1、移植受者免疫抑制治療影響外周血微量CMV DNA的變化【摘要】 目的:探討移植術后免疫抑制治療個體,外周血中巨細胞病毒脫氧核糖核酸（CMV DNA）的變化規律，并評價其潛在的臨床應用價值。方法:通過對免疫抑制治療個體、健康個體外周血微量CMV DNA的檢測，分析CMV DNA與免疫抑制劑濃度的關系；同時對30例患者的連續標本進行配對實驗，說明過度免疫抑制可導致微量CMV DNA的出現。結果:健康個體組、環孢素組、FK506組中微量CMV DNA陽性率分別達到0%、42.24%和11.8%，陽性組平均免疫抑制藥物濃度明顯高于陰性組（P<0.05），高藥物濃度組陽性率明顯高于低濃度組

2、（P<0.05）。配對實驗提供了相同的結果。結論:免疫抑制藥物濃度影響微量CMV DNA動態的變化，部分反映了個體免疫抑制狀態，對指導臨床用藥有一定的價值。 【關鍵詞】 移植 免疫抑制 巨細胞病毒 Abstract: Objective:To investigate approved immunosupression concentration whether influence trace CMV DNA in peripheral blood mononuclear cells of the posttransplantion. Methods: 294 cases of p

3、atients (410 cases of blood sample) of post-transplantation and 96 cases samples of health check up were collected continuously in 2 months. Immunosuppression concentration and CMV DNA were measured with TDx，IMX and nested PCR respectively. Immunosuppression concentration of patients whose samples w

4、ere continuously detected CMV DNA positive and negative were analyzed by paired samples test. Result: CMV DNA was detected in 42.24% and 11.8% in CSA or FK506 treated patients but not in all 96 health check up individuals. As CSA concentration up to 200ng/ml, patients had highest CMV DNA positive ra

5、te 55.71% (P<0.05）. The mean CSA and FK506 concentrations of CMV DNA positive group were higher than that of CMV DNA negative group (P<0.05）;paired samples test get the more significant result （P<0.05）. Conclusion: Nested PCR detected CMV DNA maybe an assay for indirectly evalua

6、ted immunosupression state of the posttransplantation. Key words: transplantation；immunosuppression；CMV 排斥或感染一直是移植受者服用免疫抑制藥物必須面臨的兩大問題。而解決此矛盾的首要措施即是尋找一個能綜合反映個體免疫狀態的指標，建立評價個體免疫抑制狀態的有效技術。國人抗CMV IgG陽性率接近100%，世界范圍內亦有60%100%的感染率。根據CMV的潛伏感染特點，嘗試以外周血微量CMV DNA作為評價免疫抑制狀態的指標，采用敏感的巢式聚合酶鏈反應（nPCR）技術檢測移植受者外周血中微量CM

7、V DNA，并探討其與免疫抑制程度的關系。 1 材料和方法 1.1 免疫抑制藥物濃度檢測 受者的免疫抑制方案均以環孢素（CSA）或他克莫司（FK506）為主。服藥前，抽取靜脈血測全血CSA或FK506濃度谷值。CSA、FK506濃度分別采用酶免疫發光技術（儀器Abbott TDx）和微粒子酶免疫分析技術（儀器Abbott IMx）測定。 1.2 標本及分組 采用酶聯免疫吸附試驗檢測受者及96例健康體檢人員的血漿CMV IgG抗體，并檢測CMV DNA。連續收集2006年10月至2006年12月移植隨訪者藥物濃度檢測血標本，共294例受者，410例次。移植隨訪者均為移植術后3個月以上。其中服用C

8、SA為173人，服用FK506為121人；男180例，女114例，平均年齡（44.39±11.97）歲。根據免疫藥物濃度（CSA以200 ng/ml或120 ng/ml為界線；而FK506濃度以5 ng/ml為界線）將其分組。另根據CMV DNA檢測結果將其分為陽性組和陰性組。其中46例多次檢測，當同一個體先后出現CMV DNA陽性和陰性時對其藥物濃度進行配對比較（此兩標本為連續收集的標本）。移植患者術前行常規CMV DNA檢查，結果均提示陰性。移植患者術后第3周開始予更昔絡維針250 mg/d預防病毒感染治療，療程1周。 1.3 DNA提取 收集環孢素濃度測定標本，取300l全血加

