1、編號no：河北農業大學本科畢業論文論文題目 利用ssr標記對高粱重組自交系進行抗蚜性鑒定學生姓名 陳再軍 學號 2009014010215 成績 89 學院 農學院 專業班級 農學0902班 指導教師姓名 常金華 指導教師職稱 教授 材料目錄：1、任務書 （1）份2、開題報告 （含文獻綜述） （1）份3、指導教師評閱書 （1）份4、答辯記錄表 （1）份5、論文正文 （1）份6、其它材料河北農業大學本科畢業論文任務書學 院： 農學院 教師姓名： 常金華 職 稱： 教授 二零一二 年 五 月 四 日專業名稱農學院，農學專業論文題目利用ssr標記對高粱重組自交系進行抗蚜性鑒定題目來源通過對田間高粱對

2、蚜蟲的觀察以及前人在實驗室利用分子標記在高粱抗蚜的鑒定方面的成果目的意義：1、高粱蚜蟲嚴重危害高粱，通過對高粱抗蚜的研究可以有效控制田間高粱蚜蟲。2、通過對高粱抗蚜基因的鑒定，可以大大縮減田間育種的年限，對育種工作具有指導性的意義。3、在抗蚜基因的研究可以從生物自身抵御高粱蚜蟲，可以避免化學藥劑抗蚜蟲造成的環境污染。可行性分析：1、研究條件： 高粱具有抗蚜性的基因，對蚜蟲表現為抗蚜和感蚜兩種性狀。其中高粱的抗蚜基因對感蚜基因表現顯性，受主效單基因控制。在對高粱抗蚜田間觀察中，發現具有抗蚜性基因的植株明顯比不具有抗蚜性基因的植株受到危害小，因此可以利用分子標記對高粱的抗蚜基因進行定位，從而指導田

3、間育種工作，前人也曾利用分子標記對高粱蚜基因進行定位并取得突破性的成果，因此本實驗是可行的。2、預期結果 通過利用凝膠電泳對一些與抗蚜相關的ssr標記進行多態性分析，篩選出6對具有多態性的引物，并對高粱品種“河農16”和“千三”的f8重組自交系進行ssr多態性分析，從而觀察篩選出的6對具有多態性引物在群體中的抗感情況，通過對群體電泳條帶的觀察，并結合對群體抗感表型的調查來找到與目的性狀相連鎖的基因。預計實驗所用的分子標記與抗蚜基因是相連鎖。3、可能存在的問題 由于時間的原因，田間試驗的重復數較少，所得到的結論可能存在一定問題，需要多次重復進行驗證。進度安排：2012年5-6月：查閱資料，設計試

4、驗內容，選擇大豆品種。2012年6-12月：撰寫課程論文，開展試驗內容，完成試驗內容。2013年1-6月：整理試驗數據，完善試驗內容，撰寫畢業論文，準備答辯材料，進行畢業答辯。專家意見：論文選題針對性強，依據充分，設計合理，路線可行，進度安排合理，預期結果明確，同意按計劃執行。專家簽字：2012年 5月10日學院意見: 院長： 年 月 日 農學 學院 農學 專業 陳再軍 學生現把 2012-2013 學年，第 2 學期的畢業論文安排下達給你，你本學期承擔的畢業論文任務如下：1、依據本任務書中論文題目、目的意義、可行性分析的內容完成開題報告。2、按照開題報告的要求按期完成畢業論文各項工作的實施。

5、3、完成畢業論文的撰寫。4、完成畢業論文的答辯。 請按相關要求完成畢業論文任務。教師簽字：2012年 5 月 4 日河北農業大學本科畢業論文開題報告題 目： 利用ssr標記對高粱重組自交系進行抗蚜性鑒定 學 院： 農學院 學生姓名： 陳再軍 專 業： 農學 班級學號： 2009014010215 指導教師姓名： 常金華 指導教師職稱： 教授 二零一二年六月五日學生姓名陳再軍專業班級農學0902班學 號2009014010215指導教師常金華職 稱教授所在學院農學院論文名稱利用ssr標記對高粱重組自交系進行抗蚜性鑒定選題依據理論依據：高粱具有抗蚜性的基因，對蚜蟲表現為抗蚜和感蚜兩種性狀。其中高粱

