1、北京華爾博科技有限責任公司 資料編號：hb17固相萃取指南1固相萃取（spe）是一種用途廣泛而且越來越受歡迎的樣品前處理技術。使用固相萃取能夠避免液液萃取帶來的許多問題，比如，相分離不完全、定量分析回收率較低、使用玻璃器皿的昂貴易碎、產生大量有機廢液。與液液萃取相比，固相萃取不僅更有效，而且更容易實現自動、快速、定量萃取，同時減少溶劑用量和萃取時間。固相萃取常用于萃取液體樣品特別是不易揮發或不揮發的液體樣品，除此以外也可用于處理預先提取到溶液中的固體樣品。固相萃取對樣品的萃取、濃縮和凈化都有極好的效果。針對樣品性質，我們提供多種固相萃取裝置，以供選擇。 固相萃取理論化合物是怎樣被吸附而保留的反

2、相（極性液體相，非極性改良固體相）疏水性相互作用· 非極性非極性相互作用· 范德華力或色散力正相（非極性液體相，非極性改良固體相）親水性相互作用· 極性極性相互作用· 氫鍵· p-p相互作用· 偶極偶極相互作用· 偶極誘導偶極相互作用離子交換帶有電荷的化合物靠靜電吸引到帶有電荷的吸附劑表面吸附（化合物與未改良材料的作用）疏水性相互作用或親水性相互作用，其取決與所選用的固相材料。反相固相萃取反相分離包括一個極性（通常是水溶液，見第八頁表a）或中等極性的樣品基質（流動相）和一個非極性的固定相。分析物通常是中等極性到非極性。幾種s

3、pe材料屬于反相類，如烷基，或芳香基鍵合的硅膠（lc-18，envi-18，lc-8，envi-8，lc-4，和lc-ph）。在這里，純硅膠（一般孔徑為6040mm大小的顆粒）表面的親水性硅醇基通過硅烷化學反應，被含有疏水性的烷基或芳香基取代了。ch3 ch3si-oh+cl-si-c18h37 si-o-si-c18h37+hcl ch3 ch3由于分析物中的碳氫鍵同硅膠表面官能團的吸附作用，使得極性溶液（例如，水）中的有機分析物能保留在這些spe物質上。這種非極性-非極性吸附力通常稱為范德華力或色散力。為了從反相spe管或片上洗脫被吸附的化合物，一般采用非極性溶劑去破壞這種化合物被吸附到填

4、充物質上的力。lc-18和lc-8是標準的單鍵合硅膠，而envi-18和envi-8則屬于聚合鍵合類填料，具有很高的硅表面覆蓋率和較高的碳含量。這類聚合鍵合類填料具有更強的抗酸堿性，因而更適合于環境應用，如從酸化的液體樣品中富集有機化合物。所有使用過的鍵合硅膠相都有一定數量的未反應硅醇基，它將成為二級相互作用之源。在萃取或保留強極性分析物或污染物時，這種二級相互作用是非常有用的，但是對分析物的吸附也可能是不可逆（見第五頁上的二級相互作用）。以下物質也用于反相條件：envi-carb（碳），envi-chrom p(聚合類)和hisep(聚合涂層的鍵合硅膠)。含碳的吸附物質，如envi-carb

5、材料，是由石墨和無孔碳組成，它對極性和非極性樣品中的極性和非極性有機化合物有較高的吸附能力。該碳表面是正六圓環的原子結構，每個碳原子在石墨層上相互聯接。這種正六圓環結構對某些分子有很強的選擇性，比如平面型芳香化合物或類正六圓環分子和可形成許多表面觸點的烴鏈分子。分析物的保留取決于其結構（形狀和大小），而不是其上官能團與吸附劑表面的相互作用。洗脫時，使用中等極性到非極性溶劑。與烷基鍵合硅膠相比，尤其是在鍵合硅膠不靈時，envi-carb顯示出特有的結構和選擇性優勢。聚合類吸附物質，如envi-chrom p是苯乙烯-二乙烯基苯物質，用之保留一些含有親水性官能團的疏水性化合物，尤其是芳香型化合物。

