1、第三章 細(xì)菌質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒的定義 是一種細(xì)胞質(zhì)遺傳因子，是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于染色體外的一種復(fù)制子，它在細(xì)胞分裂時(shí)能衡定的傳給子代細(xì)胞，并能給細(xì)胞帶來(lái)表型效應(yīng)，但它的消失并不影響細(xì)胞的生存。 質(zhì)粒質(zhì)粒第一節(jié) 質(zhì)粒的檢測(cè)一消除法（一消除法（curing）間接推測(cè)間接推測(cè) 二直接觀察法二直接觀察法（三）電鏡直接觀察 （一）氯化銫溴化乙錠（cscleb）密度梯度離 心（圖3-1）（二）瓊脂糖凝膠電脈三重新感染試驗(yàn)法三重新感染試驗(yàn)法柯赫法則柯赫法則 123412341234abc1.蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)3.質(zhì)粒質(zhì)粒dna2.染色體染色體dna4.rna圖3-1 csci密度梯度示意圖 細(xì)菌質(zhì)粒種類繁多

2、,目前主要根據(jù)其表型效應(yīng)命名并劃分為不同的類型,目前在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒類型主要有三種:即性質(zhì)粒性質(zhì)粒、抗性質(zhì)粒抗性質(zhì)粒和產(chǎn)大腸桿菌素質(zhì)粒產(chǎn)大腸桿菌素質(zhì)粒。 1性質(zhì)粒性質(zhì)粒：具有促進(jìn)細(xì)胞結(jié)合的表型效應(yīng)。2col質(zhì)粒質(zhì)粒（又稱大腸桿菌質(zhì)粒）：可以產(chǎn)大腸桿菌素的大腸桿菌質(zhì)粒。3抗性質(zhì)粒抗性質(zhì)粒：能對(duì)不同物質(zhì)，其中包括抗生素、化學(xué)藥物、重金屬等物質(zhì)表現(xiàn)出抗性的一大類質(zhì)粒的統(tǒng)稱。 4降解質(zhì)粒降解質(zhì)粒：這一類質(zhì)粒能利用許多不容易為一般細(xì)菌分解的物質(zhì)作為碳源供細(xì)菌生長(zhǎng)。目前只在假單胞桿菌中發(fā)現(xiàn)。 5ti質(zhì)粒質(zhì)粒（tumor inducing），ti質(zhì)粒是一種寄生在根瘤農(nóng)桿菌（agradacterium

3、tumefacxiens）中，并能感染植物（主要是雙子葉）的莖形成寇癭瘤的一種質(zhì)粒。 7共生固氮質(zhì)粒共生固氮質(zhì)粒：存在于不同根瘤菌中，并能相應(yīng)的豆科植物進(jìn)行共生固氮的一類質(zhì)粒。6隱蔽質(zhì)粒隱蔽質(zhì)粒：目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)它表現(xiàn)出任何性狀的質(zhì)粒。a直接法：根據(jù)質(zhì)粒分子量和質(zhì)粒dna的總量來(lái)測(cè)定b間接法： 1）使質(zhì)粒處于不復(fù)制狀態(tài)下，測(cè)定開(kāi)始出現(xiàn)不含質(zhì)粒的細(xì)菌所經(jīng)歷的分裂次數(shù)； 2數(shù)量數(shù)量：測(cè)定質(zhì)粒的數(shù)量是以拷貝數(shù)來(lái)表示，拷貝數(shù)的測(cè)定一般有兩種方法：1大小大小：一般分子量在1-10106d 的質(zhì)粒，大于此分子量的為大質(zhì)粒。拷貝數(shù)拷貝數(shù)=質(zhì)粒的質(zhì)粒的dna總量總量質(zhì)粒分子量質(zhì)粒分子量 嚴(yán)謹(jǐn)型（嚴(yán)謹(jǐn)型（stri