6、的抗蚜基因對感蚜基因表現顯性，受主效單基因控制。在對高粱抗蚜田間觀察中，發現具有抗蚜性基因的植株明顯比不具有抗蚜性基因的植株受到危害小，并且前人在實驗室也進行過分子標記對高粱抗蚜蟲基因進行過定位，因此可以利用分子標記對高粱的抗蚜基因進行定位，從而指導田間育種工作。目的意義：1、高粱蚜蟲嚴重危害高粱，通過對高粱抗蚜的研究可以有效控制田間高粱蚜蟲。2、通過對高粱抗蚜基因的鑒定，可以大大縮減田間育種的年限，對育種工作具有指導性的意義。3、在抗蚜基因的研究可以從生物自身抵御高粱蚜蟲，可以避免化學藥劑抗蚜蟲造成的環境污染。文獻綜述：王富德等(1993)對3799份中國高粱品種資源進行了抗高粱蚜鑒定,結果

7、表明,高抗的1份,抗的4份,占總數的0.13%;中感的441份,占總數的11.61%;其余88.26%的高粱資源對蚜蟲的為害都很敏感。唯一1份高抗高粱蚜資源是恢復5-27(國家編號8432) ,在它的系譜中有抗高粱蚜的外國高粱品種tam428。對高粱蚜表現抗的4 份中國高粱品種分別是緊穗高粱(忻縣)、紅殼散碼(鹿邑) 、粘高粱(輝南)和大鑼錘高粱(沾化)。潘景芳等(1996) 報道,從1986年開始,利用抗蚜源tam428等與非抗蚜材料雜交,從分離后代中選育出11份恢復系,并利用這些恢復系與6個不育系選配一批雜交種,又通過人工接蚜鑒定、產量鑒定和主要農藝性狀鑒定,從中篩選出幾個較為優良的抗蚜恢

8、復系及其高產、優質、多抗雜交種。1996-2000 年,在田間采用人工接菌法進行高粱抗病性鑒定和利用田間自然發生的害蟲種群與人工輔助接蟲相結合的方法進行高粱抗蟲性鑒定,對1282 份高粱種質資源進行了高粱絲黑穗病、高粱靶斑病、高粱蚜蟲和玉米螟等4種病蟲害的抗性同步鑒定。劃清了被鑒定資源對不同病蟲害的抗性等級,篩選出兼抗2種病蟲害的雙抗性資源93份,兼抗3種病蟲害的多抗性資源9份。通過對抗蚜的河農16和感蚜品系tx623b、tx622b、tx3197b、千三、晉五及雜交種的物理特性、組織結構、生理生化特性的對比分析,研究了不同基因型高粱理化特性與抗蚜性的相關性。結果表明,高粱抗蚜品系葉片表面較感

9、蚜品系的細胞排列整齊、致密、表皮細胞直徑較感蚜品系小、葉片薄、葉片表面光滑、葉片顏色淺感蟲后各品系過氧化物酶(pod)、多酚氧化酶(ppo)活性均有升高,與蚜蟲的誘導存在相關性,但不同品系感蚜前后均不存在趨勢性變化;苯丙氨酸解氨酶(pal)酶活性感蟲前在抗蟲的河農16及雜交種中具有高水平表達,并與其他感蚜品系存在顯著差異;蚜蟲侵害誘導后pal酶活性均有上升,但抗蚜品系中表現穩定,酶活性變化幅度與葉片損傷程度存在相關性,pal酶活性與高粱的抗蚜性存在明顯的相關性。感蟲前后氨基酸含量及其變化與高粱品系抗蚜性間無相關性;在感蚜蟲前,抗蚜品系及其雜交種可溶性糖含量顯著高于感蚜品系,接蟲后感蚜品系可溶性