6、有時在反相條件下，苯酚很難保留在c18鍵合硅膠上，這主要是因為它在水中的溶解度大于有機相。而envi-chromp在反相條件下可很好地保留苯酚。洗脫時，使用中等極性到非極性溶劑，這是因為，聚合類填料對所有的溶劑都是很穩定的。hisep是一個疏水基（類似c18）鍵合硅膠涂上一層親水聚合物，常用于反相條件，這種有孔的聚合物能阻止不需要的大分子被吸附到硅膠表面。聚合物的孔徑大小只充許所分析的疏水性有機小分子化合物（如藥物）接近硅膠表面，而不需要的大分子（如蛋白質）則被聚合物層隔離在外，沒有機會接近硅膠表面，并被沖洗出固相萃取管。hisep固相萃取過程類似于lc-18固相萃取過程。正相固相萃取正相固相

7、萃取包括了一個極性分析物質、中等極性到非極性的物質（如丙酮，鹵化溶劑和正己烷）和二個極性固定相。極性官能團鍵合硅膠（如lc-cn，lc-nh2和lc-diol）和極性吸附物質（如lc-si,lc-florisil,envl-florisil和lc-alumina）常用于正相條件。在正相條件下，分析物如何保留取決于分析物的極性官能團與吸附劑表面的極性官能團之間的相互作用，具體包括氫鍵、p-p相互作用、偶極一偶極相互作用和偶極-誘導偶極相互作用及其它。因此，由以上幾種機理所吸附的分析物，應用比樣品本身更極性的溶劑去破壞其相互作用，這樣分析物才隨之而洗脫。鍵合硅膠lc-cn、lc-nh2和lc-di

8、ol，有一個帶有極性官能團的較短烷基鏈鍵合在硅膠表面上。因為極性官能團的存在，這種硅膠相對于反相硅膠更具有親水性。常用的正相硅膠，它能從非極性的樣品中吸附極性化合物。這種固相萃取管已用于吸附和選擇性洗脫結構很類似的化合物（如異構體）、復雜的混合物或者象藥物和脂類化合物。為了利用它這種疏水性，它也可用于反相條件（如水溶液樣品）。lc-si填料是一種沒有衍生的硅膠，一般用來作所有鍵合硅膠的基體。這種硅膠極親水，必須保持干燥，這就要求所分析的樣品必需無水。硅膠用于從非極性物質中吸附化合物官能團的都是表面自由羥基。lcsi從非極性物質中吸附極性化合物，然后用一種極性更強的有機溶劑洗脫。多數情況下，c-

9、i是作為一種吸附劑，當硅膠基體用于有機萃取時，分析物不停留在硅膠上，而不要的化合物則被吸附在硅膠上，隨之扔掉。這種過程稱為樣品前處理。c-florisil和envi-florisil固相萃取是一個鎂化硅膠，通常用在樣品的有機萃取，用其進行有機樣品的前處理。它是一種強極性物質，可以有效地從非極性物質中吸附極性化合物。envi-florisil固相萃取是由聚四氟乙稀或者不銹鋼濾片制作。這種對環境過程非常重要的結構祥述在美國環境保護組織的方法中。envi-florisil己用氣相色譜分析法測定其背境較小。lc-alumina固相萃取用于吸附和樣品前處理的過程，al2o3材料可為酸性（al2o3-a，

