ml 過夜培養物轉接于 100ml LB 培養基中，在 37搖床上劇烈振蕩培養約2.5-3 小時（ 250-300rpm）；3將 0.1M CaCl2 溶液置于冰上預冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作4吸取 1.5ml 培養好的菌液至 1.5ml 離心管中，在冰上冷卻 10 分鐘；54下 3000 g 冷凍離心 5 分鐘；6棄去上清，加入 100 l 預冷 0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使 細胞重新懸浮，在冰放置 20 分鐘；74下 3000 g 冷凍離心 5

22、分鐘；8棄去上清，加入 100 l 預冷 0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使 細胞重新懸浮；9細胞懸浮液可立即用于轉化實驗或添加冷凍保護劑（ 15% - 20%甘油）后超低溫 冷凍貯存備用（ 70）。電轉化法制備大腸桿菌感受態細胞的實驗步驟1. 前夜接種受體菌（DH5 或 DH10B），挑取單菌落于 LB 培養基中 37搖床培養過夜；2. 取 2ml過夜培養物轉接于 200ml LB培養基中，在 37搖床上劇烈振蕩培養至 OD600 0.6 （約 2.5-3 小時）；3. 將菌液迅速置于冰上。以下步驟務必在超凈工作臺和冰上操作4. 吸取 1.5ml 培養好的菌液至 1.5m

23、l 離心管中，在冰上冷卻 10 分鐘；5. 4下 3000g冷凍離心 5 分鐘；6. 棄去上清，加入 1500 l 冰冷的 10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞 重新懸浮；7. 4下 3000g冷凍離心 5 分鐘8. 棄去上清，加入 750 l 冰冷的 10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重 新懸浮；9. 4下 3000g冷凍離心 5 分鐘10. 加入20 l 冰冷10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；11. 立即使用或迅速置于 -70 oC超低溫保存。附注：影響感受態細胞轉化效率的因素及實際操作過程中應注意的事項：1）細菌的生長狀態：實驗中應密切注視細菌的生

24、長狀態和密度，盡量使用對數 生長期的細胞（一般通過檢測 OD600來控制。 DH5 菌株 OD600為 0.5時細胞 密度是 5×107/ml）；2）所有操作均應在無菌條件和冰上進行；3）經 CaCl2 處理的細胞，在低溫條件下，一定的時間內轉化率隨時間的推移而 增加，24 小時達到最高，之后轉化率再下降（這是由于總的活菌數隨時間延 長而減少造成的）；4）化合物及無機離子的影響： 在 Ca2+的基礎上聯合其他二價金屬離子 （如 Mn2+ 或 Co2+）、DMSO 或還原劑等物質處理細菌， 可使轉化效率大大提高 （100-1000 倍）；5）所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學

25、物質的存在可能大大降低 細菌的轉化效率；6）質粒的大小及構型的影響：用于轉化的應主要是超螺旋的DNA ；7）一定范圍內，轉化效率與外源 DNA 的濃度呈正比；實驗五 質粒的轉化及轉化子的鑒定質粒的轉化是指將質粒或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。將連接產 物轉化到感受態細胞中，實現重組克隆的增殖，便于后續分子操作。可以采用多種 方法篩選和鑒定目的克隆。實驗目的： 掌握熱激法或電轉化法轉化大腸桿菌感受態細胞及轉化子的鑒定方法。 實驗材料： 外源片段與載體的連接產物；大腸桿菌感受態細胞。實驗原理：（ 1）熱激法：大腸桿菌在 0 CaCl2 低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形， 轉化混合物中的 DNA

26、 形成抗 DNase 的羥基鈣磷酸復合物粘附于細胞 表面，經 42短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收 DNA 復合物，在豐富 培養基上生長數小時后， 球狀細胞復原并分裂增殖。 在被轉化的細胞中， 重組子基因得到表達，在選擇性培養基平板上可挑選所需的轉化子。（2）電轉化法：外加于細胞膜上的電場造成細胞膜的不穩定，形成電穿 孔，不僅有利于離子和水進入細菌細胞， 也有利于孔 DNA等大分子進入。 同時 DNA在電場中形成的極性對于它運輸進細胞也是非常重要的。熱激法轉化實驗步驟：1制備選擇性培養基平板：在融化的 250ml LA 培養基中 250 l Amp（100mg/ml）， 250 l X-gal