10、糖含量升高顯著。1997年進行大面積藥效試驗,70%高巧拌種即可有效控制蚜蟲在高粱抽穗期(即為害盛期)的為害,結果表明70%高巧干種衣劑對高粱出苗期、出苗率及生育期無不良影響, 且有一定的壯苗促長作用。對高粱苗期蚜蟲控制效果明顯,并可控制蚜蟲的危害到高粱抽穗期;即一次拌種就解決蚜害, 同時對地老虎還有一定的抑制作用。頭水進地要及時,避免高粱受旱,防蚜效果更佳。1982年，徐守珍等于田間和室內鑒定了500余份國內外種質資源的抗蚜性, 從中發現tam428和dubor 2高抗高粱蚜。研究方法、內容： 通過利用凝膠電泳對一些與抗蚜相關的ssr標記進行多態性分析，篩選出6對具有多態性的引物，并對高粱品

11、種“河農16”和“千三”的f8重組自交系進行ssr多態性分析，從而觀察篩選出的6對具有多態性引物在群體中的抗感情況，通過對群體電泳條帶的觀察，并結合對群體抗感表型的調查來找到與目的性狀相連鎖的基因。dna提取：主要是利用ctab法提取高粱葉片組織的dna。1）ctab提取緩沖液（2%ctab，1m tris-hclph8.0，0.5medta ph8.0，1.4 mmol/l nacl，2-巰基乙醇），65提前水浴；剪取高粱葉片于研缽中加入800ulctab提取液研磨，將研磨液轉入1.5ml離心管中65水浴40min。（2）將離心管取出冷卻至室溫，加入等體積的氯仿:異戊醇（24:1），充分混勻

12、，配平后10,000 rpm離心10 min，將上清液轉移到另一離心管中。 （3）加入2倍體積的預冷過的無水乙醇，輕輕顛倒數次即可見成團白色dna絮狀沉淀析出(可以置于-20放置30 min)，10,000 rpm離心10 min，棄上清。（4）加1 ml 70乙醇進行洗滌，10,000rpm離心5 min，重復本步驟2次。（5）去掉乙醇后室溫下風干dna，加入50ul的dd h2o使之完全溶解。（6）紫外分光分度計檢測dna濃度，1%瓊脂糖凝膠檢測dna完整性。pcr擴增：pcr反應程序為：95預變性 5min, 循環 95變性 30s、退火1min、72延伸 2min, 共 35個循環,

13、最后在 72延伸 10min。pcr產物用8%的凝膠工作液電泳分離, 銀染顯色。統計分析：首先利用excel表統計田間表型觀察結果以及實驗室鑒定結果，然后用mapmaker對分析結果進行計算, 用kosambi函數將重組值轉換為遺傳圖距。進度安排： 2012年5-6月：查閱資料，設計試驗內容，選擇高粱品種并進行田間種植。2012年6-12月：撰寫課程論文，開展試驗內容，完成試驗內容。2013年1-6月：整理試驗數據，完善試驗內容，撰寫畢業論文，準備答辯材料，進行畢業答辯。指導教師意見：論文以測定利用ssr標記對高粱重組自交系進行抗蚜性鑒定為題，立題依據較充分，具有一定的理論和實用價值。試驗方案

14、設計合理，科學可行，進度安排合適，預期結果明確，同意開題，并進入下一階段試驗內容。指導教師：2012年6月 5 日審 核 小 組 成 員姓 名職 稱備 注姓 名職 稱備 注開題報告記錄：1、pcr擴增時需要注意什么？答：保證模板、使用物品的無污染和操作規范，針對不同作物的不同試驗要求，建立相適應的pcr反應體系，又是取得試驗成功的關鍵。pcr反應有幾個關鍵環節：模板dna的純度和數量；引物的質量與特異性；酶的質量與數量；buffer（mg2+）數量；pcr循環條件。2、影響高粱蚜大發生的主要條件是什么？答：主要是受空氣濕度和溫度影響，根據前人相關報道，自6月中旬至7月中旬，平均氣溫在22-29

