1、ics 11220b 41n y中華人民共sn國農業行業標準nyt 1 1882006水泡性口炎診斷技術diagnosis techniques for vesicular stomatitis20060710發布 200610一01實施中華人民共和國農業部發布nyt 1 1882006刖置 水泡性口炎(vs)是由彈狀病毒科的水泡性口炎病毒(vsv)引起的馬、牛和豬的一種水泡性疾病，被世界動物衛生組織(oie)列為a類動物疫病，我國將其列為二類疫病。本病臨床上與口蹄疫、豬水泡 病、豬水泡疹很難區別，主要表現為口唇部有水泡、潰瘍、糜爛，影響采食，導致生長緩慢，影響經濟效益。 oie采用組織細胞、

2、雞胚、實驗動物等方法分離水泡性口炎病毒，進一步用問接夾心酶聯免疫吸附 試驗(iselisa)和補體結合試驗(cf)對分離的病毒進行鑒定；在國際貿易中，oie指定用液相阻斷酶聯免疫吸附試驗(lpelisa)、病毒中和試驗(vn)和補體結合試驗(cf)檢測水泡性口炎血清樣品。本標準中水泡性口炎的病毒分離試驗、iselisa試驗和病毒中和試驗，是根據oie哺乳動物、 禽、蜜蜂a和b類疾病診斷實驗和疫苗標準手冊)(2000版)中的診斷技術以及國內近年來在水泡性口 炎方面的研究成果而制定的，其中病毒分離試驗、is-elisa試驗和病毒中和試驗均與oie的標準性文 件等效。本標準的附錄a為規范性附錄。 本

3、標準由中華人民共和國農業部提出。 本標準由全國動物防疫標準化技術委員會歸口。 本標準起草單位：農業部動物檢疫所。 本標準主要起草人：李其平、龔振華、陸明哲、鄭增忍、郭福生、蔣正軍、王海霞。nyt 11882006水泡性口炎診斷技術1范圍 本標準規定了水泡性口炎(vs)的病毒分離鑒定試驗、間接夾心酶聯免疫吸附試驗(iselisa)和病毒中和試驗(vn)的技術要求。 本標準適用于水泡性口炎流行病學調查、臨床診斷和實驗室檢測等。2病原分離與鑒定21病原分離211器材100 ml玻璃細胞培養瓶，恒溫水浴箱，c02培養箱，超凈工作臺，倒置顯微鏡。212試劑及溶液配制mem營養液，pbs緩沖液，犢牛血清，

4、75碳酸氫鈉溶液，青霉素(104tuml)與鏈霉素(104mgml)溶液，3的谷氨酰胺溶液，hanks液，滅菌生理鹽水，025胰蛋白酶溶液，緩沖甘油(ph 7277)，配制方法見附錄a。2 13樣品的采集2131采集發病動物口鼻部位的水泡皮和水泡液，水泡皮加人含50甘油的pbs緩沖液中，水泡液 置于含2犢牛血清和5葡萄糖的滅菌生理鹽水中，冷藏送檢。保存液的體積不能超過水泡皮或水泡 液體積的2倍。2132不能獲得水泡皮和水泡液時，牛可用探杯采集食道n因(op)黏液，豬可采集咽喉拭子，置于無 血清的細胞培養液中，冷藏送檢。無血清細胞培養液的體積不能超過黏液或咽喉拭子的2倍。214樣品的處理2141

5、將水泡皮剪碎，研磨，懸浮于5倍體積的ph72、02 moll的pbs緩沖液中(含青霉素1 000iuml、鏈霉素l 000mgml)，4浸漬16h-20h，以3000 rmin離心15rain，取上清液，用o2m微孔濾膜過濾。2142將水泡液、op液、棉拭子浸液加青霉素至1 000iuml、鏈霉素至1 000mgml，離心，取上清液，用02舯微孔濾膜過濾。215細胞接種2151將214的樣品1ml接種長成單層的vero細胞、bhk一21細胞或ibrs一2細胞，37吸 附1 h，中間搖動一次。2152加入9 ml維持液，37*(3、5c02培養箱中培養。2153每天觀察細胞病變效應(cpe)，連