27、（20mg/ml） ，25 l IPTG （200mg/ml） ，混勻后倒入滅菌培養皿中；2取出 3 管制備好的感受態細胞，放在冰上融化；3每 100 l 感受態細胞加入約 20ng質粒 DNA，3 管分別加連接產物、標準超螺旋 質粒 DNA （陽性對照）及不加入任何 DNA （陰性對照），用移液器輕輕吸打均 勻，在冰上放置 30 分鐘；4熱擊：將離心管放置 42水浴，熱擊 90 秒，注意：勿搖動離心管； 5冰鎮：快速將離心管轉移至冰浴，放置 12 分鐘；6復蘇：每管加 400 l SOC 培養基，在 37搖床溫和搖動溫育 45 分鐘，使細菌復 蘇；7布皿：取適當體積均勻涂布于含有 IPTG、

28、X-gal 、抗生素（ Amp）的 LA 平板； 8培養： 倒置培養皿， 于 37 培養 1216 小時 即可觀察到藍白相間的菌落 （其中 白色菌落為含有外源插入片段的轉化子，藍色菌落是載體自連的轉化子）質粒電轉化大腸桿菌感受態細胞操作步驟1制備選擇性培養基平板：在融化的 250ml LA 培養基中 250 l Amp(100mg/ml)，250 l X-gal (20mg/ml) ，25 l IPTG (200mg/ml) ，混勻后倒入滅菌培養皿中； 2取出制備好的感受態細胞，放在冰上融化；3每管感受態細胞加入 1 l 連接產物，用移液器輕輕吸打均勻，置冰上； 4電轉化儀選擇 1800V 作

29、為輸出電壓；5將要轉化的混合物加入預冷的 1 mm 的電轉化杯中，立即按下按紐電擊； 6立即加 1ml SOC 培養基到轉化杯中重懸細胞； 7將細胞轉入合適的培養管中 37oC 培養 1 小時； 8吸取合適體積的菌液涂布已倒好的選擇培養基平板；937oC 培養過夜，觀察結果。附注：1利用氨芐青霉素抗性篩選轉化子時，用轉化細胞鋪平板的密度要低( 90mm 平板 上不得超過 105 個菌落)，同時 37培養不應超過 20小時，具氨芐青霉素抗性的轉 化體可將 內酰胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周圍的抗生素，從而導致對 氨芐青霉素敏感的衛星菌落的出現。2鑒定轉化子中是否含有外源 DNA 片段常用的方

30、法有：1) 互補；2) 雜交篩選；3) 插入失活(一些老質粒如 pBR322 等);4) 小量提取質粒酶切檢測、 PCR 檢測實驗六 PCR 技術聚合酶鏈式反應( polymerase chain reaction, PCR)是一種體外核酸擴增系統， 是分子克隆技術中的常用技術之一。 PCR 具有反應快速、靈敏、操作簡便等優點， 已廣泛應用于分子生物學的各個領域。實驗目的： 掌握 PCR原理，學習 PCR 操作過程實驗材料： 轉基因水稻葉片總 DNA ，外源基因的特異引物實驗原理： PCR 是在模板 DNA、引物和 dNTPs的存在下依賴于 DNA聚合酶的酶促反 應。PCR 技術的特異性取決于

31、引物和模板結合的特異性。 反應分為變性、 退火、延伸三步，經過一定的循環，介于兩個引物之間的特異 DNA 片 段得到大量擴增。實驗步驟：1. 調整模板濃度至 10 ng/ l；2. 按下列體系配制反應混合液，混勻，加一滴礦物油，離心 5 秒Template DNA2 l (20 ng)10 buffer2.0 lMgCl2(25mM)1.5 lPrimer F (10 M)0.2 lPrimer R (10 M)0.2 ldNTPs(2mM)2.0 lTaq(5U/ l )0.2 lAdd ddH2O to20 l3PCR反應循環條件設置：95 3'1 cycle94 1' 5