15、，旬平均相對濕度在55%-75%，溫度系數（旬雨量/旬平均氣溫）大多在1以下，是大發生的主要條件。審核小組評語：選題依據比較充分，試驗安排合理，研究方法可行，同意開題并進入下一階段試驗工作。審核小組組長：（簽字）年 月 日學院意見：院長：年 月 日河北農業大學本科畢業論文指導教師評閱書學生姓名：陳再軍 學號：2009014010215專業班級：農學0902班級所在學院：農學院論文題目：利用ssr標記對高粱重組自交系進行抗蚜性鑒定 指導教師評語： 陳再軍在本課題組開展畢業論文工作期間，能夠遵守學校和學院的各項規章制度，較好的完成論文涉及研究任務，具有較扎實的基礎理論和專業知識。論文以高粱抗蚜基因

16、的定位研究內容。選題針對性較強，依據充分，具有一定的科學意義和應用價值。試驗設計安排合理，技術路線可行，工作量較大，符合本科畢業論文要求。論文寫作格式比較規范，文獻參考得當，符合一般科技論文寫作要求。論文不足之處在于：（1）文中討論部分應著重討論本研究與前人研究的異同與創新性。（2）英文摘要尚需進一步的推敲斟酌。（3）文中表格注意采用三線表。成 績 評 定：89是否同意答辯： 指導教師（簽名）： 2012年6 月2日河北農業大學本科畢業論文答辯評分表評分指標分 值評 價 內 容得 分論文選題10選題有重要理論意義或實用價值。立題依據充分。文獻引用12閱讀、引用文獻資料較廣泛，較全面了解本領域學

17、術動態，綜合分析能力較強。論文難度及工作量14難度較大，工作量大。論文成果的創新性12有獨到見解，有較大的創新性成果。理論基礎與科研能力16具有堅實的基礎理論和系統的專門知識，具有較強的獨立從事科研工作的能力，研究方法和技術體系得當。寫作能力16條理清楚，層次分明，說理透徹，文筆流暢，表格、繪圖準確規范，中外文摘要簡明扼要，語句通順，語法正確，符合科技寫作規范。答辯報告10能簡明扼要、重點突出地闡述論文或設計的主要內容，有新見解，結論明確；時間掌握恰當。回答問題10思維敏捷，邏輯性強，準確流利地回答各種問題。總 分10089注：本表為答辯小組成員評分用表，評分標準參照河北農業大學畢業論文質量評

18、定參考標準河北農業大學2013 屆本科畢業論文答辯記錄表所在學院：農學院 專業班級：農學0902班 時間：2013 年 6 月 7 日學 生 姓 名陳再軍學 號2009014010215指導教師姓名常金華職 稱教授畢業論文題目：利用ssr標記對高粱重組自交系進行抗蚜性鑒定答 辯 小 組 成 員姓 名職 稱成 績姓 名職 稱成 績答辯小組評語：論文的立題依據較充分，試驗數據比較可靠，工作量較大。論文寫作格式比較規范，符合一般科技論文寫作要求。在論文答辯過程中重點突出，回答問題基本正確。答辯小組組長：（簽字）2013年 6 月 7 日答 辯 成 績：89注：本表與學生畢業論文（設計）一同在學院存檔

19、（必須用鋼筆書寫）農學院 本 科 畢 業 論 文題 目：利用ssr標記對高粱重組自交系進行抗蚜性鑒定 專業班級： 農 學 0902 班 學 號： 2009014010215 學生姓名： 陳再軍 指導教師： 常金華 職 稱： 教 授 2013年5月20日利用ssr標記對高粱重組自交系進行抗蚜性鑒定陳再軍（河北農業大學 農學0902班071001）摘要：本實驗通過利用凝膠電泳對一些與抗蚜相關的ssr標記進行多態性分析，篩選出6對具有多態性的引物，并對高粱品種“河農16”和“千三”的f8重組自交系進行ssr多態性分析，從而觀察篩選出的6對具有多態性引物在群體中的抗感情況，通過對群體電泳條帶的觀察，并

