1、第21章 免疫學方法技術一、凝集反應（agglutination reaction）l概念：細菌、細胞等顆粒性抗原或包被有抗原的顆粒狀物質（如聚苯乙烯乳膠等）與相應的抗體結合，出現肉眼可見的凝集團，稱為凝集反應。l1、直接凝集：將細菌或紅細胞與相應的抗體直接反應，出現細菌凝集或紅細胞凝集現象。又分為玻片法和試管法。l2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細胞或乳膠顆粒表面，與相應抗體反應出現顆粒凝集現象。細菌的鑒定和血型的檢查檢測病原體可溶性抗原，病原體感染后產生的抗體二、沉淀反應（precipitation）l概念：可溶性抗原（免疫球蛋白、細胞裂解物、組織浸液等）與相應抗體結合， 形成不溶性免疫

2、復合物，出現不透明的沉淀物。在液體中進行出現絮狀沉淀，在半固體瓊脂凝膠上進行，形成白色的沉淀。1單向免疫擴散(single immunodiffusion)2雙向免疫擴散(double immunodiffusion)3免疫電泳(immunoelectrophoresis)4免疫比濁(immunonephelometry) 2、雙向免疫擴散（doule immunodiffusion）：抗原與抗體在瓊脂板中相互擴散而形成一定類型的沉淀線的方法。常用于抗原或抗體的定性檢測、組成和兩種抗原相關性分析。 1）簡易免疫電泳先將抗原樣品在瓊脂中進行電泳分離，可將蛋白質抗原分子分成不同的區(qū)帶，然后將抗血清

3、加入瓊脂板橫槽中，使二者進行雙向擴散，當比例合適時即形成特異性的沉淀線， 2）對流免疫電泳(counter immunoelectrophoresis, ciep) 是將雙向免疫擴散與電泳相結合的一種技術3）火箭免疫電泳(rocket immunoelectrophoresis)，抗原在電場下通過含有一定量抗體的瓊脂凝膠，并于抗體發(fā)生反應，形成沉淀帶。可定量分析。4、免疫比濁在一定量抗體中分別加入遞增量的抗原，經一定時間形成免疫復合物，液體混濁。用濁度計測量反應體系的濁度，可繪制標準曲線并依據濁度推算樣品中抗原含量。 三、補體參與的反應溶菌溶菌反應反應細菌與相應細菌與相應ab結合，可激活補體，

4、使細結合，可激活補體，使細菌溶解。主要發(fā)生于霍亂弧菌等菌溶解。主要發(fā)生于霍亂弧菌等g+菌，菌，可用于細菌鑒定。可用于細菌鑒定。溶血溶血反應反應紅細胞與相應抗體結合，通過激活補體紅細胞與相應抗體結合，通過激活補體使紅細胞溶解，可作為補體結合試驗的使紅細胞溶解，可作為補體結合試驗的指示系統(tǒng)。指示系統(tǒng)。補體結補體結合反應合反應是一種在補體參與的條件下，以綿羊紅是一種在補體參與的條件下，以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統(tǒng)來測定有無細胞和溶血素作為指示系統(tǒng)來測定有無相應抗原或抗體的血清學試驗。相應抗原或抗體的血清學試驗。免疫標記技術（immunolabelling technique）l概念：用熒光素、同

5、位素或酶等示蹤物質 標記抗體（或抗原）進行抗原-抗體反應。標記物質未改變抗原抗體的免疫學特性，同時標記物極大的提高了反應的靈敏度，可以對微量物質進行定量、定性或定位檢測。l免疫標記技術主要有三種基本類型：免疫熒光技術、免疫酶技術和同位素標記技術。1抗體制備。l多克隆抗體l單克隆抗體，2標記物與標記方法。 放射性同位素、酶、熒光分子、化學和生物發(fā)光系統(tǒng)。免疫分析基本環(huán)節(jié) 3分析方式設計：非競爭方式、競爭方式；直接法、間接法；標記抗原、標記抗體；均相、非均相4.信號檢測。與相應的標記物對應。主要為分光光度法、熒光光度法、化學發(fā)光檢測法。一、免疫熒光法(immunofluorescence,if)l