32、5 1'72 1'30" 35 cycles72 8'1 cycle4forever4檢測：加 2 l 溴酚藍，混勻，短暫離心，取 15 l 反應產物點樣電泳； 5在 1%的瓊脂糖凝膠上點樣電泳； EB 染色，紫外觀察。附注：1引物設計應具有特異性，依靠引物設計軟件進行引物設計；引物分裝成多管，不 宜反復凍融多次；2PCR 反應的各種成份不能遺漏，操作應戴手套，冰上操作；3根據引物的 Tm 值和擴增片段長度以及 PCR 儀的特性來設定 PCR 循環條件；4注意分析電泳檢測 PCR 產物時出現拖帶或非特異性擴增帶、無 DNA 帶或 DNA 帶很弱的可能原因。系列

33、二 Southern 雜交技術Southern 雜交，通過用限制性內切酶消化基因組或其它來源的 DNA，經過瓊脂 糖凝膠電泳按大小分離酶切所得的片段，隨后 DNA在原位發生變性并從凝膠轉移到 一固相支持物上（一般是硝酸纖維素膜或尼龍膜） 。 DNA轉移至固相支持物的過程中 各 DNA的相對位置保持不變，用一定方法（如放射性同位素）標記的DNA探針與固著在膜上的 DNA 雜交，經 X-光片自顯影顯現出與探針 DNA互補的 DNA電泳條帶的位實驗一 植物總 DNA的快速少量抽提（ CTAB法）DNA 分子是分子生物學研究的基本材料， 依不同的實驗目的可采取不同的抽提 方法獲取數量和質量不等的 DN

34、A 。實驗目的： 了解植物 DNA 抽提的主要方法，掌握 CTAB 法快速抽提水稻 DNA 。 實驗材料及試劑： 水稻葉片， 1.5×CTAB ，氯仿/異戊醇 （24:1），95%乙醇或無水乙醇 等實驗原理 ：植物 DNA 的抽提常采用兩種方法：（1）SDS 法： 離子去污劑，過程長，純度高；（2）CTAB 法：該方法簡便、快速， DNA 產量高 （純度稍次，適用于一般分子 生物學操作 ）。 CTAB 是一種非離子去污劑， 植物材料在 CTAB 的處理下，結合 65 C 水浴使細胞裂解、蛋白質變性、 DNA 被釋放出來。 CTAB 與核酸形成復合物，此復 合物在高鹽（0.7mM ）濃

35、度下可溶，并穩定存在， 但在低鹽濃度 （0.1-0.5mM NaCl） 下 CTAB- 核酸復合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質及多糖等仍溶解于 溶液中。經離心棄上清后，CTAB- 核酸復合物再用 70 75%酒精浸泡可洗脫掉 CTAB。 再經過氯仿 /異戊醇（24:1） 抽提去除蛋白質、 多糖、色素等來純化 DNA ，最后經異丙 醇或乙醇等 DNA 沉淀劑將 DNA 沉淀分離出來。實驗步驟：1. 采集適量幼嫩葉片， 用液 N2研成粉末， 0.4 g裝入 1.5ml 離心管中（-20預冷）。2. 預熱 1.5×CTAB 到 95，加 1ml 到裝有葉片粉末的離心管中， 混勻（

36、防止凍融）。3. 立即置于 65水浴 30min，每 5 分鐘，上下顛倒 1次。4. 12000g離心 5 分鐘。5. 吸取上清液約 600l，加入等體積（ 600l）氯仿 /異戊醇 （24:1），上下顛倒數次， 至下層液相呈深綠色為止。6. 12000g離心 5 分鐘。7. 取 450l 上清于一新 1.5ml 離心管，加入 1ml 95%乙醇和 45l 10M NH 4AC），混 勻，室溫放置 10min。8. 12000 g離心 10min，去上清，用 75% EtOH 浸洗沉淀，自然干燥約 30 min。9. 加入 50l 1/10 TE 或無菌水（含 20g/RNase），置于 4過