20、結合對群體抗感表型的調查來找到與目的性狀相連鎖的基因。結果表明：實驗所用的分子標記與抗蚜基因是相連鎖。關鍵詞：高粱；抗蚜性；ssr標記；遺傳分析identification of the aphid resistance of sorghum bicolor with ssr markerchen zaijun (agriculture univercity of hebei,class agronomy of 0902,071001)abstract: this experiment by using gel electrophoresis for some ssr marker polym

21、orphism analysis associated with resistance to aphid, screened 5 pairs of polymorphic primers, and sorghum varieties “hn- 16” and qian san f8 recombinant inbred lines for ssr polymorphism analysis, in order to observe the screen for 5 polymorphic primers sense of resistance in the community, through

22、 the observation of the groups electrophoresis bands, and combining the survey of group feeling phenotypic resistance to find the traits and purpose in a chain of genes. results show that the molecular markers used in the experiment with aphid resistant gene is chain. key words: sorghum bicolor；aphi

23、d resistance；ssr marker; genetic analysis0引言【本實驗意義】高粱作為世界上最重要的糧食作物之一，其產量和質量受到世界的關注和研究，它具有抗旱、耐澇及抗鹽堿等不良環境的特性。高粱蚜（melanaphis sacchari）主要危害高粱又可危害甘蔗、小麥、大麥、玉米等作物，是一種間歇性發生的猖獗害蟲，每3-4年突發一次。蚜蟲除直接從植物體內吸收營養外，還大量分泌蜜露等物質污染作物，影響了植物的光合作用，嚴重影響產量和品質1。通過對高粱抗蚜性的鑒定，對高粱研究育種方面具有一定的指導性意義。【前人研究進展介紹】2008年，常金華2等人通過對抗蚜的河農16和感蚜

24、品系tx623b、tx622b、tx3197b、千三、晉五及雜交種的物理特性、組織結構、生理生化特性的對比分析,研究了不同基因型高粱理化特性與抗蚜性的相關性。結果表明,高粱抗蚜品系葉片表面較感蚜品系的細胞排列整齊、致密、表皮細胞直徑較感蚜品系小、葉片薄、葉片表面光滑，并且在所有的供試材料中，感蚜前后抗蟲和感蟲品系的pal酶存在規律性的變化。2010年，鄒劍秋等采用ssr技術，應用分離群體分組分析法，分別利用恢復系分離群體（2381r矮四）和保持系分離群體（tx622b7050b），篩選抗絲黑穗病菌3號生理小種基因的分子標記，最后在所用的ssr引物中篩選出4個，位于b染色體上，xtxp145位于

25、i染色體上，與抗病基因的重組率分別為9.6%和10.4%，距離抗病基因的遺傳圖距分別約為9.6cm和10.4cm3。2010年，余傳漲等人采用自行開發的52個ssr標記對41個高粱品種進行遺傳多樣性分析。結果表明, 52對ssr引物在3%瓊脂糖凝膠上共檢測出277個等位變異,平均每個位點有5-3個等位變異。通過聚類分析將41個高粱品種分為2個類群8 。【本實驗切入點】分子標記能在dna水平上反映植物遺傳基礎的差異，是植物遺傳育種領域內的一項新興技術。ssr（simple sequence repeat,簡單重復序列）是當今四大分子標記技術之一。簡單序列重復( simple sequence r

26、epeat , ssr) 又稱微衛星( microsatellite) , 它是基于pcr 基礎上的一種分子標記, 最早在人類基因組研究中發現, 而后被應用于植物、動物等研究中。它是一種由1-5個核苷酸為重復單位串聯組成的長達幾十個核苷酸的序列5。與形態學標記、細胞學標記、生化標記這3種標記比較，分子標記具有準確度比較高、信息量大、遺傳多態性高、穩定性、重復性好等特點6。因此ssr標記在基因組研究中廣泛地應用于遺傳圖譜的構建、比較基因組和系統研究中,同時也是在分子水平上研究遺傳多樣性的有力工具。近年來隨著社會經濟的發展和科學技術的進步,高粱的利用價值被逐步發掘出來, 廣泛用于飼料, 燃料乙醇,