10、 ph約為5）、堿性（al2o3-b， ph約為8.5）或者中性（al2o3- ph，約為6.5）。al2o3的活性水平隨水加入的多少，從1級到級而變化，裝管時，al2o3可在裝管前預處理或者裝管后再處理。離子變換固相萃取離子交換固相萃取適用于帶有電荷的化合物（一般為水溶液，也有有機溶液）。陰離子（負電荷）化合物可用c-sax或c-nh2鍵合硅膠管進行分離；陽離子（正電荷）化合物可用c-scx或c-wcx鍵合硅膠管進行分離。基本原理是靜電吸引，也就是化合物上的帶電電荷基團與鍵合硅膠上的帶電電荷基團之間的吸引。為了從水溶液中將化合物吸引到離子交換樹脂上，樣品的ph值一定要保證其分離物的官能團和鍵

11、合硅膠上的官能團均帶電荷。如果某種離子帶有與分析物一樣的電荷，它將會干擾分析物的吸附。當然這種情況也可能是罕見的。洗脫溶液一般是其ph值能中和分離物官能團上所帶電荷，或者中和鍵合硅膠上官能團所帶電荷。當官能團上的電荷被中和，靜電吸引也就結束，分析物則隨之洗脫。另外，洗脫溶液也可能是一種其離子強度很大或含有另一種離子能取代被吸附的化合物，這樣被吸附的化合物也隨之而洗脫。陰離子交換lc-sax是一種脂肪族季銨類鹽鍵合在硅膠上的物質，季銨鹽是一種很強的堿，帶有一個正電荷，能交換或吸附溶液中的陰離子，稱之為陰離子交換（sax）。季銨鹽的ph值很高（>14），在水溶液中，所有的ph條件下,都能帶上

12、電荷。這樣lc-sax可分離很強的陰離子化合物（很低的ph值,<1）或弱陰離子化合物（中等的ph值,>2），只要樣品在其ph條件下，分析物帶有電荷即可。對于陰離子分析物（酸性），為使之帶上電荷，其ph值必需大2個單位。大多數情況下，被分析物是強酸性的或弱酸性的。因為化合物被吸附地如此之緊，只有在不要求其陰離子回收率時（化合物被分離，然后扔掉），才能用lc-sax萃取強陰離子。弱陰離子則能用lc-sax分離，因為它們能被另外一種陰離子所取代或者被一種酸性溶液所洗脫，該酸性溶液的ph值可中和被取代的陰離子（ph小個單位）。如果要求強陰離子其回收率時，可選用lc-nh2。lc-nh2固相

13、萃取填料適用于正相分離，當用于水溶液時也做為一種弱陰離子交換樹脂（wax）。lc-nh2填料含有一個脂肪族季氨丙基，并鍵合在硅膠表面上。這種伯胺基的ph值大約為9.8。因為其用于陰離子交換，樣品的ph值必需小于9.8至少個單位，此ph還必需保證所分析的陰離子化合物帶上電荷（比其ph值大個單位）。lc-nh2也可適用于強陰離子或弱陰離子分離回收，這是因為硅膠表面的氨基能被中和強陰離子或弱陰離子（比其ph大個單位），這樣強陰離子或弱陰離子都能被洗脫。弱陰離子也能用一種溶液（ph比該陰離子的ph小個單位）而洗脫，或者加入另外一種陰離子取而代之。陽離子交換lc-scx填料含有一個脂肪族磺酸基，并鍵合在

14、硅膠表面上。這種磺酸基有很強的酸性（ph值<），它能吸附或者交換溶液的陽離子，稱之為強陽離子交換（scx）。在所有的ph條件下，這種鍵合官能團都能帶有電荷，只要該ph能保證所分析化合物帶有電荷，因此其能用于強陽離子（ph值14）或弱陽離子（ph值<12）化合物的分離。對于所分析的陽離子（堿性）化合物，樣品的ph要比其ph值小個單位，以保正其帶電荷。多數情況下，所分析的化合物是強堿性的或弱堿性的。當不要求強陽離子回收或者被洗脫時，lc-scx固相萃取管可用于強陽離子的分離。弱陽離子則可以用lc-scx分離和洗脫。洗脫時，用一種ph比其ph大2個單位的溶液（中和分析物的電荷），或者加入