37、夜，待 DNA 溶解后， 檢測 DNA 濃度及質量。注意事項：1盡量取材幼嫩葉片，如太老，酚類物質多，必須用 10 mM 的-ME 處理 2研缽預凍，粉末至加 CTAB 前不要融化324:1的氯仿 /異戊醇抽提時動作應輕柔，轉移用的槍頭最好是剪寬了的 4所用試劑必需滅菌，手套思考： （1）DNA 降解的可能原因（2）提高 DNA 產量的措施實驗二 總 DNA質量檢測及酶切實驗目的： 了解掌握檢測 DNA 質量的方法以及 DNA 定量的方法；了解影響 DNA 在瓊脂糖凝膠中泳動速率的因素；訓練 DNA 的瓊脂糖凝膠電泳操作及 DNA 的限制性內切酶操作。實驗原理： 參見系列一中實驗二；限制性內切

38、酶的特點：見“基因操作原理” 。實驗材料及試劑： 水稻總 DNA 或 BAC 克隆 DNA ，瓊脂糖，限制性內切酶 DraI， EcoRI，EcoRV，HindIII實驗步驟：1取 10l DNA 于 0.8% 凝膠檢測；2將 DNA 調節濃度至 300-400 ng/ l ；2仔細閱讀將所用的任何一種酶產品說明書，熟悉反應條件及酶切的貯存濃度 （10U-50U/l）廠家配套試劑；3計算據反應條件所需要的各種試劑準確用量： （0.5 ml tube 中）10l1.5 l0.8 l（冰上）2.7 l或 10 hrs（粗制 DNA ）；DNA（3-5g）10 buffer reaction Enz

39、yme （15 U/ l） ddH2O 混勻，短暫離心； 437 溫浴 1-2 hrs （純 DNA） 5加入上樣緩沖液終止酶切反應，也可 65加熱 10 min 使酶變性失活；6電泳檢測酶切效率：每個樣品取 1/10 量用瓊脂糖電泳檢測，制膠及點樣方法同上。結果分析若水稻 DNA 呈現均勻連續分布的一片，則酶切效果好，否則需重做；DNA 被切爛： DNA 降解，重新提 DNA ；DNA 切不動：雜質多（多糖，蛋白質，酚類，有機溶劑等） ，重新純化； 若是 BAC 克隆 DNA ，酶切后應出現多條很清晰的不同大小 DNA 帶。 思考：什么是酶星活性？如何避免？ 影響酶切效率的因素？EB 指示劑

40、原理？實驗三 電泳、轉膜轉膜是把 DNA 從瓊脂糖凝膠中轉移到固相支持物（一般是尼龍膜）上固定， 是進行各種后續研究（如 RFLP 分析，陽性克隆的篩選驗證等所有涉及分子雜交的 研究）的前提。實驗目的： 掌握 Southern blotting 的原理及操作步驟實驗原理：1. 轉膜的方式：向上的毛細管轉移 向下的毛細管轉移 同時向兩張膜轉移 電轉移 真空轉移2. 固相支持物的種類及選擇： 硝酸纖維素膜：非共價結合，易脆，易丟失 DNA， 500 bp的DNA 無效，轉 膜前的工作（從提高轉膜效率，利于轉膜后使用等） 尼龍膜（帶正電荷的）高強度，不易破損，具有較大的 DNA 結合容量，它能 夠吸

41、附變性 DNA ，核酸以共價結合方式不可逆的結合在尼龍膜上。尼龍膜兩邊均有 同樣吸附 DNA 功能，無論用哪邊均可以經久耐用，可反復利用 10 次以上（ 10-20 次），經毛細管（毛細吸附）作用，把 DNA 從凝膠上轉到膜上。 DNA 轉到膜上是復 制膠上的帶型，在 80-100真空干燥 2-4 hrs，即可固定 DNA 。3. 轉移緩沖液（ transfer buffer）的選擇： 帶正電荷的尼龍膜：可用高鹽離子強度（ SSC），但不能充分發揮膜潛能； 0.4NNaOH，共價結合 DNA 是最大優點。 硝酸纖維膜：高鹽離子強度促進 DNA 與膜結合（ 20×SSC），低鹽離子強度

