1、第二節第二節 其它重要的工具酶其它重要的工具酶dna 聚合酶聚合酶（dna polymerase） dna 聚合酶是催化以聚合酶是催化以 dna 或或 rna 為模板合成為模板合成 dna 的一的一類酶的總稱。類酶的總稱。 經常使用的經常使用的 dna 聚合酶有大腸桿菌聚合酶有大腸桿菌 dna 聚合酶聚合酶 i(全酶全酶)、klenow 酶、酶、t4 dna 聚合酶、聚合酶、t7 dna 聚合酶、耐高溫的聚合酶、耐高溫的 taq dna 聚合酶以及反轉錄酶等。聚合酶以及反轉錄酶等。 這些這些 dna 聚合酶的共同特點是：它們都能夠把脫氧核糖聚合酶的共同特點是：它們都能夠把脫氧核糖核苷酸核苷酸(

2、dntp，包括，包括 datp、 dttp、 dctp 和和 dgtp)連連續的加到雙鏈續的加到雙鏈 dna 引物鏈的引物鏈的 3-羥基末端上，催化核苷酸羥基末端上，催化核苷酸的聚合，形成新的的聚合，形成新的 dna 鏈。鏈。dna 聚合酶聚合酶 i dna 聚合酶聚合酶 i 具有三種活性，即具有三種活性，即 5 3 聚合活性、聚合活性、5 3 外外切活性和切活性和 35外切活性。外切活性。 dna 聚合酶聚合酶 i 要發揮作用需滿足以下三個條件。要發揮作用需滿足以下三個條件。 底物和激活劑：底物和激活劑：dna 聚合酶聚合酶 i 催化聚合反應需要四種催化聚合反應需要四種 dntp(datp、

3、dctp、dttp、dgtp)作為底物，同時作為底物，同時mg2是不可缺少的激活劑。是不可缺少的激活劑。 帶有帶有 3 -端羥基末端的引物：端羥基末端的引物：dna 聚合酶聚合酶 i 所催化的聚合所催化的聚合反應總是在引物的反應總是在引物的 3 -oh末端基團和攙入的末端基團和攙入的 dntp 之間發生之間發生的，且只能沿引物末端由的，且只能沿引物末端由 5 3 方向延伸。方向延伸。 dna 模板：可以是模板：可以是 ssdna 或或 dsdna，后者只有在其主，后者只有在其主鏈上有一至數個斷裂的情況下才能成為有效的模板。鏈上有一至數個斷裂的情況下才能成為有效的模板。 實驗室中，利用實驗室中，

4、利用 dna 聚合酶聚合酶 i，通過，通過 dna 缺口平移的方缺口平移的方法制備法制備 dna 探針，可以用于核酸雜交分析。探針，可以用于核酸雜交分析。 雙鏈雙鏈 dna 的單鏈缺口在的單鏈缺口在 dna 聚合酶聚合酶 i 的的 5 3 外切作用外切作用下，從缺口的下，從缺口的5端逐步水解核苷酸時，酶的聚合活性則利用端逐步水解核苷酸時，酶的聚合活性則利用缺口的缺口的 3端游離羥基逐個加上相應的單核苷酸，使得缺口端游離羥基逐個加上相應的單核苷酸，使得缺口向下游移動，這種缺口移動的現象就稱為向下游移動，這種缺口移動的現象就稱為缺口平移缺口平移。 如果反應中使用的是用同位素標記過的單核苷酸底物，則

5、如果反應中使用的是用同位素標記過的單核苷酸底物，則合成產生的合成產生的 dna 分子即可作為帶放射性標記的分子即可作為帶放射性標記的 dna分子分子雜交探針。雜交探針。dna 聚合酶聚合酶 idna 聚合酶聚合酶 i 大片段大片段 (klenow 片段片段) 是是 e. coli dna 聚合酶聚合酶 i 的蛋白水解產物，特點是：的蛋白水解產物，特點是： 具有具有 dna 聚合酶活性和聚合酶活性和 3 5 核酸外切酶活性，但缺失核酸外切酶活性，但缺失了了 53 核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。 klenow 既保留了全酶的高保真性，又不會降解既保留了全酶的高保真性，又不會降解 dna 5 末末

