1、丙泊酚對不同TRPV1沖動劑導致內臟痛的矛盾作用丙泊酚是一種廣泛使用的靜脈麻醉劑 , 靜脈注射時有很高的幾率出現注射痛 說明它具有致痛作用。然而 , 在幾個研究中 ,說明丙泊酚具有抗傷害作用。研究顯示丙泊酚降低初級感覺神經傳入纖維的神經興奮性。 在福爾馬林實驗 的I相和u相，局部注射丙泊酚產生劑量依賴性的抗傷害效果。另一項實驗證實 , 聯合注射丙泊酚可以抑制蜂毒導致的疼痛行為。在小鼠的 腹腔內注射丙泊酚 , 可以抑制醋酸導致的扭體反響 , 該機制被證實是通過脊髓途 徑介導的。辣椒素受體,又名瞬時感受器電位香草酸1亞型(transient receptorpote ntial van illoi

2、d subtype-1, TRPV1),在疼痛的信號傳遞中扮演著十分重要 的作用 , 并且在小鼠的炎癥性熱痛覺過敏的開展中是不可或缺的一環 , 激活 TRPV1是內臟痛中非常重要的步驟。使用TRPV1拮抗劑或者對新生小鼠注射辣椒 素的方法來去除TRPV1神經元，都能抑制之后使用醋酸導致的扭體反響。包括內皮素、前列腺素和緩激肽在內的一系列因子 ,主要通過蛋白激酶A(protein kinase A, PKA) 或者蛋白激酶 C (protein kinase C, PKC) 途徑的磷 酸化來敏化TRPV1研究證實，丙泊酚增強脊髓背根神經節細胞對辣椒素的敏感 性，是通過瞬時感受器電位錨蛋白 1亞型

3、(transient receptor potential ankyrin receptor subtype-1, TRPA1)和 PKCs介導的 TRPV1磷酸化實現的。從理論上推理，腹腔內聯合注射丙泊酚和TRPV1沖動劑會因為丙泊酚對 TRPV1的敏化作用導致內臟痛增強，而這又和之前研究證實的丙泊酚抗傷害作用 相矛盾。因此,我們在小鼠腹腔內注射丙泊酚聯合醋酸或辣椒素 , 觀察其傷害反響 來研究這一效果1 材料和方法 1.1 實驗動物動物本研究均選用鼠齡 6-8 周, 雄性 C57BL/6J 小 鼠,體重 20-22g, 購置于中山大學醫學院實驗動物中心 中國,廣州 。小鼠飼養于 無特定病原

4、體specefic pathogen free, SPF自動調溫、調濕的動物實驗室中, 自由飲水、進食，一天內12 h光照，室溫控制在22C,自由飲食，飼養環境為 12h 晝夜節律變換 , 濕度控制在 50%-70%的環境中。本研究中實驗動物的使用及處理方法均符合廣東省醫學科學院動物實驗倫 理委員會的要求 , 并嚴格按照規定減少動物痛苦 , 盡可能減少實驗動物的使用數 量。1.2實驗材料丙泊酚2,6-二異丙基苯酚和辣椒素都購置于Sigma公司美 國, 密蘇里州 , 圣路易斯 , 并溶解于二甲亞砜 dimethylsulfoxide, DMSO 作為貯 存溶液。醋酸和硫酸鎂購置于杭州化學試劑公司

5、 中國,浙江。所有的藥物在使用前 都經過生理鹽水稀釋。1.3 腹腔內注射醋酸、 硫酸鎂和辣椒素引起的疼痛行為學觀察小鼠于實驗前放置于透明有機玻璃盒22 cmx 12 cmx 10 cm內預適應30min。30min后從盒子 里取出，用胰島素注射針30G針頭腹腔注射0.01ml/g的0.6%醋酸和5mM丙泊酚 的混合溶液對照組 2.5% DMSO+0.01ml/g的 0.6%醋酸、0.6mg/g 的 6mg/ml 硫酸 鎂和5mM丙泊酚的混合溶液對照組2.5%DMSO+O.6mg/的6mg/ml硫酸鎂或者 200uM辣椒素與5mM丙泊酚的混合溶液對照組4.5% DMSO+200u辣椒素，腹腔 注

6、射藥物后立即放入有機玻璃盒內進行觀察 , 整個過程要注意減少對動物的刺激 特別是腹腔注射動作要輕柔 , 以免刺激小鼠致其活動量減少 , 影響行為學的觀察。觀察并用手動計數器記錄每只動物腹腔注射醋酸和硫酸鎂混合溶液后 30 mmin內小鼠扭體反響的次數如腹部收縮、扭動軀干、弓背、伸展后肢等和用秒表計時器記錄腹腔注射辣椒素后 10min 內小鼠傷害反響的總時間 ( 如低頭彎腰 縮成團的姿勢、腹部朝上臥倒的姿勢 ) 。一只動物只作一次實驗 , 每組有 10 只小 鼠。一次同時觀察 4 只小鼠 , 處理組和對照組各 2 只。為盡可能減小晝夜時間因 素對小鼠相關行為的影響 , 本研究中所有動物行為學實驗

