1、第二章 蛋白質第三節 蛋白質的化學結構一、肽鍵及多肽鏈（一）基本概念肽鍵：蛋白質分子中不同氨基酸是以相同的化學鍵連接的，即前一個氨基酸分子的-羧基與下一個氨基酸分子的-氨基縮合，失去一個水分子形成肽（peptide），該c-n化學鍵稱為肽鍵（peptide bond）。多肽：由兩個氨基酸分子縮合而成的肽稱為二肽；含三個氨基酸的肽，稱為三肽，以此類推；含20個以上的稱多肽（polypeptide）。肽與蛋白質之間無明顯界限，50個以上氨基酸構成的肽一般稱蛋白質。氨基酸殘基：蛋白質中的氨基酸不再是完整的氨基酸分子，稱為氨基酸殘基。多肽鏈：通過肽鍵連接而成的鏈狀結構稱為多肽鏈（polypeptide

2、 chain），其骨架由-n-c-c-重復構成。書寫格式：把含有-nh2的氨基酸殘基寫在多肽鏈的左邊，稱為n-末端（氨基端），把含有-cooh的氨基酸殘基寫在多肽的右邊，稱為c-末端（羧基端）。除肽鍵外，蛋白質中還含有其他類型的共價鍵，例如，蛋白質分子中的兩個半胱氨酸可通過其巰基形成二硫鍵(-s-s-,又稱二硫橋)，這是蛋白質分子中一種常見的共價鍵，可存在于多肽鏈內部或兩條肽鏈之間。（二）肽類存在的生理意義肽類作為小分子蛋白質，在體內有一些相當重要的功能，并有一定的應用價值。如：1.神經肽的類似物內啡肽（endorphins），可作為天然的止痛藥物；2.動物體內的谷胱甘肽具有重要生理功能，它是

3、由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸構成，其中谷氨酸以-羧基而不是-羧基與半胱氨酸形成肽鍵。二、蛋白質的一級結構（一）蛋白質一級結構的概念蛋白質的一級結構（primary structure）是指多肽鏈上各種氨基酸殘基的排列順序。一級結構的基本結構鍵是肽鍵。一級結構是蛋白質的結構基礎，也是各種蛋白質的區別所在，不同蛋白質具有不同的一級結構。（二）一級結構的測定三、蛋白質的高級結構構象：蛋白質在體內發揮各種功能不是以簡單的線性肽鏈形式，而是折疊成特定的、具有生物活性的立體結構，即構象（conformation）。蛋白質的構象是指分子中所有原子和基團在空間的排布，又稱空間結構或三維結構（three dime

4、nsional structure），是由于化學鍵的旋轉造成的。與構型不同。（一）蛋白質結構的層次蛋白質分子是結構極其復雜的生物大分子，有的蛋白質分子只包含一條多肽鏈，有的則包含數條多肽鏈。為研究方便，可將蛋白質的結構劃分為幾個層次，包括：蛋白質一級結構二級結構（secondary structure）超二級結構（super secondary structure）結構域(structural domain)三級結構(tertiary structure)四級結構(quaternary structure)一級結構：指多肽鏈上的氨基酸排列順序。二級結構：指多肽鏈主鏈骨架的局部空間結構。超二級結

5、構：指二級結構的組合。結構域：指多肽鏈上致密的、相對獨立的球狀區域。三級結構：指多肽鏈上所有原子和基團的空間排布。四級結構：則由幾條肽鏈構成。（二）肽單位和二面角1 . 肽單位的結構特征蛋白質中肽鍵的c、n及其相連的4個原子共同組成肽單位（peptide unit），這幾個原子形成一個平面，稱肽平面或酰胺平面。肽平面具有以下結構特征：n-c肽鍵的鍵長介于典型的c-n單鍵和雙鍵之間，具有部分雙鍵性質，不能自由旋轉。肽平面具有順式（cis）和反式（trans）兩種構型，反式構型中相鄰的兩個c在肽鏈的兩側。由于立體結構的制約，蛋白質中幾乎所有的肽平面都呈反式結構，僅有少數是順式結構。2. 二面角多肽

6、鏈中所有的肽單位大多數具有相同的結構，每個-碳原子和與其相連的4個原子都呈現正四面體構型。因此，多肽鏈的主鏈骨架構象是由一系列-碳原子的成對二面角決定的。（三）維持蛋白質分子構象的化學鍵蛋白質分子構象主要靠非共價鍵維持，如氫鍵、范德華力、疏水作用力、離子鍵。在某些蛋白質中二硫鍵、配位鍵也參與維持構象。 （四）二級結構二級結構：多肽鏈主鏈骨架中局部的規則構象稱為二級結構，是主鏈肽鍵形成氫鍵造成的，不包括r側鏈的構象。包括-螺旋(-helix)、-折疊(-sheet)和-轉角(-turn)和無規則卷曲。1.-螺旋典型的-螺旋具有下列特征：（1）多肽鏈主鏈骨架圍繞同一中心軸呈螺旋式上升，形成棒狀的螺