15、另外一種陽離子取而代之。如果要求強陽高子回收率，可選用lc-wcx。lc-wcx固相萃取填料含有一個脂肪族羧酸基團，并鍵合在硅膠表面上。這種羧基是一種弱酸性陰離子，所以它可作為一種弱性陽離于交換（wcx）。lc-wcx上羧基的ph約為4.8。當ph比其ph大2個單位時，它保持帶負電荷，能分離此ph下帶電荷的陽離子。lc-wcx適用于強陽離子或弱陽離子分離和回收，因為硅膠表面的羧基能被中和（ph比其ph小個單位），強陽離子或者弱陽離子則被洗脫。對于弱陽離子可用一種溶液（ph比陽離子ph大個單位）中和而洗脫，或者加入另外一種陽離子取而代之。在很多情況下，由離子交換固相萃取所吸附的分析物被洗脫在水溶

16、液中。如果必需使用酸性溶液或者堿性溶液去洗脫固相萃取管上的分析物，同時分析物又必需以有機溶劑來分析，而有機溶劑又不溶于水，這時可根據情況，試用含有酸的甲醇（98%甲醇、2%濃鹽酸）或者含有堿的甲醇（98%甲醇、2%氫氧化氨）來洗脫。由于甲醇很容易揮發，樣品可再溶解在另一種溶劑里。如果需要一個很強（非極性）的溶劑從固相萃取填料上去洗脫所分析物，可加一些二鹵甲烷、正己烷、乙酸乙脂到酸或堿性的甲醇里。二級相互作用以上詳述了化合物在固相萃取方法中是如何保留的基本原理。對鍵合硅膠可能有二級相互作用的存在。對反相鍵合硅膠，基本原理是非極性的相互作用。然而，由于硅膠只是主體，有一少部分硅甲醇存在，這就有一些

17、極性二級相互作用（正如我們在正相固相萃取取所談）將要發生。如果非極性溶劑不能有效地從反相固相萃取填料上洗脫化合物，就有必要加些極性溶劑（如甲醇），以破壞極性相互作用而保留的化合物。在這種情況下，甲醇與硅膠上的羥基形成氫鍵， 打斷了分析物與硅膠上的羥基形成的氫鍵。硅甲醇在硅膠表面，si-oh，也可為酸性，當ph大于4時，以si-o-型式存在。這時在硅膠基體上也可能發生陽離子交換的二級相互作用，能吸附陽離子或堿性分析物。在這些情況，調整洗脫溶液的ph非常重要，以破壞這些相互作用而洗脫分析物（酸中和硅甲醇或堿中和分析物）。可選用含有酸的甲醇（98%甲醇、2%濃鹽酸）或者含有堿的甲醇（98%甲醇、2%

18、濃氫氧化氨），或者用一種熔于甲醇的非極性有機溶劑來洗脫。正相鍵合硅膠通過其鍵合基團展示了極性保留機理，但是也有一些二級相互作用發生在分析物與聯接鍵合基團的烷基鏈之間。在這種情況下，更非極性的溶劑或極性非極性混和溶劑可用來做洗脫溶劑。作為反相鍵合硅膠，硅膠基體與分析物之間的二級相互作用和陽離子交換作用也可能發生。離子交換鍵合硅膠不僅能提供這種分析物與硅膠上部分非極性基團之間的非極性二級相互作用，而且還有分析物與硅膠基體之間的極性和陽離子交換作用。要從這些填料上洗脫分分析物，一個準確的ph、離子強度和有機物的含量是必要的。固相萃取中的ph影響用在固相萃取中的溶液有很大ph范圍的溶液有。硅膠作為基體