9、入0.98%的NH4Cl 1ml破紅細胞膜10 min，離心后取白細胞加入300l細胞裂解液，充分混勻后放置10 min；加入蛋白質沉淀液150l充分混勻，離心5 min(12 000 r/min)；取上清液加入異丙醇300l沉淀蛋白質；以75%乙醇洗3次，待乙醇蒸發后加入溶解液100l，-20 保存。 1.4 核酸擴增 nPCR:根據CMV病毒基因組設計引物,第一次PCR擴增引物分別為P1 5'-TCTAAGAC ATAGCAGCACAGCACC-3'和P2 5'-TGAAAAAATATACCCAGAC GGAAG-3'；第二次PCR擴增引物分別為P3 5&#

10、39;-AGCAC CCGACAGAACTCACT-3'和P4 5'-TATGGCTTATGCCCAGAAAA-3'。取1l DNA用于10l的 PCR體系，其中包括：10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、50 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L dNTP、0.45 U Taq polymerase、0.1M引物和5%甘油。第一次PCR條件為94 2 min后，進行30個循環，94 20 s，58 60 s，72 60 s；最后進行72 2 min延伸。完成后取1l PCR產物用于第二次擴增，94 2 min后，進行25

11、個循環，94 10 s，55 30 s，72 30 s；最后進行72 2 min延伸。經2%的瓊脂糖電泳，紫外分析儀上觀察結果。標本分別檢測3次，出現一次陽性便判斷為陽性。常規PCR:反應條件同上，循環次數增加到35次，引物分別采用P3、P4。 1.5 臨床觀察 對所有具CMV發病癥狀的受者進行常規pp65檢測。通過核對pp65記錄，回顧性分析CMV DNA陽性受者是否出現CMV發病的典型癥狀。 1.6 統計學處理方法 對CMV DNA陽性、陰性兩組環孢素、FK506濃度進行student T test分析。采用卡方檢驗分析不同免疫抑制藥物濃度組CMV DNA陽性率的差別。配對兩組進行非參數M

12、ann Whitney檢驗。 2 結果 2.1 CMV DNA陽性受者平均免疫抑制藥物濃度高于陰性受者 所有受者和96例健康體檢者CMV IgG均為陽性。232例次標本的平均環孢素濃度為（165.42±89.90）ng/ml，CMV DNA nPCR檢出率為42.24%（98/232），常規PCR未能檢測到陽性結果（0%）；96例健康體檢個體采用nPCR未檢測到CMV DNA。CMV DNA陽性組環孢素濃度明顯高于CMV DNA陰性組，兩者差異有顯著性（見表1）。在服用FK506的患者中亦有相同結果（7.943±4.22）ng/ml vs（6.314±3.92）n

13、g/ml；P=0.025，其中10例患者前后配對實驗亦顯示有相近的結果（P0.05）。 2.2 高藥物濃度組CMV DNA陽性率增加 同樣，以6 ng/ml為界FK506高濃度組微量CMV DNA陽性率明顯高于低FK506濃度組（P0.05），有統計學差異。 2.3 CMV DNA陽性結果并非CMV發病 所有受者中8例出現臨床類似癥狀，懷疑CMV感染需要檢測pp65抗原，但結果均為陰性，不能診斷為CMV抗原血癥或CMV發病。8例患者中兩例受者可檢測到微量CMV DNA。 3 討論 CSA、FK506是從土壤真菌中提取的抗生素，具有強大的免疫抑制作用，是移植后免疫抑制治療方案的主要成分。但是過度

14、的免疫抑制會造成嚴重的不良后果，其中，感染是移植術后受者死亡的主要原因，了解免疫抑制治療是否應用過度是預防發生感染的重要手段。臨床觀察發現外周血中高濃度的免疫抑制藥物可導致多種感染的發生，由于缺乏免疫抑制狀態的評價指標而僅能通過臨床經驗進行治療，如術后1個月內服用更昔洛韋和磺胺類藥物預防感染發生。 CMV是免疫抑制受者最易感染的病原體之一。主要原因是CMV在初次感染產生免疫應答后，還可在體內潛伏感染。在這種潛伏感染狀態下，采用nPCR方法檢查，健康個體外周血中極少出現微量CMV DNA（0.2%）1，2。個體免疫狀態是決定CMV發病的主要因素，孕婦、新生兒、艾滋病患者、腫瘤患者和免疫抑制劑使用