6、續觀察3天。2154如果細胞出現圓縮、聚集、固縮、脫落等病變，則進一步按方法22進行病原鑒定。盲傳3代無病變者按218處理。216雞胚接種2161將雞胚卵置于蛋架上，氣室朝上，以碘酒、酒精棉球消毒氣室，用剪刀去除氣室部蛋殼。2162用無菌眼科鑷子撕去一小片內殼膜，在絨毛尿囊膜上滴入214中的樣品02ml。2163用無菌脫脂棉撕成薄片蓋住蛋殼，用蠟封口，于37孵育。12164如果雞胚2天內死亡，雞胚周身呈明顯充血、出血，尿囊膜肥厚，收獲尿囊膜按22方法作進 一步鑒定。盲傳3代無病變者按218處理。217乳鼠接種2171將214的樣品頸部皮下接種2日-7日齡乳鼠，每只接種02ml。2172每天觀察

7、乳鼠病變，連續觀察5天。2173如果乳鼠出現死亡、生長不良等病變，則按22方法進一步鑒定。盲傳3代無病變者按218處理。218可疑非免疫動物樣品盲傳3代未分離到病毒者，可進一步采集7 d14 d后的該動物血清，用方法3進行抗體檢測。若檢測結果為陰性，則判為無、v感染；若檢測結果為陽性，則判為有vsv感染。22病原鑒定一間接夾心酶聯免疫吸附試驗(is·elisa】221器材40孔帶蓋滅菌酶標板，單道可調(10-l-200止)移液器，8和12道可調(50tl-200“l)移液器，滅菌塑料滴頭。222試劑及溶液2221試劑：抗原，豚鼠抗vsv的標準nj型和ind型血清，兔抗vsv的標準nj

8、型和ind型血 清，兔抗豚鼠18(3，正常兔血清，卵白蛋白，tmb底物。2222溶液：ph72、02moll的pbs緩沖液，ph 96的碳酸鹽碳酸氫鹽緩沖液，pbstb，配制見 附錄a。23樣品樣品采集、處理與213-214相同。24操作方法241用ph96的碳酸鹽碳酸氫鹽緩沖液將兔抗、v的nj型陽性血清、ind型陽性血清和正常兔血清包被elisa板，每孔50止，于4"c過夜。242棄包被液，每孔用磷酸緩沖鹽水(pbs)洗1次，加50 pll的卵白蛋白(用pbs液稀釋)，在室溫下封板1 h。243棄封閉液，每孔用pbstb沖洗3次。244將被檢樣品懸液或21中致病變的分離培養物50

9、pl加到相應的孔中，每份樣品均作雙孔，振 蕩，37孵育30 min。245棄反應液，每孔用pbstb沖洗5次。2 46將與包被elisa板的兔抗vsv標準陽性血清相應的豚鼠抗vsv的標準nj型和ind型陽性血清用pbstb稀釋，分別加50止到相應的孔中，振蕩，37'c孵育30min。247重復245。248將過氧化物酶兔抗豚鼠igg結合物用pbstb稀釋，每孔加入50止，振蕩，37孵育30 min。249重復245。2410每孔加活化的tmb底物50止，在室溫下反應15min，隨后加入50,ul 1m硫酸終止反應，用 酶標儀測定吸光值。2411設標準陽性抗原對照。2412結果判定241

10、21讀取樣品與抗vsv的nj型、inm型陽性血清和正常兔血清反應的吸光值，計算雙孔平均值。2nyt 1188200624122對照抗原與其相應血清反應的吸光值較其與另一型血清反應的吸光值和正常兔血清反應的吸光值大20，試驗成立。24123如果某個血清型反應的吸光值與另一血清型反應的吸光值和正常兔血清反應的吸光值相比 較，其樣品吸光值大于后兩者20，則被檢樣品為感染該相應血清型的vsv。24124如果某個血清型反應的吸光值與另一血清型反應的吸光值和正常兔血清反應的吸光值相比較，其樣品吸光值大于后兩者，但不超過20，應重復試驗，如仍不超過20，則為陰性。3中和試驗(本方法用于檢測vsv抗體)31器

11、材96孔細胞培養板，其他器材同21。32試劑及溶液配制vsv的nj型、ind型病毒，vsv的nj型、ind型陽性血清和陰性血清，細胞培養用培養液及溶液 配制與212相同。33樣品的采集和處理 無菌采集血液，常規分離血清，將待檢血清樣品置56"c水浴滅活30 min。34操作方法341病毒半數組織培養感染【tcidso)的測定3411將jv標準毒株接種于長成單層的ibrs一2細胞，接種量為培養基液的110，37"c培養， 待出現病變后，凍融，收獲病毒。3412用mem培養液將vsv病毒作連續10倍稀釋，即10、10。2每個稀釋度取50皿加入96孔細胞培養板中，隨后加入經025