19、原料，如高壓液相色譜柱，通常穩定的ph范圍是2-7.5。當ph高于和低于這個范圍，鍵合相就會水解和從硅膠上斷鏈下來，或者硅膠本身就溶解了。然而，在固相萃取中，常常溶液只與吸附劑接觸較短的時間。實際上固相萃取管都是一次性使用，允許任何ph溶液以達到最佳保留和洗脫效果。如果固相萃取管對ph極限的穩定性非常重要時，聚合或碳鍵合固相萃取材料均可選用，如envi-chrom p或envi-carb。這些材料在1-14ph范圍內都是穩定的。對于鍵合硅膠上反相固相萃取過程，如果希望保留分析物，預處理的溶液和樣品（基本上或全部為水溶液）的ph應調至最適宜分析物保留。如果，分析物是酸或堿性的，通常情況下，使用的

20、ph應該阻止化合物帶電荷。中性化合物（無酸性和堿性基團）的保留，一般不受ph影響。相反，也能調節ph，使樣品中不需要的化合物保留在固相萃取的填料上，而分析物則不被保留而流出。在適當的ph，分析物的再次親水性和陽離子交換作用則能被利用（詳見二級相互作用）。吸附劑(如envi-chrom p和envi-carb)用于反相條件，則應選擇ph，使分析物最大程度地保留在反相硅膠上。一般使用有機溶劑洗脫時，這一點上的ph無足輕重。令人吃驚的是，當溶液在中性ph條件下，苯酚可帶電荷，它能更好的保留在envi-chrom p上，而不是溶液在酸性ph，苯酚不帶電荷的情況。這表明，相對鍵合硅膠吸附劑對某些化合物有

21、不同的選擇性。當使用這類填料時，應對樣品和預處理溶液的ph范圍有所研究。對于鍵合硅膠或吸附劑上的正相固相萃取過程，ph一般是無關重要的。因為在這些過程中所用的溶劑一般為非極性有機溶劑，而不是水。離子交換固相萃取是如何保留化合物，很大程度上取決于樣品和預處理溶液的ph。為了保留化合物，樣品的ph應保證分析物和硅膠表面的官能團帶上相反的電荷。詳見第四頁。固相萃取的使用常用的固相萃取管和片（disk）選擇適當的萃取方案利用固相萃取純化物質有三種方法：選擇性萃取選擇一個固相萃取的吸附劑，能吸附樣品中分析物或要祛除的雜質。當樣品流過固相萃取管時(流出物即樣品減去被吸附在固相萃取管上的那些化合物)，所選擇

22、的物質被保留在其中。然后，通過洗脫來收集被吸附的分析物，或者扔掉含有萃取雜質的萃取管。選擇性沖洗當樣品流過固相萃取管時，分析物和雜質都被保留在固相萃取填料上，然后用一種強的能洗脫雜質而又弱的能保留要分析化合物的沖洗液來沖洗雜質。選擇性洗脫將被吸附的化合物洗脫在溶液里，而將強保留的雜質留在其后。固相萃取的五個步驟固相萃取過程要求樣品以溶液形式存在，沒有干擾，而且有足夠的濃度以被檢測。固相萃取的發展過程分為五步： 第一步 選擇萃取管或片注意：建議固相萃取片用于大體積樣品、含有大量顆粒或處理時需要很高流速的樣品。選擇固相萃取管或片：吸附劑類型（注解：參見第12頁的示意圖）樣品基質是水溶液分析物更溶于

23、水帶電荷弱陰離子和酸性：使用lc-sax或lc-nh2管強陰離子和酸性：要回收萃取分析物使用lc-nh2管，不回收萃取分析物使用lc-sax弱陽離子和堿性：使用lc-scx或lc-wcx管強陽離子和堿性：要回收萃取分析物使用lc-wcx管不回收萃取分析物使用lc-scx中性如果分析物很難用反相填料（如酒精、糖、甘醇）萃取，可試用envi-carb或envi-chrom p管，或用反相萃取lc-sax或lc-scx管除去干擾物。分析物更溶于有有機溶液帶電荷試用反相或離子交換萃取中 性試用反相萃取樣品基質是有機溶液揮發濃縮分析物，然后將其溶解在另外一種溶劑中。極性易溶于水用水稀釋至有機物少于10%