42、導 致小片段 DNA 在轉移過程中丟失， pH9，DNA 不能與膜結合。4轉膜時間（ duration of transfer）約 12 hrs 取決于毛細管系統， DNA 大小，膠厚度 （5 mm）及濃度（1%）。DNA 分子量大小決定時間長短，部分去嘌呤減小 DNA ，堿轉移 2hrs大部分結 合到膜。DNA 轉移的效率較難判斷，只有在轉膜結束后，通過 EB 染膠，及分子雜交才 可以鑒別效率高低，但已無補救措施，因此，每一步應嚴格操作。實驗材料及試劑： 酶消化好的 DNA 樣品，尼龍膜， 0.2N HCl，0.4N NaOH 等 實驗步驟：1 0.8%瓊脂糖電泳 制膠：注意瓊脂糖的質量，膠

43、的濃度，厚度（ 5mm）及均一性。一般大電泳 槽配制 250ml 0.8%瓊脂糖凝膠，采用 42 孔梳子（經濟，高效）制樣，點樣： DNA 樣品中指示劑量稍多電泳：一般 1-1.5V/cm 的電壓， 使 DNA 遷移到適當距離，一般指示劑約移動10-11cm （大電泳槽： 40V×12-15hrs，小電泳槽 30V×4-5 hrs） 2轉膜前的準備：依膠大小每塊凝膠準備兩張比膠稍大的濾紙（ 11×12.5 cm），兩張用作鹽橋的 濾紙，一張與膠同樣大小的尼龍膜（ 10×10.5cm），兩個玻璃盤、兩塊有機玻璃板、 一根玻璃棒，比尼龍膜稍大的一疊吸水紙等。

44、3一玻璃盤中加入足量的 0.4N NaOH，放上洗凈的玻璃板，按圖示搭制鹽橋 （操作 示范 ）。4凝膠的預處理 :a）從電泳槽中移出凝膠置于塑料板上，用切膠板把膠切成適當大小，切去右 上角（最后一個樣品的最前端）作為電泳方向記號b）把凝膠翻面，放入加有足量的 0.2N HCl 玻璃盤中，輕輕搖動 10min，使指 示劑變黃色為止（脫嘌呤）c）倒去 HCl 溶液，加蒸餾水漂洗凝膠d）倒去蒸餾水，加 0.4N NaOH 中和e）同時在鹽橋濾紙上灑些 0.4 NaOH，立即將膠放在鹽橋上（忌氣泡） 5膠的四周用塑料片與膠緊緊相連，防止短路（吸水紙與鹽橋相接） 6在膠面上倒足夠量 0.4N NaOH，

45、小心放置膜（預濕 0.4N NaOH）使膜覆蓋整塊膠 （要求一次成功，不能移動）7膜上放 2 張濾紙，濾紙大小為 15×12cm8放不少于 5cm厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約 500g的重物，轉膜 12 hrs左右 9轉膜完畢，用 2×SSC漂洗膜兩次，各五分鐘。用 EB 染膠以檢測轉移效果。 10用兩張濾紙包住膜，置于 80-100的真空干燥箱中，干燥 2-4 hrs。思考：（1）為什么轉膜前要對凝膠預處理？如何處理？（2）怎樣提高轉移效率實驗四 Southern Blotting對于大的基因組， DNA 酶切圖譜憑肉眼是分辨不開的 （EB 染色），因為大小不 等的分子

46、呈現彌散分布，只有借助靈敏的放射性同位素（或其他化學發光物質） ，將 靶 DNA 在凝膠上（膜上）的帶型通過特定的探針與之雜交，轉換成 X 光片上直觀 的帶型，才能進行相關分析。另外如果需要鑒定或尋找與已知 DNA 同源的 DNA 片 段如：染色體步查、基因組文庫的評價和利用、陽性克隆的分析鑒定、轉基因拷貝 數分析等也都需進行 DNA 的分子雜交實驗。實驗目的： 掌握同位素的操作及防護方法；掌握預雜交、探針的標記及分子雜交技 術實驗原理： 依據堿基配對原則， 用放射性同位素標記的 DNA 探針，與固著在膜上的 靶 DNA 雜交，經放射自顯影，確定靶 DNA 的位置。1預雜交：膜上有許多沒有結合