27、 制糖等產業。合理開發利用高粱, 對我國糧食安全, 緩解能源危機具有重要意義。對高粱抗蚜性在分子方面的研究，一方面有助于高粱的產量的提高，另一方面，有利于緩解能源與糧食危機。【本實驗的目的】本實驗利用河農16和千三的雜交組合，對高粱抗蚜性鑒定方法，抗性遺傳和ssr分子標記等進行了一些調查了解。其目的在于：了解高粱抗蚜性的遺傳鑒定方法，充分了解高粱抗蚜性的遺傳特點，建立一套適合高粱蚜抗性的ssr體系找到與高粱蚜抗性基因連鎖的分子標記，為最終掌握高粱蚜抗性遺傳規律，克隆高粱蚜抗性基因奠定基礎。1材料和方法1.1供試材料河農16（ hn-16） 來源于河北農業大學利用從優質雜交種nk22 的分離后代

28、中獲得, 對高粱蚜表現免疫,是優質糧飼兼用型品種。千三( q s) 由千晉紅和三尺三的雜交后代選育, 是河北農業大學選育的一個豐產性較好的恢復系, 但對高粱蚜表現高感。1.2儀器與藥品實驗儀器：試管若干、錐形瓶、離心管、研缽、剪刀、水浴鍋、離心機等。藥品：硝酸銀、氫氧化鈉、1.4 mmol/l nacl，2% ctab，1m tris-hclph8.0，0.5medta ph 8.0，1.4 mmol/l nacl，氯仿:異戊醇（24:1）、無水乙醇、70乙醇等。1.3方法1.3.1 dna的提取通過使用ctab法提取高粱葉片組織dna，具體步驟如下：（1）ctab提取緩沖液（2%ctab，1

29、m tris-hclph8.0，0.5medta ph8.0，1.4 mmol/l nacl，2-巰基乙醇），65提前水浴；剪取高粱葉片于研缽中加入800ulctab提取液研磨，將研磨液轉入1.5ml離心管中65水浴40min。（2）將離心管取出冷卻至室溫，加入等體積的氯仿:異戊醇（24:1），充分混勻，配平后10,000 rpm離心10 min，將上清液轉移到另一離心管中。 （3）加入2倍體積的預冷過的無水乙醇，輕輕顛倒數次即可見成團白色dna絮狀沉淀析出(可以置于-20放置30 min)，10,000 rpm離心10 min，棄上清。（4）加1 ml 70乙醇進行洗滌，10,000rpm離

30、心5 min，重復本步驟2次。（5）去掉乙醇后室溫下風干dna，加入50ul的dd h2o使之完全溶解。（6）紫外分光分度計檢測dna濃度，1%瓊脂糖凝膠檢測dna完整性。1.3.2 ssr擴增 ssr引物序列見下表：引物名稱堿基序列（5端到3端）退火溫度/sb6m3174ftag cgg att caa tgt tgc52.74sb6m3174rtcc aca tca tct tcc aca a53.25sb6m3500ftcg tgc tgc ttg cct tca57.3sb6m3500rccg agc gtt gtt gtc ttc a57.56sb6m3610fgaa aag gtt

31、 gct tcg taa50.47sb6m3610rgaa cat ccg tcc cat aaa52.74sb6rj2880fatc gag cca tcc atc tca ac57.8sb6rj2880rtgg tcg aaa ttt acg aga caa a54.48g5-q-5-fatt gacg tac cga tgt ctc ta55g5-q-5-rtca gtc cat aaa aca tgt aca g55本實驗中ssr擴增采用10lpcr反應體系。pcr體系（10l）模板dna 1.5l引物 0.5l10buffer 1ldntp 0.2ltaq酶 0.1ldd 水 6.2