7、旋結構。每圈包含3.6個氨基酸殘基（1個羧基、3個n-c-c單位、1個n），螺距為0.54nm，因此，每個氨基酸殘基圍繞螺旋中心軸旋轉100度，上升0.15nm。（2）相鄰的螺旋之間形成氫鍵，氫鍵的方向與-螺旋軸的方向幾乎平行。-螺旋中每個羧基氧原子（n）與朝向羧基c-末端的第4個氨基酸殘基的-氨基n原子（n+4）形成氫鍵。由氫鍵封閉的環共包含13個原子，故典型的-螺旋又稱3.613螺旋。每個肽鍵均參與氫鍵形成，因此，盡管氫鍵的鍵能不大，但大量氫鍵的累加效應使-螺旋成為最穩定的二級結構。2. -折疊（-pleated sheet或稱-sheet）-折疊：也是蛋白質中最常見的一種主鏈構象，是指蛋

8、白質主鏈中伸展的、周期性折疊的構象，很像-螺旋適當伸展形成的鋸齒狀肽鏈結構。-折疊分為兩種形式：平行-折疊：兩條-折疊股走向相同。反平行-折疊：兩條-折疊股走向相反。兩條借助氫鍵連接的-折疊股形成片層，氨基酸的r側鏈交替出現在片層的兩側。3. -轉角-轉角：在多肽鏈的主鏈骨架中，經常出現1800的轉彎，此處結構主要是-轉角。結構特征：-轉角由4個氨基酸殘基組成，第一個殘基的羰基氧原子與第4個殘基的酰胺基的氫原子形成氫鍵。4. 無規卷曲無規卷曲：球蛋白分子中除了上述有規則的二級結構外，主鏈上還常常存在大量沒有規律的卷曲，其二面角（、）都不規則，稱無規卷曲（random coil）。對已知的67種

9、蛋白質結構分析表明，幾種二級結構的比例：-螺旋為26%，-折疊為19%，-轉角為15%。（五）超二級結構超二級結構：在蛋白質中經常存在由若干相鄰的二級結構單元按一定規律組合在一起，形成有規則的二級結構集合體，稱超二級結構（super secondary structure）。超二級結構又稱基序（motif）,可能有特殊的功能或僅充當更高層次結構的元件，常見的有-螺旋與-折疊的組合形式。（六） 結構域（structural domain）結構域：球蛋白分子的一條多肽鏈中常存在一些緊密的、相對獨立的區域，稱結構域，是在超二級結構的基礎上形成的具有一定功能的結構單位。結構域被認為是蛋白質的折疊單位，

10、在新生肽鏈折疊中發揮重要作用。較大的球蛋白分子包含2個或2個以上的結構域，例如：免疫球蛋白（抗體）分子包含12個結構域；較小的球蛋白分子只包含一個結構域，如肌紅蛋白分子。結構域平均大小約為100個氨基酸殘基。結構域之間的區域常形成裂縫，可作為與其他分子結合的位點。（七）三級結構三級結構：是指多肽鏈中所有原子和基團在三維空間中的排布，是有生物活性的構象或稱為天然構象。通過肽鏈折疊使一級結構相距很遠的氨基酸殘基彼此靠近，進而導致其側鏈的相互作用。三級結構是在二級結構的基礎上，通過氨基酸殘基r側鏈間的非共價鍵作用形成的緊密球狀構象，是多肽鏈折疊形成的，也是蛋白質發揮生物學功能所必需的。（八）四級結構

11、四級結構：較大的球蛋白分子往往由兩條或多條肽鏈組成。這些多肽鏈本身都具有特定的三級結構，稱為亞基（subunit）, 亞基之間以非共價鍵相連。亞基的種類、數目、空間排布以及相互作用稱為蛋白質的四級結構。蛋白質的四級結構不涉及亞基本身的結構。亞基一般只包含一條多肽鏈，亞基間的相互作用力與穩定三級結構的化學鍵相比通常較弱，體外很容易將亞基分開，但亞基在體內緊密聯系。由少數亞基聚合而成的蛋白質，稱為寡聚蛋白（oligomeric protein）。寡聚蛋白中的不同亞基可以用、命名區分，亞基數目通常為偶數，種類一般不多。維持四級結構的作用力主要是疏水作用力，另外還有離子鍵、氫鍵、范德華引力等。 第四節