47、 DNA 分子的地方，若不在雜交前用一些封閉劑結 合位點，加入探針后，探針 DNA 分子將會結合在這些位點上，導致雜 交背景深，預雜交的目的是用非特異性 DNA 分子（鮭精 DNA ）及其它 高分子化合物（封閉劑）將待雜交膜中的非特異性位點封閉，從而減少 雜交背景。2探針的標記：體外標記 DNA 或 RNA 的方法有多種，如：末端標記，隨機引物 標記，缺刻平移（ nick translation），體外轉錄（ in vitro transcription ）及 各類 PCR等。這些方法有的是在特定位置標記核酸（ 5'或 3'末端），有 的標記核酸分子內部的多個位點。有的產物是標

48、記單鏈，有的產物是標 記雙鏈。有的方法產生一定長度的標記產物，有的得到的是長短不一的 標記產物。隨機引物標記：在 DNA 聚合酶的作用下，寡核苷酸通過與單鏈的模板配對可以啟動 DNA 的合成。如果寡核苷酸序列是不同的（ heterogeneous），引物中包 含所有可能的隨機序列 （如 6 堿基引物則有 46=4096種），可以與任意模 板序列相配對在許多位置形成雜交鏈，四種核苷酸底物中有一種是用同 位素標記的，因而可產生均勻一致高比活放射性探針。同位素標記的探 針 DNA 的平均長度與引物的濃度成反比， The klenow fragment 去除了 EColi DNA polymerase

49、 I 的 5' 3'的外切酶活性，具有 5' 3' 的聚合酶活性及 3' 5' 外切酶活性；Primer：可通過用 DNase I消化牛胸腺 DNA ，DNA 合成儀合成或直接從公司購買。 同位素標記的探針 DNA 的平均長度與引物的濃度成反比 =k/（lnPc） 1/2， Pc是引物的濃度 ，一般可產生約 400-600 bp的標記產物。模板 DNA ：線狀雙連 DNA 。環狀 DNA 用限制性內切酶切成線狀，再標記。用純化 的 DNA 片段作模板標記的探針與用完整的質粒作模板比較，可減少背 景。dNTPs： 其中一種用放射性同位素標記3雜交：

50、 將標記好的探針，加到雜交液中，在一定（溫度下）條件下，使探針與 膜上的 DNA 雜交。4洗膜：用不同組成及離子強度的（嚴謹度）溶液，洗去膜上的封閉劑及非特異性 雜交的探針實驗材料及試劑： 已轉移上 DNA 的尼龍膜， 32P 標記的 dCTP，隨機引物，20×SSC， 10%SDS，X-光片，顯影液及定影液等實驗步驟：1. 預雜交：將尼龍膜在 2× SSC中浸濕，放入雜交袋或雜交管中，加入適量雜交液 （雜交液浸沒膜），趕氣泡，封口，放入 65的雜交箱或恒溫搖床中，預雜交 3 個小時以上，一般 6-12hrs。2. 標記探針：反應體系： 1-2blots（19.5×

51、;9.5cm2）DNA100ngDNTP2.0 lRandom primer5.0 lKlenow (1u/ l)1l- dCTP*1.0 ladd ddH2O to17.0 l按先將水和 DNA 按反應體系所需的量取至一 1.5 毫升離心管中，混勻，短暫 離心至管底，放至 100干浴中變性 10 min，變性探針迅速置于冰浴上 5 min，按反 應體系將反應混合液（ dNTP，Random primer， Klenow ）加入變性 DNA 中，在同 位素操作臺上，加入 32P標記的 dNTP（ -32P dCTP*，放射性比活 >3000Ci/mmol）， 30溫育 3 小時以上。3.

52、 雜交將標記好的探針，補加 300l 雜交液， 100變性（ or 0.4N NaOH變性），加入 雜交袋（盒）中（忌直接加于膜上） 。雜交前作標記效率測定， >25%以上可以往下 做雜交， 過夜雜交。雜交效率受雜交速率及雜交穩定性影響。4. 洗膜：從低嚴謹度到高嚴謹度冼膜液（具體情況而定） ：1×SSC/0.1%SDS洗膜兩次（冷 5min，熱 65， 15min） 檢測信號強度0.5×SSC/0.1%SDS 熱冼 65, 15min 依情況可有改動 0.2×SSC/0.1%SDS or0.1×SSC/0.1%SDS。5. 包膜：膜從洗膜液中撈出