6、端。端。 用途：在基因工程中主要用于切口平移法標記用途：在基因工程中主要用于切口平移法標記 dna，同時也可用于同時也可用于 dna 的的缺口補平缺口補平和延伸。和延伸。用途：用途：用隨機引物制備探針用隨機引物制備探針補平補平5 突出端，形成平末端突出端，形成平末端切除切除3 突出端，形成平末端突出端，形成平末端合成合成cdna第二條鏈第二條鏈誘變反應中第二條鏈的合成誘變反應中第二條鏈的合成雙脫氧法雙脫氧法dna序列測定序列測定 (sanger 法法)dna 聚合酶聚合酶 i 大片段大片段 (klenow 片段片段)dna 聚合酶聚合酶 i 大片段大片段 (klenow 片段片段)t4 dna

7、 聚合酶聚合酶 在模板及引物存在的條件下，在模板及引物存在的條件下，t4 dna 聚合酶聚合酶催化沿催化沿 53 方向合成方向合成 dna。此酶還具有。此酶還具有 35 外切核酸酶的活性，該活性比外切核酸酶的活性，該活性比 dna 聚聚合酶合酶 i 強。與強。與 e. coli dna 聚合酶聚合酶 i 不同，不同，t4 dna 聚合酶不具有聚合酶不具有 53 外切核酸酶活性。外切核酸酶活性。t4 dna 聚合酶聚合酶 缺口填充缺口填充 (無鏈置換活性無鏈置換活性) 產生平末端的最佳用酶產生平末端的最佳用酶 補平補平 5 突出端，形成平末端突出端，形成平末端 切除切除 3 突出末端，形成平末端

8、突出末端，形成平末端 通過置換合成法標記探針通過置換合成法標記探針 單鏈刪除后亞克隆單鏈刪除后亞克隆 基因定點突變中第二條鏈的合成基因定點突變中第二條鏈的合成 dna片段的末端平滑化示例片段的末端平滑化示例t7 dna 聚合酶 t7 dna 聚合酶是從受聚合酶是從受 t7 噬菌體感染的大腸桿菌噬菌體感染的大腸桿菌寄主細胞中純化出來的一種復合形式的核酸酶。寄主細胞中純化出來的一種復合形式的核酸酶。 它由兩種亞基組成：一種是它由兩種亞基組成：一種是 t7 噬菌體基因噬菌體基因 5 編編碼的蛋白質，其分子量為碼的蛋白質，其分子量為84 kd；另一種是大腸；另一種是大腸桿菌編碼的硫氧還蛋白桿菌編碼的硫

9、氧還蛋白(thioredoxin)，其分子量，其分子量為為 12 kd。 t7 dna聚合酶是目前已知的持續合成能力最強的聚合酶是目前已知的持續合成能力最強的 dna 聚合聚合酶，能連續合成數千個核苷酸。酶，能連續合成數千個核苷酸。 除聚合活性以外，除聚合活性以外，t7 dna 聚合酶還具有單鏈和雙鏈的聚合酶還具有單鏈和雙鏈的 35外切酶活性，它的活性也很強，約為外切酶活性，它的活性也很強，約為 klenow 酶的酶的 1000 倍。倍。 t7 dna 聚合酶不具有聚合酶不具有 53外切酶活性。由于外切酶活性。由于 t7 dna 聚聚合酶的高度續進性和不受合酶的高度續進性和不受 dna 二級結

10、構的影響，在分子生二級結構的影響，在分子生物學中常被用于長模板物學中常被用于長模板 dna 的引物延伸反應。同時，經修的引物延伸反應。同時，經修飾的飾的 t7 dna 聚合酶還是雙脫氧終止法對長片段聚合酶還是雙脫氧終止法對長片段 dna 進行進行測序的理想工具酶。測序的理想工具酶。t7 dna 聚合酶聚合酶 堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（alkaline phosphatase） 堿性磷酸酶是一類能特異性地切去堿性磷酸酶是一類能特異性地切去dna或或rna的的5-磷酸基團的工具酶，磷酸基團的工具酶，它們的作用底物可以是它們的作用底物可以是ssdna或或dsdna或或rna，也可以是，也可以是ntp或

11、或dntp。用途用途 1）去除）去除dna片段的片段的5-末端的磷酸基。防止線狀末端的磷酸基。防止線狀dna的自身環化的自身環化（self-ligation）。）。 2）除去）除去pcr反應后殘存的反應后殘存的dntp。pcr產物進行測序時，在反應體產物進行測序時，在反應體系中如果有多余的系中如果有多余的primer和和dntp，將影響測序反應的正常進行。，將影響測序反應的正常進行。使用使用exonuclease i分解殘存的分解殘存的primer；用；用sap處理可降解多余的處理可降解多余的dntp，之后不需要對，之后不需要對pcr產物進行精制，立即可以進行測序反應。產物進行精制，立即可以進