12、胰酶消化的ibrs一2細胞懸液150 vtl(總細胞數約為3×105個左右)，每個稀釋度作8個孔重復，并設正常細胞對照。置37"c5c02培養箱中。3413逐el觀察細胞病變，共觀察3 d-4 d，記錄細胞病變孔數。按照reedmuench法計算病毒的 tci耽o。34 2中和試驗3421在細胞培養板各孔中加入50 btl mem培養液，隨后在第1孔中加入1：2稀釋待檢血清50止 混合后，用微量移液器取出50止，加到第2孔中，混勻后取出50止再加入第3孔中，依此類推，直到第10孔，血清稀釋度即為1：4、1：8 1：2 048，每份待檢血清稀釋度作4個孔重復。3422將50p

13、l含1 000個tcii琺。的病毒液加到不同稀釋度血清孔中，37*(3作用1 h。3423每血清孔中加入100止經胰酶消化分散的ibrs一2細胞懸液(總細胞數約為3×105個左右)。3424設立對照組。34241病毒回歸試驗：每次試驗每一塊板上都設立病毒對照，先將1 000 tcid5050 ml病毒液作01、1、10、100、1 000倍稀釋，每個稀釋度作4孔，每fl加50 ul病毒液，然后每孔加150,ul ibrs一2細胞懸液(總細胞數約為3×105個)。34242陽性血清、陰性血清、待檢血清和正常細胞對照。3425逐el觀察，記錄病變和非病變孔數，共觀察3 d4 d

14、。病毒回歸試驗1 000 tcid50值應為500-1 330之間，陽性血清和陰性血清的滴度在其預先測定的平均值2倍以內，待檢血清和正常細胞對照成立，測定結果方有效，否則該試驗不能成立。343抗體中和效價 按照spearlnannkarber法計算抗體中和效價。如抗體效價大于1：40，則判為vsv抗體陽性。3nyt”882006附錄a (規范性附錄) 培養基及溶液的配制a1細胞生長液mem按常規方法配制 犢牛血清 10雙抗溶液 1 谷氨酰胺 1 丙酮酸鈉 1用75的碳酸氫鈉調ph至70-72。置4保存。 a2細胞維持液按常規方法配制mem，在mem中按體積比加入犢牛血清 2雙抗溶液 13谷氨酰

15、胺 1用75的碳酸氫鈉調ph至70-72。置4保存。 a3雙抗(青鏈霉素)溶液青霉素 100萬iu 鏈霉紊 100萬mg 雙蒸水 100ml將雙蒸水放于500 ml瓶中高壓1034 kpa 20 roan。青鏈霉素用少量雙蒸水溶解后，再用雙蒸水定 容至100ml。a475的碳酸氫鈉溶液 碳酸氫鈉(nahc03)75 g雙蒸水 100ml先將濾器滅菌后，加入液體過濾后分裝于青霉素瓶中放4"c保存備用。a53谷氨酰胺溶液谷氨酰胺 3 g 雙蒸水 100ml 過濾除菌，分裝于青霉素瓶中凍結保存。a6025胰蛋白酶溶液氯化鈉(naa) 80 g 氯化鉀(kci) 02 g 檸檬酸鈉(2個結晶

16、水) 10 g4nyt 11882006 磷酸二氫鈉(1個結晶水)005 g葡萄糖 10 g胰蛋白酶 25 g05酚紅4ml 加雙蒸水 1 000ml 上述試劑依次溶解，胰酶可先用少量水37'(3溫箱中水浴溶解至透徹清亮，倒人量筒中，用75的碳酸氫鈉調ph至76-78，定容至1 000ml，過濾除菌，分裝小瓶，置一20冰箱保存。 a7生理鹽水氯化鈉(naci)85 g 雙蒸水1 000ml 氯化鈉融化后分裝，1034 kpa 15 min高壓，室溫保存。a8hanks原溶液 氯化鈉(nacl)80 g磷酸氫二鈉(12個結晶水)06 g氯化鉀(kci)40 g 磷酸二氫鉀(kh2po)06 g 硫酸鎂(7個結晶水)20 g 葡萄糖 1009 無水氯化鈣(cacl2) 14 g 雙蒸水 1 000ml在配制時，應先將無水氯化鈣用一小燒杯加入約100ml雙蒸水，置4冰箱中溶解。等其他藥品 融完后，加入混勻，定容至1 000ml。用濾紙過濾后，加入2ml氯仿，經充分混勻后，置4"c冰箱中 保存。a9ph 72、02moll pbs溶液 溶液甲(a91