32、 l反應循環參數參照劉國慶7的方法，略作改動：pcr反應程序為：95預變性 5min, 循環 95變性 30s、退火1min、72延伸 2min, 共 35個循環, 最后在 72延伸 10min。pcr產物用8%的凝膠工作液電泳分離, 銀染顯色（其8%的凝膠工作液和銀染試劑的配制見表1、2）。8%的凝膠工作液配制成分/溶液體積 20406080100超純水/ml 142842567010tbe/ml 24681040%貯液/ml 48121620temed/l 2040608010010%ap/l 2004006008001000（注：temed作用是促進凝固，應先加，ap作用是凝固，應后加）

33、銀染過程藥品配制成分/溶液體積ml100150200250300硝酸銀/g0.20.30.40.50.6顯色液氫氧化鈉/g1.52.2533.754.5甲醛40%/ml11.522.531.3.3 數據統計ssr擴增產物以0、1、2建立數據庫，在相同的標記位置上， 抗蚜的條帶標記為1，感蚜的條帶標記為0，具有雙親的雜合體條帶標記為2，沒有條帶或者模糊不清的條帶忽略不計（記為*），其中鑒定結果b表示感蚜， a表示抗蚜。根據趙雪梅，劉太峰，李云靜等人用人工去雄方法，利用抗蚜x感蚜、耐蚜x感蚜、感蚜x感蚜等組合的雜交后代和回交后代，對高粱品種抗蚜的遺傳規律進行研究。結果表明，高粱的抗蚜基因對感蚜基因

34、表現顯性，受主效單基因控制8。因此在存在雜合體的引物中，以抗蚜為表現性狀。2結果與分析2.1 模板 dna 質量檢測用紫外分光光度計對提取的 dna 進行檢測, od260/od280的比值處于 1.691.92 之間, 表明提取的 dna樣品純度比較高, 少部分 dna 樣品有輕微的蛋白質或 rna 污染。2.2 多態性引物的篩選圖1：親本引物條帶電泳結果根據上述兩親本間多態性引物的篩選結果和觀察，表明：所擴增的條帶清晰、分辨率高、重現性好、多態性強，是較適宜的擴增體系（見下圖1）。2.3數據結果統計株系編號sb6m3174sb6m3500sb6m3610sb6rj2776sb6rj2880

35、引物g5-q-5表型調查鑒定結果1000200aa2000000bb3111111aa402*000aa50002*0aa6000000bb7000011aa811*111ba9220220aa11111111ba12220220ba13000200ba1410*111ba15010000aa16010000aa17000000bb18000000ab19111111aa20111111ba21000000ab22020200ba23000200aa24220222ba25110110aa26000000ab27000000bb28111111aa29212212aa30111111ba310

36、00200ba32220220aa33111111aa34111111aa35000200aa36000200ba37111112ba38111111aa39000000ab40000000ab41000000bb42000200ba43111111aa44000200aa45101110ba46101220ba4720*2*0aa48111110aa49200200ba50000000ab51020200ba52000000bb53000000bb54210210aa56000000bb57110000aa58000000bb59000000ab601*111aa61000000bb6210

37、*111aa63000000bb64210000ba65010000ba66010000aa670*1*ba68000000bb690001*0ba701011*1aa71110000ba720100*0aa73000000bb74000000ab75000000ab76111111ba77200220aa78111111aa79210220aa80000000bb8200*2*0ba8300*000ab84111111ba8511*111aa86111111aa87000000bb88000220aa89000000bb90210220aa910000*0bb92000011ba94*002

38、10ba96000000bb98000000bb99000000bb1000000*0bb101000000bb102000000bb103000000ab104000200ba108000000bb109111111aa110111211ba111000000bb112000000bb113000000bb114000000bb115111111aa116000000bb117220220aa118000000bb121000000bb122111111ba123000000ab124000000bb12520022*aa1270000*0bb128000200ba129200220aa13