12、 多肽、蛋白質結構與功能的關系一、不同生物來源的胰島素一級結構比較重點掌握守恒氨基酸殘基的概念守恒殘基：比較各種哺乳類、鳥類和魚類等動物胰島素（insulin）的一級結構，發現組成胰島素分子的51個氨基酸殘基中，只有24個氨基酸殘基始終保持不變，為不同生物所共有。這些始終不變的稱為守恒殘基。結構特點：1如6個cys是守恒殘基，提示不同來源的胰島素分子中a、b鏈之間有共同的連接方式，3對二硫鍵對維持高級結構起著重要作用；2其它絕大多數守恒殘基是帶有疏水側鏈的氨基酸。x-射線晶體結構分析證明，這些非極性的氨基酸對維持胰島素分子的高級結構起著穩定作用。因而推測，不同動物來源的胰島素的空間結構可能大致

13、相同。一般認為，激素的活性中心以及維持活性中心構象的氨基酸殘基不能改變，否則，激素將失去生物活性。3胰島素a鏈的8、9、10位和b鏈30位氨基酸殘基存在種屬差異，說明這些氨基酸對胰島素的生物活性并不起決定作用。一般認為，這些可變動的氨基酸不處于激素的關鍵部位，或者對維持關鍵部位的構象不重要，只與免疫活性有關。二、蛋白質前體激活概念: 動物體內有些蛋白質是以無活性的前體（precursor）形式產生和貯存的。這些前體在機體需要時，經過某種蛋白酶的水解，切去部分肽段后，才變成有活性的蛋白質，這一過程稱為蛋白質前體的激活。這類蛋白質稱為蛋白質原，如參與蛋白質消化的胃蛋白酶原、參與血液凝固的凝血酶原、

14、參與糖代謝調節的胰島素原等。前體激活在人和動物體普遍存在的，胰島素原激活成胰島素就是其中的一例。三、一級結構變異與分子病分子?。夯蛲蛔儗е碌鞍踪|一級結構的突變。如果這種突變導致蛋白質生物功能的下降或喪失，就會產生疾病，這種病稱為分子病（molecular disease）。例如：在非洲普遍流行的鐮刀形紅細胞貧血病，就是由于血紅蛋白一級結構的變異而產生的一種分子病。病人的異常血紅蛋白與正常人的血紅蛋白相比，僅僅是-亞基（也稱-鏈）第6位氨基酸殘基不同：正常人為glu，而病人為val。四、血紅蛋白的變構作用與運輸氧的功能（重點）血紅蛋白和肌紅蛋白與氧結合時表現出不同的結合模式：血紅蛋白的氧結合曲

15、線是s形曲線（sigmoidal curve）；而肌紅蛋白的氧結合曲線是雙曲線。了解s形曲線的結合特點，掌握s形曲線對機體的生理意義。血紅蛋白與氧結合并發生構象的改變是變構效應（allosteric effect）的一個范例變構效應：是指在寡聚蛋白分子中，一個亞基由于與其他分子結合而發生構象變化，并引起相鄰其他亞基的構象和功能的改變。變構效應也存在于其他寡聚蛋白（如變構酶）分子中，是機體調節蛋白質或酶生物活性的一種方式。第五節蛋白質的理化性質一、蛋白質的兩性解離和等電點（重點）重點掌握蛋白質的等電點概念蛋白質分子中有許多可解離的基團，除了肽鏈末端的-氨基和-羧基以外，還有各種側鏈基團，如asp

16、和glu側鏈的羧基、lys的-氨基、arg的胍基、cys的巰基、tyr的酚基。因此，蛋白質與氨基酸類似，是兩性電解質。等電點：蛋白質的解離取決于溶液的ph值。在酸性溶液中，各種堿性基團與質子結合，使蛋白質分子帶正電荷，在電場中向陰極移動；在堿性溶液中，各種酸性基團釋放質子，使蛋白質帶負電荷，在電場中向陽極移動。當溶液在某個ph值時，蛋白質分子所帶正電荷數與負電荷數恰好相等，凈電荷為零，在電場中既不向陽極移動，也不向陰極移動，此時溶液的ph值就是該蛋白質的等電點。等電點大小由蛋白質分子中可解離基團的種類和數量決定。二、蛋白質的高分子性質蛋白質在水溶液中為什么以穩定的膠體溶液存在？蛋白質是大分子，

17、大小在膠體溶液的顆粒直徑范圍之內。絕大多數親水基團分布在球蛋白分子的表面，在水溶液中能與極性水分子結合，從而使許多水分子在球蛋白分子的周圍形成一層水化層（水膜）。由于水化層的分隔作用，使許多球蛋白分子不能互相結合，而是均勻地分散在水溶液中，形成親水性膠體溶液。此親水膠體溶液是比較穩定的，原因有兩個：一是球狀大分子表面的水膜將各個大分子分隔開來；二是各個球狀大分子帶有相同的電荷，由于同性電荷的相互排斥，使大分子不能互相合成較大的顆粒。鹽溶：在蛋白質水溶液中，加入少量的中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等，會增加蛋白質分子表面的電荷，增強蛋白質分子與水分子的作用，從而使蛋白質在水溶液中的溶解度增大。