4、gent）質(zhì)粒）質(zhì)粒：它的復(fù)制除變自身的基因控制外，還要嚴(yán)格的受染色體的控制。松馳型（松馳型（relaxed）質(zhì)粒）質(zhì)粒：它的復(fù)制主要受自身基因的控制，受染色體控制影響極少。四質(zhì)粒轉(zhuǎn)移類型四質(zhì)粒轉(zhuǎn)移類型（一）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移與供受體細(xì)菌的關(guān)系 （二）帶動(dòng)轉(zhuǎn)移 2）利用質(zhì)粒的某些表型效應(yīng)來(lái)測(cè)定。 質(zhì)粒產(chǎn)生不相溶性存在的兩種假說(shuō)： 1兩個(gè)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)相同，復(fù)制能力相同，一個(gè)先進(jìn)入細(xì)胞復(fù)制后產(chǎn)生阻遏物抑制了后一質(zhì)粒的復(fù)制。 2膜位點(diǎn)假說(shuō)：兩個(gè)質(zhì)粒的復(fù)制位點(diǎn)相同，互相競(jìng)爭(zhēng)同一位點(diǎn)而產(chǎn)生不相溶性 0102025102050 1000102001020km,apap,smkm,smabc繁殖代數(shù)雙重抗性細(xì)菌（%）

5、大腸桿菌質(zhì)粒的不親和性和親和性現(xiàn)象a.psc101-km和psc101-ap的不親和現(xiàn)象；b.cole1-ap和cole1-smsu的不親和現(xiàn)象；c. psc101-km和cole1-smsu的親和現(xiàn)象。 km:卡那霉素； ap:氨芐西林； sm:鏈霉素； su:磺胺。第三節(jié) 細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制 以大腸桿菌的f質(zhì)粒為例，證明嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒的復(fù)制既受寄主染色體的控制又受質(zhì)粒自身的控制（圖3-2） 二復(fù)合復(fù)制子的復(fù)制二復(fù)合復(fù)制子的復(fù)制 1質(zhì)粒與染色體合并后的復(fù)合復(fù)制子質(zhì)粒與染色體合并后的復(fù)合復(fù)制子 1）整合后，質(zhì)粒隨（受）染色體控制 2）整合后，染色體的復(fù)制受質(zhì)粒控制嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒的復(fù)制特點(diǎn)嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒的復(fù)制特

6、點(diǎn)f-lac. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .涂布lac-300c培養(yǎng)影印影印300c培養(yǎng)emb培養(yǎng)420c培養(yǎng)emb培養(yǎng)300c紅白fts-lac+(質(zhì)粒的復(fù)制呈敏感突變）質(zhì)粒的復(fù)制呈敏感突變）將將fts-lac引入一個(gè)非溫度引入一個(gè)非溫度敏感的宿主敏感的宿主丫啶消除丫啶消除fts-lac質(zhì)粒質(zhì)粒lac-fts-lac+42 白 （質(zhì)粒本身性質(zhì)）42 紅（染色體結(jié)構(gòu)紅（染色體結(jié)構(gòu)控制了控制了f的復(fù)制）的復(fù)制）引進(jìn)一個(gè)野生型的f-lac+lac-f-lac+42 白（染色體控制）42

7、 紅（質(zhì)粒本身的性質(zhì)決定）紅（質(zhì)粒本身的性質(zhì)決定）圖3-22質(zhì)粒與質(zhì)粒合并后形成嵌合質(zhì)粒的復(fù)制質(zhì)粒與質(zhì)粒合并后形成嵌合質(zhì)粒的復(fù)制 1）當(dāng)兩種嵌合質(zhì)粒的復(fù)制都不受抑制情況下，復(fù)合復(fù)制子受拷貝數(shù)多的質(zhì)粒控制 psc101和cole1是大腸桿菌的兩種質(zhì)粒，它們的特征見(jiàn)表3-3。 表3-3質(zhì)粒分子量（道爾頓）每一細(xì)胞中質(zhì)粒數(shù)轉(zhuǎn)移性標(biāo)記復(fù)制條件psc1015.81066非tcr細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成cole14.210618非細(xì)菌的dna多聚酶2) 當(dāng)它們整合后形成的嵌合質(zhì)粒為psc134，它們的復(fù)制特征見(jiàn)表3-4。 表3-4宿主細(xì)菌和所帶的質(zhì)粒復(fù)制開(kāi)始的部位cole1 psc101相當(dāng)于每一染色體的質(zhì)粒數(shù)宿

