1、菠菜中天然色素的提取和分離1、 實驗目的（1） 了解葉綠素的基本性質（2） 掌握薄層層柱法和柱層層柱法分離微量組分的操作技術2、 實驗原理（1） 葉綠素的性質葉綠素是一種非常重要的植物色素，它的存在確保了植物能夠進行光合作用。葉綠體色素包括葉綠素a，葉綠素b，胡蘿卜素和葉黃素等成分，其中葉綠素的吸光能力極強。葉綠素a、葉綠素b的結構式如下：葉綠素是綠色植物的主要色素，分子由脫鎂葉綠素母環、葉綠酸、葉綠醇、甲醇、二價鎂離子等部分構成。高等植物中有兩種葉綠素即葉綠素a和葉綠素b共存，它們的含量約3：1，葉綠素a為一藍黑色固體粉末，在乙醇溶液中為藍綠色，并有深紅色熒光，而葉綠素b為暗綠色固體粉末，其

2、乙醇溶液為黃綠色，并有紅色熒光。葉綠素不溶于水，易溶于有機溶劑，常可用極性有機溶劑（例如丙酮、乙醇、乙酸乙酯等）從植物勻漿中提取它。葉綠素存在于植物細胞的葉綠體中，與類胡蘿卜素、類脂物質及脂蛋白復合在一起，分布在葉綠體內的蝶形體的片層膜上。葉綠素a和葉綠素b及衍生物在600700mm（紅光）和400500mm（藍光）有尖銳的吸收峰，可借助這一特性來鑒定它們。游離葉綠素很不穩定，對光和熱都較敏感。 胡蘿卜素是一種橙色的天然色素，屬于四萜，為一長鏈共軛多烯，有、三種異構體，其中異構體最多。在植物組織中，它們可能以固態微粒或者以與蛋白質、脂質、或者糖類復合的形式存在，特別是在有色體中存在。其為典型的

3、脂溶性色素，易溶于石油醚，、乙醚而難溶于乙醇。如遇氧化條件，易受氧化和光化學氧化形成加氧產物或者進一步分解為更小的分子，在受強熱時可分解為多種揮發性小分子化合物。 葉黃素是一種黃色色素，與葉綠素同存在與植物體內，是胡蘿卜素的羥基衍生物，較易溶于乙醇，在石油醚中溶解度較小。 、色素所呈現的顏色和在葉綠體中的含量見下表： 高等植物體內葉綠體色素的種類、顏色及含量比例項目葉綠素類胡蘿卜素葉綠素a葉綠素b-胡蘿卜素葉黃素顏色藍綠色黃綠色橙黃色黃葉綠體內各色素的含量5619178（2）色譜法的原理色譜法的基本原理是利用混合物中各組分在某一物質中的吸附或溶解性能的不同，或和其它親和作用性能的差異，使混合物

4、的溶液流經該種物質，進行反復的吸附或分配等作用，從而將各組份分開。 薄層層析是一種微量、快速和簡便的色譜方法。由于各種化合物的極性不同，吸附能力不相同，在展開劑上移動，進行不同程度的解析，根據原點至斑點中心及展開劑前沿的距離，計算比移值（rf）：化合物的吸附能力與它們的極性成正比，具有較大極性的化合物吸附較強，因此rf值較小。在給定的條件下（吸附劑、展開劑、板層厚度等），化合物移動的距離和展開劑移動的距離之比是一定的，即rf值是化合物的物理常數，其大小只與化合物本身的結構有關，因此可以根據rf值鑒別化合物。 吸附柱層析法是分離、純化和鑒定有機物的重要方法。它是根據混合物中各組分的分子結構和性質