6、概念：熒光素標記的抗體（抗原）與組織或細胞中的相應抗原（抗體）結合，借助于熒光顯微鏡或流式細胞儀對抗原（抗體）進行鑒定或定位。l（1）直接熒光法：熒光素直接標記抗體，對標本進行檢測。該法優(yōu)點是特異性高，缺點是檢查任一抗原均須制備相應熒光抗體。l（2）間接熒光法：用一抗與標本中抗原結合，再用熒光素標記的二抗進行檢測。該法優(yōu)點是敏感度比直接法高，制備一種熒光素標記的二抗即可用于多種抗原的檢測,但非特異性反應亦增強。免疫熒光法分類免疫熒光法圖示mouse kidney sectionlaminin - green-fluorescent qdot 565 igg cd31- red-fluoresc

7、ent qdot 655 iggnuclei - blue-fluorescent hoechst 33342controltslptslp - alexafluor 488 nuclei - propidium iodide hasmc 流式細胞術（flow cytometry, fcm)l概念：fcm是將免疫熒光技術應用于流式細胞儀，對單個細胞的表面標志（抗原或受體）進行快速、精確的分析和自動檢測，并將不同類型的細胞分選收集。lfcm還可對同一細胞的多種參數（如dna、rna、蛋白質和細胞體積等）進行多信息分析，為當代生命科學研究領域中廣泛使用的一項新技術。流式細胞儀的細胞分析原理l待測細

8、胞被制成單細胞懸液，經特異性熒光染料染色后加入樣品管中，在氣體壓力推動下進入流動室。l流動室內充滿鞘液，在鞘液的約束下，細胞排成單列出流動室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細胞液柱，進入流動室。l被熒光染料染色的細胞受到強烈的激光照時后發(fā)出熒光，被熒光光電倍增管接收，實現了細胞的定量分析。l再通過流束形成含有細胞的帶電液滴而實現了細胞的分選。 流式細胞儀工作原理二、酶免疫測定(enzyme immunoassay, eia)l概念：是用酶標記的抗體進行的抗原抗體反應。將抗原-抗體反應的特異性與酶催化作用的高效性相結合，借助酶作用于底物的顯色反應判定結果。l常用的酶為： 辣根過氧化物酶（hrp）、堿性磷

9、酸酯酶（ap）酶 底 物顯色反應 測定波長 辣根過氧化物酶 鄰苯二胺（opd） 3、3二氨基聯(lián)苯胺（dab） 氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺2,2-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽 橘紅色黃色棕色蘭色藍綠色492460449425642堿性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸鹽(pnp)萘酚-as-mx磷酸鹽+重氮鹽 黃色紅色 400500 葡萄糖氧化酶 abts+hrp+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭 黃色深藍色 405420 常用的方法如下：（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗測定可溶性抗原或抗體（2）免疫細胞或組織化學測定組織中或細胞表面的抗原1. 免疫細胞或免疫組化技術l概念：應用酶標記的抗體與組織或細胞抗原

10、發(fā)生反應，結合形態(tài)學觀察，對組織或細胞表面抗原進行定性、定量、定位。iccihc2.酶聯(lián)免疫吸附試驗 (enzyme linked immunosorbent assay，elisa) l基本原理：是將過量抗體（抗原）包被于載體（聚苯乙烯微量反應板）上，通過抗原抗體反應使酶標記抗體（抗原）也結合在載體上，經洗滌去除游離的酶標記抗體（抗原）后，加入底物顯色，定性或定量分析有色產物確定待測物的存在與含量的檢測技術。l是酶免疫測定中應用最廣的技術，用于測定可溶性抗原或抗體。elisa試劑盒試劑盒1. 雙抗體夾心法l用于檢測特異性抗原。l方法：將已知抗體吸附于固相載體加入待檢標本(含相應抗原)與之結合

11、。溫育后洗滌，加入酶標抗體和底物進行測定。 l該試驗所用的包被抗體與酶標抗體應分別針對不同抗原決定基，或其中之一用多克隆抗體，且相互間應無交叉反應。2. 間接法l用于檢測特異性抗體。l方法：將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標本(含相應抗體)與之結合。洗滌后，加入酶標抗球蛋白抗體(酶標抗抗體)和底物進行測定。 抗 原一 抗二 抗生物素hrp親合素3. 競爭法l用于抗原和半抗原（抗原決定簇少）的定量測定，也可用于測定抗體。l方法：以測定抗原為例將持異性抗體吸附于固相載體；加入待測抗原和一定量的酶標已知抗原，使二者競爭與固相抗體結合；經過洗滌分離，最后結合于固相的酶標抗原與待測抗原含量呈負相關。