24、，按照水溶液分析物基質方案進行中等極性非極性不溶于水試用正相或揮發至干，再將其溶于水或一種水互溶性溶劑之中，然后用水稀釋至如上所述，按照水溶液分析物基質方案進行。選擇固相萃取管或片：大小樣品量萃取管規格<1ml1ml1ml至250ml，不要求萃取速度3ml1ml至250ml，要求萃取速度6ml10ml至250ml，要求高樣品容量12，20，60 ml<1l，萃取速度不重要12，20，60ml100ml至1l47mm>1l，要求高樣品容量90mm選擇固相萃取管或片：大管填料量正 相、反 相、吸 附樣品質量不超過填料質量的5%離子交換由離子交換容量確定1. lc-sax和lc-s

25、cx管：其吸附劑容量為0.2毫當量/克（1毫當量=1毫摩爾的+1或-1帶電荷物質）。2. lc-nh2和lc-wcx管：離子交換容量由應用決定。第二步 預處理萃取管或片在萃取樣品之前，為了預處理固相萃取管填料，要用一滿管溶劑沖洗管子。對萃取片則用5-10毫升。反相類型硅膠和非極性吸附劑介質，通常用水溶性有機溶劑，如甲醇，預處理，然后用水或緩沖溶液。甲醇濕潤吸附劑表面和滲透鍵合烷基相，以允許水更有效地潤濕硅膠表面。有時預處理溶劑在此之前使用甲醇。這些溶劑通常與洗脫劑一樣是用于消除固相萃取管上的雜質及其對分析物的干擾，也可能該雜質只溶于強洗脫溶劑。正相類型固相萃取硅膠和極性吸附劑介質通常用樣品所在

26、的有機溶劑來預處理。離子交換填料將用于非極性有機溶劑中的樣品，并用樣品溶劑來預處理。對極性溶劑中的樣品，用水溶性有機溶劑，再用具有適當ph值、適當含量和鹽的濃度的有機溶劑的。為了使固相萃取填料從預處理到樣品加入時都保持潤濕，允許大約1ml的預處理溶劑在管過濾片或萃取片表面上。如果樣品是從一個貯液管或過濾管引入固相萃取管，則多加入0.5ml最后的預處理液到1ml的固相萃取管中、2ml到3ml管中、多加入4ml到6ml管中等等。這是為了保證在樣品加入之前，填料管干了，重復預處理過程。在重新引入有機溶液之前，用水沖洗管中緩沖溶液的鹽。如果適當，此時樣品貯液管可以用一個接口裝在管上。第三步 加入樣品用

27、移液管或微量吸液管準確地將樣品轉移到管或貯液管內，樣品必需以適應固相萃取的形式存在。樣品的總體積可以從微升到數升（見步驟一），當過量體積的水溶液被萃取時，反相硅膠填料漸漸減少預處理時所獲得的溶劑化層。這就會降低萃取效率和樣品的回收率。對樣品>250ml，加入少量的水溶性溶劑（大約為100% ）以適當地保持反相填料的濕潤性。對于每一個的應用和使用條件，樣品的最大容量是特定的。如果回收率較低或重現性不好，可以按以下技術檢測分析物的流失：用一個接口接兩個有相同填料及預處理過的固相萃取管。讓樣品流過這兩個管子，完成以后，分開這兩個管子，分別洗脫。如果在下面管子的萃取物中發現分析物則樣品體太大或填料太少，以導致分析物的流失。為使適當的化合物保留在填料上，洗脫或沉淀不要化合物，要調節ph、鹽的濃度和樣品溶液在有機相中的含量。為了避免堵塞固相萃取管的過濾片或固相萃取片，如果可能，在萃取之前預先過濾或離心樣品。用真空或正壓，慢謾地讓樣品溶液通過萃取裝置，流速會影響某些化臺物的保留。一般來說，對于離子交換固相萃取管，流速小應大于2mlmin；對于其