53、，在濾紙上晾干，膜表面無可見水膜為止（注意：不 能太干，以防探針難以洗脫影響再次使用） ，用保鮮膜包膜， 壓 X-光片，置于-20 或-70 37 天（依據信號強弱掌握曝光時間）6. 沖洗 X-光片在暗室紅燈下取出 X- 光片，置入顯影液中至雜交帶顯現出來 （顯影時間依據信 號強弱及曝光時間長短可由幾秒鐘到 2分鐘），轉入清水中漂洗， 然后放入定影液中 定影至清亮（約 10 分鐘）。自來水沖洗干凈后，晾干，讀片。7. 膜上探針洗脫再次使用膜前，必須洗去上次探針！（1） 0.1%SDS，0.1×SSC10min（2） 0.1NaOH，0.2%SDS2-3min（3）0.2M Tris.

54、HCL ， 0.2%SDS，0.1×SSC20min只洗去探針，而不影響膜上的靶 DNA （因為 DNA 與膜是共價鍵結合，而 DNA 與探針的結合是氫鍵結合） 。附注：1. 雜交效率的影響因素a）雜交溫度：雙鏈 DNA 分子， T=Tm-2025可達最大雜交率， DNA-RNA 雜 交分子則低于 Tm 值 10-15。b）離子強度 （1.5M/L NaCl 雜交率最高 ）c）雙鏈長度 （形成雜交物長度 ） ：雜交率與雙鏈長度成正比d）探針的復雜程度 （重復性探針可以增加雜交率 ）e）pH5.0-9.0 基本無影響。2. 影響雜交穩定性（影響解鏈溫度的）因素a）離子強度 在 0.01

55、-0.4M NaCl 之間 , 每 10×單價陽離子， Tm 16.6b）堿基組成 AT<CG（在 NaCl 溶液中）；c）去穩定劑（ destabilizer） DNA-DNA 雜交分子，每 1%formamide,Tm 0.6； 6M urea 可降低 Tm30d）堿基錯配：每 1%的錯配可使 Tm 降低 1e）雙鏈長度（探針雜交物） >500bp 基本無影響3整個實驗過程中應注意的事項：1）保證轉膜質量；2）操作規范；3) 提高雜交靈敏度(信號強度) ；a) 探針量及標記量(探針變性) ；b) 比活(性)度 >=108dpm/u(<108 弱)；c) 靶

56、 DNA 量(絕對量，酶切轉膜決定；相對量，靶 DNA 相對于探針過量 時，完全配對雜交，探針過剩時，完全配對和非嚴格的完全配對均有發 生)；d) 有惰性聚合 物增 加靈敏度； 10%(w/v)500,000(mw)dextran sulfate 或 8%(w/v)PEG6000。對于單鏈探針，可以增加 10-fold 雜交信號， dsDNA 成 100-fold 地增加雜交信號4) 提高特異性：a) 高鹽溶液促進探針與靶序列的堿基配對 20×SSC 3M NaCl/0.3M Na3Cib) 雜交后洗膜溫度 T Tmc) 雜交后洗膜液濃度組成， 高嚴謹度洗膜液使不完全配對的雜交失去穩

57、定， 致 使探針脫落d) 雜交時間 8hrs 以后， DNA 探針逐漸退火，少量自由與靶 DNA 雜交.e) 探針長度( >1000bp)過長，高嚴謹度下難洗脫非完全配對雜交探針。 4放射性同位素：1) 放射性同位素發出的射線主要有： 粒子：外照射，一般能量的 粒子穿透能力較弱，射程短，危害性小，稍加 防護即可(如手套)；內照射，電離密度大，危害大。粒子：穿透能力比 粒子強，外照射危害比 粒子大，可引起皮膚的放射損 傷。射線：穿透能力很強，外照射時危害性很大，應采取切實有效的防護措施。2) 放射性活度及單位：放射性活度 A 是指一定量的放射性核素在時間間隔 dt 內發生自發核衰變數 dN 與此時間間隔的比值。即 A=dN/dt放射性活度的單位是 Becque