12、elisa反應過程反應過程動畫演示動畫演示4. 酶聯(lián)免疫斑點試驗ellsa方法的技術要點 il與固相載體結合的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被(coating)，由于載體不同，包被的方法也不同。l使用聚苯乙烯制品為載體一般多采用物理吸附法。除載體的理化性質外，受緩沖液的離子強度、ph值、包被時的溫度和時間等多種因素的影響。l用抗原或抗體包被后。固相載體表面往往尚殘留少量未飽和的吸附位點，產生非特異吸附，導致本底偏高。為此常用15bsa，或含520小牛血清的ph9.6碳酸鹽緩沖液注滿凹孔，37作用1h，可以消除此種干擾。這一過程稱為封閉(blocking)。固相載體和免

13、疫吸附劑的制備 ellsa方法的技術要點 ii抗原和抗體l用于制備酶標記物和包被固相載體的抗原要求純度高，抗原性完整；抗體需特異、效價高、親和力強，并具有較高的比活性。l如將抗體igg用木瓜蛋白酶水解為fab片段，再與酶連接，可以減少非特異性吸附，檢測效果更佳。lmcab的應用，進一步提高elisa法的特異性和靈敏度。使用針對抗原分子中不同決定簇的兩種mcab分別作為固相抗體和酶標抗體用于雙位點夾心法，簡化了操作程序。l通常采用特異性較高的mcab作為固相包被抗體，與酶標記的多克隆抗體相結合進行檢測，結果更為滿意。 l在elisa法中，用于標記抗體或抗原的酶與免疫酶組織化學技術基本上相同。但所

14、用底物被酶裂解后，應能生成可溶性有色產物，適合用分光光度計(酶標儀)測量光密度值，籍以定量測定樣品中待撿抗原或抗體的含量。ellsa方法的技術要點 iii常用的酶及其底物 n辣根過氧化物酶(hrp)opd, tmbn堿性磷酸酶(ap)pnpn半乳糖苷酶(gal)npgn葡萄糖氧化酶(gop)pap三、放射免疫測定法(radioimmunoassay, ria)l概念：是用放射性核素標記抗原進行的免疫學檢測技術。它將放射性核素顯示的高靈敏性和抗原抗體反應的特異性結合，使檢測的敏感性達pg水平。常用于標記的放射性核素有i125和i131。l常用于胰島素、生長激素、藥物等微量物質的測定。結合相游離相

15、 ag* ab ag 標記抗原 特異性抗體 待測抗原( ag*-ab)+ (ag-ab) 抗原抗體復合物分離ag*-ab 和游離ag*從標準曲線上讀知含量測定ag*-ab和/或游離ag*放射性 示意圖ria法原理及標準曲線7550301001101001000未標記抗原濃度（ng/ml)結合/未結合的放射活性（%）四、化學發(fā)光免疫分析l概念：將發(fā)光物質（如吖啶酯、魯米諾等）標記抗原或抗體，發(fā)光物質在反應劑（如過氧化陰離子）激發(fā)下發(fā)射光子，通過自動發(fā)光分析儀測定光子產量，可反映待檢樣品中抗體或抗原含量。l該法靈敏度高，常用于檢測血清超微量活性物質（甲狀腺素等激素）。靈敏，無污染，可用于替代放射免

16、疫。五、免疫膠體金標記技術 (immunogold labeling technique) l概念：是以膠體金作為示蹤標記物，應用于抗原抗體反應的一種免疫標記技術；膠體金是由氯金酸在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金。l電鏡：高電子密度l試紙：膠體金的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關， 顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變異，產生肉眼可見的顯著的顏色變化。l膠體金是氯金酸(haucl4)的水溶膠顆粒，具有高電子密度，在電鏡中顆粒致密，易于辨認，定位比酶反應物精確。膠體金標記舉例：膠體金試紙檢測尿hcgl早孕