12、行測序反應。 從細菌中分離的堿性磷酸酶從細菌中分離的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, e.coli c75; bap) 從小牛腸中分離的堿性磷酸酶從小牛腸中分離的堿性磷酸酶 (alkaline phosphase, calf intestinal, cap)。 從蝦提取的蝦堿性磷酸酶從蝦提取的蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，sap ） 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶t4 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 （t4 polynucleotide kinase，pnk） dna 或或 rna 5 末端的磷酸化，以便進行末端的磷酸化，

13、以便進行連接反應。連接反應。 dna 或或 rna 的末端標記，用作探針和進的末端標記，用作探針和進行行 dna 測序。測序。 雙鏈雙鏈dna片段的磷酸化片段的磷酸化在微量離心管中配置溶液如下：在微量離心管中配置溶液如下：3737反應反應3min,703min,70反應反應5 51010分鐘分鐘使酶失活。進一步用酒精沉淀的方法精制使酶失活。進一步用酒精沉淀的方法精制dnadna。t4 polynucleotide kinase 2 latp(10mm) 5 l10 reaction buffer 5 l雙鏈雙鏈dna片段片段 10 pmol 超純水超純水 補足補足 50 ldna 酶酶 i （

14、dnase） dna 酶酶 i（dnase i）是隨機水解雙鏈或單鏈）是隨機水解雙鏈或單鏈 dna的一種內切酶，使的一種內切酶，使 dna 分子降解成帶有分子降解成帶有 5磷酸末磷酸末端的單核苷酸和寡核苷酸的混合物。端的單核苷酸和寡核苷酸的混合物。 進行重組進行重組 dna 研究時，必須注意防止研究時，必須注意防止 dna 酶的污酶的污染，否則制備的染，否則制備的 dna 樣品將會降解。樣品將會降解。 因此使用的器皿或試劑要高溫處理，樣品中需加因此使用的器皿或試劑要高溫處理，樣品中需加 edta，或放置冰上以破壞或抑制酶活性。，或放置冰上以破壞或抑制酶活性。 用用 途途 1）與）與dna po

15、lymerase i 一起用于切口平移一起用于切口平移（nick translation）。）。 2）在）在mn2+存在的條件下，為鳥槍法測序（存在的條件下，為鳥槍法測序（shot gun sequencing）制作）制作dna文庫。文庫。 3）用于足跡法（）用于足跡法（foot printing）分析）分析dna-蛋白蛋白質相互作用。質相互作用。 4) dnase i 可以作用于單鏈可以作用于單鏈 dna、雙鏈、雙鏈 dna、染色質和染色質和rna:dna雜交鏈。雜交鏈。 rna酶a（ribonuclease a） ribonuclease a是一種內切核糖核酸酶，是一種內切核糖核酸酶，可在

16、可在c和和u殘基位置特異性降解單鏈殘基位置特異性降解單鏈rna。該酶可以切割核苷上該酶可以切割核苷上5-核糖與鄰近嘧啶核核糖與鄰近嘧啶核苷苷3-核糖上磷酸基團之間的磷酸二脂鍵。核糖上磷酸基團之間的磷酸二脂鍵。產生的產生的2，3-環磷酸可以水解成相應的環磷酸可以水解成相應的3-核苷磷酸鹽。核苷磷酸鹽。 產品用途：產品用途：質粒和基因組質粒和基因組dna制備時用于去除制備時用于去除rna； 重組蛋白質制備過程中，除去溶液中的重組蛋白質制備過程中，除去溶液中的rna。 質粒提取后用rna酶處理其它的其它的rna酶酶 rna 酶酶t1只作用于鳥嘌呤核苷酸的只作用于鳥嘌呤核苷酸的3磷酸根，磷酸根，切開與

17、其相鄰核苷酸連接的切開與其相鄰核苷酸連接的 5磷酸鍵；磷酸鍵； rnase h 可以降解可以降解 dna-rna雜交鏈中的雜交鏈中的 rna分子。分子。防護防護rna酶的污染酶的污染 人體的分泌物如唾液、汗液中都含有人體的分泌物如唾液、汗液中都含有 rna 酶。酶。 因此在操作因此在操作 rna 樣品時，必須戴手套，實樣品時，必須戴手套，實驗用的玻璃器皿都要經驗用的玻璃器皿都要經 250 烘烤烘烤 4h(rna 酶耐熱酶耐熱)，或用，或用 rna 酶的抑制劑酶的抑制劑處理。處理。末端轉移酶的主要用途末端轉移酶的主要用途 末端脫氧核苷酸轉移酶簡稱末端轉移酶，分子量為末端脫氧核苷酸轉移酶簡稱末端轉