5、（極性）來選擇合適的吸附劑和洗脫劑，從而利用吸附劑對各組分吸附能力的不同及各組分在洗脫劑中的溶解性能不同達到分離目的。吸附柱層析法通常是在玻璃層析柱中裝入表面積很大、經過活化的多孔性或粉狀固體吸附劑（常用的吸附劑 有氧化鋁、硅膠等）。當混合物溶液流過吸附柱時，各組分同時被吸附在柱的上端，然后從柱頂不斷加入溶劑（洗脫劑）洗脫。由于不同化合物吸附能力不同，從而隨著溶劑下移的速度不同，于是混合物中各組分按吸附劑對它們所吸附的強弱順序在柱中自上而下形成了若干色帶。 在洗脫過程中，柱中連續不斷地發生吸附和溶解的交替現象。被吸附的組分被溶解吸出來，隨著溶劑向下移動，又遇到新的吸附劑顆粒，把組分從溶液中吸附

6、出來，而繼續流下的新溶劑又使組分溶解而向下移動，這樣經過適當時間移動后，各種組分就可以完全分開，繼續用溶劑洗脫，吸附能力最弱的組分隨溶劑首先流出，再繼續加溶劑直至各組分依次全部由柱中洗出為止，分別收集各組分。由此可見，葉綠素等天然色素有廣泛的用途，對于色素的提取與分離就顯得很重要了本實驗就提取和分離做了相關的研究。3、 儀器和試劑儀器：研缽、分液漏斗、顯微載玻片、毛細管、層析柱(2010 cm)、廣口瓶試劑：石油醚（分析純、沸點60-90）、甲醇（分析純）、乙醇(分析純)、菠菜 葉、丙酮(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、無水硫酸鈉、硅膠g、中性氧化 鋁(150目160目)4、 實驗步驟（1） 菠

7、菜色素的提取新鮮菠菜葉洗凈、晾干。稱取去梗的葉子20g，剪碎放于研缽中，加入5ml甲醇混合后，再加入20ml甲醇，研成細漿。用布氏漏斗過濾菠菜葉，用20 ml石油醚，萃取兩次，合并萃取液，用10ml水洗滌兩次,以除去萃取液中的甲醇。洗滌時要輕輕旋蕩，以防乳化。分去水層，有機層用無水硫酸鈉干燥后濾入圓底燒瓶，水浴蒸餾濃縮至1ml作用。（2） 薄層色譜分析取兩塊載玻片，在薄板上點樣后，小心放入加有展開劑（石油醚:丙酮=8:2）的廣口瓶中，待展開劑上升至一定高度時，取出薄板，在空氣中晾干，用鉛筆做標記，并計算rf值。（3） 柱層析分析在長40cm內徑為2cm層析柱中加入2/3高度的石油醚，用60g層

8、析用的中性氧化鋁（150160目）進行干法裝柱，將上述菠菜色素用滴管小心加入到層析柱頂部，加完后打開活塞，加入數滴石油醚，重新打開活塞，重復數次，使色素全部進入柱體內。在柱頂加石油醚丙酮（9:1）洗脫劑進行洗脫，保持流出速度。當第一個色素流出時，取另一錐形瓶收集，得橙黃色溶液，即胡蘿卜素，進行點板測定rf值。用石油醚丙酮（7:3）進行洗脫，分出第二個黃色帶，它是葉黃素。再用丁醇-乙醇-水（3:1:1）洗脫，可以得到藍綠色的葉綠素a和黃綠色的葉綠素b。將分離得到的3種物質進行rf值測定。5、 結果與討論圖1 濃縮液、葉綠素、胡蘿卜素的薄層色譜板圖2 胡蘿卜素，葉黃素，葉綠素的柱色譜圖3 柱色譜分離后的胡蘿卜素，葉黃素，葉綠素提取液表1 各色素的rf值展開劑：石油醚-丙酮（8:2）濃縮液柱層分析液胡蘿卜素葉黃素葉綠素胡蘿卜素葉綠素rf0.9470.1580.1050.5330.400 在一定的色譜條件下，特定化合物的rf值是一個常數，因此有可能根據化合物的rf值鑒定化合物。菠菜色素中各種色素的比移值rf大小為：胡蘿卜素 葉黃素葉綠素，按此順序它們的非極性依次減弱。6、 總結薄層色譜是一種很好的分離、純化、鑒定有機化合物的重要方法之一，尤其是對于微量分析，根據展開劑不同，可以確定各色素的極性強弱。