39、0200220aa13211111*aa133000200ba134000000bb135000000bb137200222aa138000000bb139000000bb140111111aa141000000bb142000000bb143000000bb144000000bb2.4 抗蚜鑒定結果通過對高粱中這5對引物以及對高粱群體田間表型的調查，田間表型調查結果中有表現抗蚜的有59株，感蚜的有85株。在對引物進行凝膠電泳后的結果鑒定中，可以發現其中植株表現為抗蚜的有79株，感蚜的65株。用mapmaker對分析結果進行計算, 用kosambi函數將重組值轉換為遺傳圖距(見圖4)。結果顯示

40、, 表型抗蚜具有與抗親一致的分子標記，能夠用分子標記對高粱重組自交系群體進行抗蚜性鑒定。圖4：分析連鎖圖圖2：田間調查時觀察到高粱葉片的抗感情況圖3：凝膠電泳結果條帶3討論在凝膠電泳的結果和田間表型調查作比較，發現一些存在有抗性基因的植株，在表型上卻表現為感蚜，而另外一些具有感蚜引物的植株，卻表現為抗蚜，其可能原因分析如下：3.1高粱植株的物理性狀與抗蚜性的關系通過田間調查和室內分析 ,研究了不同基因型高粱對高粱蚜的抗性及其與高粱物理性狀間的關系。結果表明 ,高粱的抗蚜性屬顯性遺傳。高粱抗、感基因型間的蠟質含量、葉片顏色、葉片表面結構均存在差異。抗蚜品系的蠟質含量和葉綠素含量均低于感蚜品系 ,

41、并且葉片表面光滑 ,細胞排列整齊致密12。因此某些葉片蠟質層含量高的3.2 不同溫度下對高粱植株抗蚜性的影響在高粱蚜蟲大發生時期，由于蚜蟲繁殖量較大，會對高粱植株造成嚴重危害，某些抗蚜的植株也可能會由收到危害。隨著氣溫的升高，從5月下旬開始田間高粱苗陸續出土并見長。同時在越冬寄主上的有翅蚜向高粱田遷移，遷移時間能一直持續到7月上旬，但尚有一部分高粱蚜居留于狄草上。在東北地區，高粱蚜是高溫干旱條件下發生嚴重的害蟲，自6月中旬至7月中旬，平均氣溫在22-29，旬平均相對濕度在55%-75%，溫度系數（旬雨量/旬平均氣溫）大多在1以下，是大發生的主要條件。3.3 高粱抗蚜性基因的表達受環境的影響性狀

42、表現是遺傳因素和環境因素綜合作用的結果，用cry1ab/cry1ac板式試劑盒測定了不同光照時間、不同溫度和不同水平氮肥處理下,cry1ab蛋白在轉基因高粱中的表達水平。結果表明,不同光照長度處理的cry1ab蛋白含量有較大差異,其順序為12 h16 h18 h14 h10 h;不同溫度處理對cry1ab蛋白含量也有較大差異,為2530203540;不同施肥水平下對cry1ab蛋白量也有較大影響,作基肥的以300 kg.hm-2純氮效果最佳15。3.4 人為因素對實驗結果也具有很大方面的影響ssr標記包括pcr和電泳檢測。安全進行pcr的前提是保證模板、使用物品的無污染和操作規范，針對不同作物

43、的不同試驗要求，建立相適應的pcr反應體系，又是取得試驗成功的關鍵。pcr反應有幾個關鍵環節：模板dna的純度和數量；引物的質量與特異性；酶的質量與數量；buffer（mg2+）數量；pcr循環條件9。因此在進行抗性鑒定實驗過程中一定要特別注意這些步驟的操作。而且實驗材料的選擇是在株系群體中選擇的，應避免試驗材料間dna的交叉污染或外來dna的污染。使用冷凍干燥葉片法，可以將每個樣品在單獨的離心管中研磨，研磨使用的小鋼珠最好是一次性的，如果是反復使用小鋼球，必須徹底清洗干凈。使用液氮和研缽研磨葉片組織時，必須在每次研磨前徹底清理干凈研缽和研磨棒10。以及在使用液氮研磨時，要先將研缽用液氮冷卻，在加入液氮后，要先將葉片壓碎，研磨時要快