18、移酶，分子量為 60 kd，來源于前淋巴細胞和分化早期的類淋巴樣細胞。在二價陽離來源于前淋巴細胞和分化早期的類淋巴樣細胞。在二價陽離子的存在下，該酶能夠逐個地將脫氧核苷酸分子加到線性子的存在下，該酶能夠逐個地將脫氧核苷酸分子加到線性 dna 分子的分子的3-oh末端。末端轉移酶在反應過程中不需要模末端。末端轉移酶在反應過程中不需要模板的存在。板的存在。 對不同的對不同的dntp所需要的二價陽離子不同，若加入的核苷酸所需要的二價陽離子不同，若加入的核苷酸是嘧啶核苷酸，則是嘧啶核苷酸，則co2+為首選陽離子；如果加入的核苷酸是為首選陽離子；如果加入的核苷酸是嘌呤核苷酸，則嘌呤核苷酸，則mg2+為首

19、選陽離子。為首選陽離子。 當反應體系中只有一種當反應體系中只有一種dntp時，就可以在時，就可以在dna分子的分子的3末末端加上同聚物尾巴端加上同聚物尾巴(homopolymeric tail)。末端轉移酶的主要用途末端轉移酶的主要用途 分別給外源分別給外源 dna 片段和載體分子加上互補的同聚片段和載體分子加上互補的同聚物尾巴，以使它們可以連接起來。物尾巴，以使它們可以連接起來。 例如：可以給用做克隆載體的線性例如：可以給用做克隆載體的線性 dna 分子的分子的 3-oh 末端加上末端加上poly(dt)尾巴，給待克隆的外源尾巴，給待克隆的外源 dna 片段的片段的 3-oh 末端加上末端加

20、上poly(da)尾巴。然后將外源尾巴。然后將外源 dna 連接于載體中，形成重組連接于載體中，形成重組 dna 分子。分子。末端轉移酶的主要用途末端轉移酶的主要用途 d n a 連接酶 作用機制及特點dna 連接酶(dna ligase)能利用 nad+或 atp 中的能量，催化多段 dna 的 3羥基和5磷酸末端之間形成 3，5-磷酸二酯鍵，把兩個 dna 片段連接在一起，封閉 dna 雙鏈上形成的切口(見圖 3-3)。連接酶和限制酶一樣是基因工程中不可缺少的重要工具。 應當注意，dna 連接酶只能連接雙鏈 dna 分子的單鏈切口(nick)，既不能催化兩條單鏈 dna 分子的連接(t4

21、dna 連接酶例外)，也不能催化雙鏈中一個或多個核苷酸缺失所造成的缺口(gap)。dna 連接酶的分類 常用的 dna 連接酶有 t4 dna 連接酶和大腸桿菌 dna 連接酶兩種。 在這兩種連接酶中，最常使用的是 t4 dna 連接酶，它的連接效率高，既可用于黏性末端的連接，也可用于平齊末端的連接。一般來說，片段越小，末端黏性越強，連接反應則可使用較高的溫度。dna 平齊末端的連接比黏性末端連接效率低得多。平齊末端的連接一般需要在 1020 進行，且需要較高的 dna 濃度和 t4 dna 連接酶的濃度。而黏性末端的連接一般在 1626 進行。 大腸桿菌大腸桿菌 dna 連接酶催化的連接反應

22、中所需要的能量由連接酶催化的連接反應中所需要的能量由 nad+提供，提供， t4 dna連接酶催化的反應中所需要的能量由連接酶催化的反應中所需要的能量由 atp 提供。提供。其他方面大腸桿菌其他方面大腸桿菌 dna 連接酶和連接酶和 t4 dna 連接酶的作用連接酶的作用機制相同。機制相同。 各種連接酶特性的比較各種連接酶特性的比較 反轉錄酶反轉錄酶 商品化的反轉錄酶有兩種，一種來自禽成髓細胞商品化的反轉錄酶有兩種，一種來自禽成髓細胞瘤病毒瘤病毒(amv)，另一種來自大腸桿菌中表達的，另一種來自大腸桿菌中表達的 moloney 鼠白血病病毒鼠白血病病毒(mo-mlv)。 它們均具有：它們均具有： 依賴于依賴于 rna 的的 dna 聚合酶活性；聚合酶活性； rnase h 活性活性(即持續地、特異地降解即持續地、特異地降解 dna-rna 雜交鏈中的雜交鏈中的 rna 鏈的活性鏈的活性)； 依賴于依賴于 dna 的的 dna 聚合酶活性。聚合酶活性。 amv 及及 mo-mlv 反轉錄酶在許多