18、這種現象成為鹽溶（salting in）。鹽析：但在高濃度的鹽溶液中，無機鹽離子從蛋白質分子的水膜中奪取水分子，破壞水膜，使蛋白質分子相互結合而發生沉淀。這種現象稱為鹽析（salting out）。三、蛋白質的變性和復性（重點）（一）蛋白質的變性和變性因素變性：在某些理化因素作用下，蛋白質的一級結構保持不變，空間結構發生改變，即由天然狀態（折疊態）變成了變性狀態（伸展態），從而引起生物功能的喪失以及物理、化學性質的改變，這種現象被稱為變性(denaturation)。變性后的蛋白質稱變性蛋白質；沒有變性的稱天然蛋白質。引起天然蛋白質變性的因素：物理因素，如熱（60-100）、紫外線、x射線、超

19、聲波、高壓等；化學因素（又稱變性劑），包括酸、堿、有機溶劑（如乙醇、丙酮等）、尿素、重金屬鹽、三氯醋酸以及去污劑等。不同的蛋白質對上述各種變性因素的敏感程度不同。對于含有二硫鍵的蛋白質，使其變性除了需要破壞疏水作用力、氫鍵外，還需要破壞二硫鍵?？梢约尤霂€基試劑如-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，dtt）使二硫鍵還原。 變性蛋白質有下列各種表現：1生物活性喪失，如酶喪失催化活性；激素蛋白喪失生理調節作用；抗體失去與抗原專一結合的能力。另外，蛋白質的抗原性也發生改變。2物理性質發生改變，如溶解度明顯降低，易結絮、凝固沉淀，失去結晶能力，電泳遷移率改變，粘度增加，紫外光譜和熒光光

20、譜發生改變等。3化學性質發生改變，如容易被蛋白酶水解。變性機理：天然蛋白質分子的構象主要是通過各種次級鍵來維持的。變性因素破壞了蛋白質分子構象中的次級鍵，從而使蛋白質分子從原來緊密有序的折疊構象（天然態）變成了松散無序的伸展構象（變性態）。變性蛋白質容易聚集沉淀，為什么？ 變性蛋白質的溶解度降低，是由于多肽鏈從折疊態變成了伸展態，使原來埋藏在分子內部的疏水基團暴露在分子表面上，從而使蛋白質分子表面不能與水分子結合而失去水化膜，導致分子間相互碰撞增加而聚集沉淀。（二）復性復性：有些蛋白質，尤其是小分子蛋白質，變性后在適當條件下可以恢復折疊狀態，并恢復全部的生物活性，這種現象稱為復性（renatu

21、ration）。熱變性后的蛋白通常很難復性。例如：核糖核酸酶a的復性。（三）變性的利用和預防蛋白質變性有許多實際應用。例如：1在醫療上利用高溫高壓消毒手術器械、用紫外線照射手術室、用70%酒精消毒手術部位的皮膚。這些變性因素都可使細菌、病毒的蛋白質發生變性，從而失去致病作用，防止傷口感染；2.在蛋白質、酶的分離純化過程中，為了防止蛋白質變性，必須保持低溫，防止強酸、強堿、重金屬鹽、劇烈震蕩等變性因素的影響。四、蛋白質的紫外吸收（重點）蛋白質不能吸收可見光，但能吸收一定波長范圍內的紫外光。大多數蛋白質在280nm波長附近有一個吸收峰?？梢岳米贤馕辗ǎ鶕鞍踪|溶液在280nm波長的吸收值測定蛋白質濃度。五、蛋白質的沉淀作用（一）鹽析法如上所述，高濃度的中性鹽類可以脫去蛋白質分子表面的水膜，并中和蛋白質分子的電荷，從而使蛋白質由于鹽析作用從溶液中沉淀下來。由于不同蛋白質分子的水膜厚度和帶電量不同，因此，使不同蛋白質鹽析所需要的鹽濃度有不同程度差別。這樣，逐步加大鹽濃度，可以上所述，高濃度的中性鹽類可以脫去蛋白質分子表面的水膜，并中和蛋白質分子的電荷，從而使蛋白質由于鹽析作用從溶液中沉淀下來。分級鹽析法：由于不同蛋白質分子的水膜厚度和帶電量不同，因此，使不同蛋白質鹽析所需要的鹽濃度有不同程度差別。這樣，逐步加大鹽濃度，可以使不同蛋白質從溶液中分階段沉淀。這種方法稱分級鹽析法，常