15、者發病幾率明顯高于正常個體3。目前普遍采用抗pp65蛋白抗體標記外周血白細胞，呈陽性者可診斷為CMV抗原血癥提示CMV發病，或通過熒光定量PCR檢測CMV DNA診斷CMV病3。nPCR比傳統PCR具有更高的靈敏度，其檢測范圍亦高于熒光定量PCR技術，但是其陽性結果并不提示發生CMV病。 目前為止，尚未建立評價個體免疫狀態的指標或系統。如果以體內潛伏的病毒作為靶目標，檢測此微量病毒可能對評估整體免疫是一個有效手段。nPCR可檢測到極微量CMV DNA，我們發現移植術后接受免疫抑制治療的受者中42.24%在其外周血中可檢測到CMV DNA，而96例健康體檢的個體無一例呈陽性結果。就潛伏感染個體而

16、言，隨著免疫抑制藥物濃度上升必然發生CMV病4，移植最初的3個月內血CSA谷濃度可超過200 ng/ml，是需要抗病毒預防治療的階段。nPCR證實當免疫抑制達到此水平時可使55.71%的患者體內潛伏CMV激活并可檢測到微量CMV DNA。如果未見明顯癥狀，這時機體的免疫狀態同CMV達到一個平衡，即受者不能完全清除CMV又不發病。我們發現當免疫抑制藥物濃度升高時CMV DNA陽性率亦增加，可出現伴隨藥物濃度的升降而出現CMV DNA陽性、陰性的動態變化可以認為微量CMV DNA間接反映了免疫抑制程度。但是并非所有使用免疫抑制受者都會出現微量CMV DNA，微量CMV DNA陰性的個體CSA濃度處

17、于相對較低水平，這部分受者在本實驗期間亦未出現急性排斥癥狀，證實有效的免疫抑制可以同時避免排斥發生和CMV激活。但在環孢素濃度小于120 ng/ml組中尚有32.9%的患者有微量CMV DNA存在，可能提示其個體因素（如對免疫抑制藥物敏感）或與其他免疫抑制劑聯合用藥而存在過度免疫抑制。由于缺乏評價個體免疫狀態的指標或系統，此實驗只能結合藥物濃度和微量CMV DNA的出現來解釋免疫抑制狀態。 免疫抑制程度決定了排斥或感染的發生，如何做到恰如其分地進行個體化治療一直是臨床討論的話題。相同范圍的免疫抑制藥物濃度，對不同個體產生的免疫抑制程度和毒性也不相同，臨床治療須體現出個體化，但評價個體的免疫抑制

18、程度、免疫狀態的方法和標準并未確定5，6。用微量CMV DNA評價服用FK506患者的免疫抑制程度，并未表現出同CSA組一樣大的差別，但兩者都顯示了相同的趨勢。故我們認為以體內潛伏的CMV激活作為反映機體免疫抑制程度的指標，結合敏感的nPCR技術，可能是反映機體免疫抑制程度的有效方法。那么能否對狀態穩定的受者根據微量CMV DNA情況并結合臨床調整免疫抑制劑的用藥呢，這確實還需要大量的臨床實踐及進一步的實驗室和臨床證據才能確定。【參考文獻】 1 Roback JD, Drew WL, Laycock ME,et al. CMV DNA is rarely detected in healthy

19、 blood donors using validated PCR assaysJ. Transfusion, 2003, 43(3):314-321.2 Greenlee DJ, Fan H, Lawless K, et al. Quantitation of CMV by real-time PCR in transfusable RBC unitsJ. Transfusion, 2002, 42(4):403-408.3 Navalpotro D, Gimeno C, Navarro D. PCR detection of viral DNA in serum as an ancillary analysis for the diagnosis