8、主細(xì)胞的四環(huán)素抗性(單位/毫升)cr34pola1+(psc134)36 01680w3110pola1-(psc134) 0 14625cr34pola1+(psc101)- -525c600pola1+( cole1, psc101)- -18 , 530三三.復(fù)合質(zhì)粒的復(fù)制機(jī)制復(fù)合質(zhì)粒的復(fù)制機(jī)制 對(duì)于復(fù)合質(zhì)粒的復(fù)制機(jī)制,目前存在著兩種假說(shuō)模型: 一種是正控制假說(shuō)模型；另一種是負(fù)控制假說(shuō)模型。 對(duì)于正控制假說(shuō)模型正控制假說(shuō)模型又有兩種解釋：1膜位點(diǎn)的正控制模型：該模型認(rèn)為質(zhì)粒必須附著在細(xì)胞膜的某一特寫(xiě)部位才能開(kāi)始進(jìn)行復(fù)制，而且每一專一的膜位點(diǎn)控制著復(fù)制的拷貝數(shù)。2物質(zhì)擴(kuò)散的正控制模型：這種

9、模型假定為細(xì)胞內(nèi)能產(chǎn)生一種可以擴(kuò)散的物質(zhì)，此物質(zhì)促使dna開(kāi)始復(fù)制。負(fù)控制假設(shè)模型負(fù)控制假設(shè)模型認(rèn)為： 質(zhì)粒復(fù)制的過(guò)程中，細(xì)胞產(chǎn)生一種專一的阻遏蛋白，它能抑制質(zhì)粒進(jìn)一步復(fù)制，只有當(dāng)阻遏物稀釋到一定的濃度（即消除了阻遏），質(zhì)粒的復(fù)制才又開(kāi)始，所以每一質(zhì)粒總保持一定的拷貝數(shù)。第四節(jié) 質(zhì)粒在遺傳工程中的應(yīng)用 一遺傳工程的概念一遺傳工程的概念狹義的遺傳工程即通常稱為基因工程。 （一）（一）遺傳工程遺傳工程定義定義 是采用類似工程設(shè)計(jì)的方式，按照人們預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，把我們所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)dna大分子提取出來(lái)，在離體條件下進(jìn)行剪切，獲得我們所需要的目的基因，然后把它和載體dna連接起來(lái)，巧妙

10、地輸入到某一受體細(xì)胞中去，使外源dna在其中復(fù)制、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄、翻譯，以至最后能表達(dá)，這就是基因工程的全部過(guò)程。 （二）遺傳工程與一般細(xì)胞發(fā)生的重組的區(qū)別 細(xì)胞內(nèi)基因重組的特點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)基因重組的特點(diǎn)：1外源dna需要整合致染色體上；2由于重組，所以受同源的限制，有同源性才能發(fā)生重組；3同源重組是在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的；4基因產(chǎn)物少。遺傳工程的特點(diǎn)遺傳工程的特點(diǎn)：1遺傳工程不需要在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，而是在體外人工地進(jìn)行重組，所以基因工程是分子水平的操作，細(xì)胞水平的表達(dá)；（三）基因工程的過(guò)程4從受體細(xì)胞群體中篩選出含有重組dna分子的細(xì)胞，建立無(wú)性繁殖系。1獲得目的的基因（直接從生物體中分離或人工合成）；2把目的基因和載體結(jié)合成重組dna分子（體外重組）；3把重組dna分子引入到相應(yīng)的受體中去（轉(zhuǎn)化或傳染）；2外源dna不是整合到染色體上，而是結(jié)合在另一個(gè)小的復(fù)制子上（載體），由于載體能獨(dú)立復(fù)制，所以重組不受同源的干擾，產(chǎn)物也能成倍增加（拷貝數(shù)多）。6安全性能要好（一般要求是非轉(zhuǎn)移型的）（一）質(zhì)粒作為遺傳工程的載體必須符合以下條件：1要求在宿主的細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制，最好是松馳型的2要求有一定的選擇性標(biāo)記3要有單一的限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)4分子量要盡可能的小5要利于