17、尿試紙條：兩條杠，檢測迅速，靈敏度高1）干燥試紙條 膠體金免疫快速檢測hcg原理2）加樣1.雙抗體夾心法-大分子抗原 3）反應和遷徙 4）陽性結果：兩條紅線 5）陰性結果：一條紅線 膠體金免疫試紙構造六、免疫印跡技術l 免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質印跡(western blotting)，是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。l凝膠電泳和固相免疫測定技術l將含有目標蛋白(抗原)的樣品首先用sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)或非變性電泳(native-page)等分離后，通過轉移電泳原位轉印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面，然后將膜表面的蛋白質再用抗原抗體反應進行

18、特異性檢測。western blot method包括5個步驟：p1)固定：蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(page)并從膠上轉移到硝酸纖維素膜上。p2)封閉：保持膜上沒有特殊抗體結合的場所，使場所處于飽和狀態(tài)，用以保護特異性抗體結合到膜上,并與蛋白質反應。p3)初級抗體(第一抗體)是特異性的。p4)第二抗體或配體試劑對于初級抗體是特異性結合并作為指示物。p5)適當保溫后的酶標記蛋白質區(qū)帶，產生可見的、不溶解狀態(tài)的顏色反應。單個核細胞的分離 淋巴細胞亞群的分離 t細胞功能檢測b細胞功能檢測免疫細胞及其亞類分離、鑒定和檢測 淋巴細胞功能測定 t細胞的鑒定和檢測 b細胞的鑒定和檢測 一、免疫細胞及亞

19、類分離、鑒定和檢測（一）外周血單個核細胞的分離淋巴細胞分離液（二）淋巴細胞亞群的分離尼龍棉分離法 e花結分離法 洗淘法 流式細胞術 磁分離技術 1、e玫瑰花環(huán)形成試驗（三）t細胞及其亞群的鑒定和檢測可用于t細胞的鑒定和檢測。綿羊紅細胞+人外周血淋巴細胞 4 12h 花環(huán)樣細胞集團正常人外周血中e玫瑰花環(huán)形成細胞占淋巴細胞總數的6080%。t細胞細胞cd2/e受體受體srbc/綿羊紅細胞綿羊紅細胞（三）t細胞及其亞群的鑒定和檢測2、t細胞單克隆抗體對t細胞及其亞群的鑒定和檢測所用的ab主要有：cd3mcab、cd4mcab和cd8mcab。方法：免疫熒光間接法。 外周血淋巴細胞+分別用小鼠抗人c

20、d3、cd4、cd8mcab （第一ab）+熒光素標記的（第二ab ）熒光顯微鏡觀察。小鼠抗人mcab熒光標記的兔抗小鼠igg抗體（三）t細胞及其亞群的鑒定和檢測2、t細胞單克隆抗體對t細胞及其亞群的鑒定和檢測 結果： （1）被cd3mcab著染熒光的細胞是總t細胞。 包括：th、th1、th2、tc、ts細胞。 （2）被cd4mcab著染熒光的細胞是th、th1、th2 （3）被cd8mcab著染熒光的細胞是tc、ts細胞。 計數： 100200個淋巴細胞，計算出染陽性細胞百分率： cd3t細胞占6580%。cd4t細胞占5060%。 cd8t細胞占2030%， cd4t細胞與cd8t細胞比

21、值約2：1。 smigm/d是b細胞表面的標志。通過對該種標志的檢測，可對b細胞進行鑒定和檢測。免疫熒光直接法。 熒光素標記的兔抗人igm/d抗體+外周血淋巴細胞 直接免疫熒光染色。 著染熒光的細胞-b細胞。 占淋巴細胞總數的812%。（四）b細胞鑒定和檢測兔抗人igm/d抗體二、淋巴細胞功能測定1、淋巴細胞轉化試驗2、細胞毒性試驗（lmc-t）1、溶血空斑試驗2、定量溶血分光光度測定法1、淋巴細胞轉化試驗原理：t細胞 特異性ag或有絲分裂原 淋巴母細胞 （體積更大、代謝旺盛）根據其轉化程度和轉化率，測定機體細胞免疫功能狀態(tài)（1）非特異性轉化試驗（2）特異性轉化試驗（一）t細胞功能檢測 t細胞 植物血凝素（pha）或刀豆蛋白a（con a） 淋巴母細胞。 （有絲分裂原） 正常人t細胞轉化率約為70%。（1）非特異性轉化試驗1、淋巴細胞轉化試驗（一）t細胞功能檢測t細胞 特異性抗原（如結核菌素ot）或ppd 淋巴母細胞。