7、均在 9：00 至 17：00 之間進行。1.4去除TRPV1神經元小鼠的制備雄性新生小鼠于出生后第二天七氟醚麻醉后皮下注射辣椒素(50 mg/kg),對照組注射同樣容量的溶劑(PBS含10%ethanol與10% Tween-80),動物在SPF動物房里面飼養6周后進行實驗。新生期注射辣 椒素能夠去除表達TRPV神經元，用角膜刺激實驗驗證去除TRPV神經元的效果， 用 0.01%辣椒素 20 ul 噴到小鼠眼睛上 , 小鼠會用前肢拂拭眼睛 , 記數 1 min 內用 前肢拂拭眼睛的次數 , 如 1 min 內用前肢拂拭眼睛的次數少于 5 次就認為已經成 功去除TRPV1神經元。1.5統計分析

8、使用 Windows版Minitab 16(美國，賓夕法尼亞州,Minitab 公 司) 進行統計學分析。 所有數據以均數標準差 (x s) 表示, 正態分布且方差齊時 行獨立樣本 t 檢驗 ,P<0.05 認為有統計學顯著差異。2結果2.1腹腔內聯合注射丙泊酚增加醋酸引起的扭體反響使用2mM勺丙泊酚聯合總量為 0.01ml/g 的 0.6%醋酸在小鼠腹腔內注射后發現 , 與單獨注射 0.01ml/g 的 0.6%醋酸相比 , 每 5 分鐘的扭體反響數量沒有差距 , 而 30分鐘內實驗 組總體的小鼠扭體反響比對照組要高 , 分別為 53.5+9.2 次和 40.33.6 次 (P=0.0

9、2) 。但是兩組之間在發生扭體反響的潛伏期上沒有統計學差異 , 分別為腹腔內注射5mM泊酚不引起小鼠的傷害反響。腹腔內注射0.6%醋酸引起小鼠 30 分鐘內 316.9 次的扭體反響 , 并且潛伏期少于 2 分鐘。我們的觀察證實了注射醋酸后的扭體反響主要發生在 30分鐘內。聯合注射5mM丙泊酚和0.6%醋酸使小鼠30分鐘內的扭體反響增加到42.8 9.2次 (P<0.05)。2.2 腹腔內聯合注射丙泊酚增加硫酸鎂引起的扭體反響腹腔內注射 6mg/ml 硫酸鎂0.6mg/g引起小鼠30分鐘內13.7 2.9次的扭體反響，聯合注射5mM丙泊 酚后,使小鼠30分鐘內的扭體反響增加到25.3 4

10、.8次(P<0.001)。2.3腹腔內聯合注射丙泊酚減少辣椒素導致的傷害反響時間腹腔內注射 200卩M辣椒素后 10秒內導致小鼠的傷害反響時間為 37182.7 秒, 這些反響 10分鐘后消失。腹腔內聯合注射200卩M辣椒素和5mm丙泊酚后,小鼠的傷害反響時間大幅 度縮短至67 39秒(P<0.05)。2.4 TRPVl對腹腔內聯合注射丙泊酚的影響為了明確TRPVl對丙泊酚在致痛物質引起的小鼠傷害反響中的作用，給出生2天的小鼠皮下注射50mg/kg辣椒素,當它們成年后再腹腔內注射醋酸、硫酸鎂或者辣 椒素。經過辣椒素處理后的成年小鼠,腹腔內注射6mg/ml硫酸鎂和200入M辣椒素 后

11、沒有任何的腹部向上臥倒或者低頭彎腰坐立的傷害反響；腹腔內注射0.6%醋酸后,30 分鐘內的扭體反響為 204.1 次,顯著少于對照組經過溶媒處理后成年 小鼠腹腔內注射 0.6%醋酸后 30分鐘內的扭體反響 33 5.8 次；腹腔內聯合注射 5mM丙泊酚和0.6%醋酸后,30分鐘內的扭體反響為16 3.9次，顯著少于單純注 射0.6%醋酸后 30分鐘內的扭體反響 213.6 次。本研究中腹腔內聯合注射丙泊 酚時, 醋酸誘導的扭體反響增加 , 說明丙泊酚具有促傷害作用已有研究證實,腹腔內注射醋酸主要通過 TRPV價導導致扭體反響。所以經大劑量辣椒素處理去除了 TRPV1的新生小鼠成年后，向其腹腔內

12、注射醋酸導致 的扭體反響顯著減少。TRPV1是一種依賴鈣離子的非選擇性陽離子通道，可以被辣椒素、質子、陽 離子、傷害性溫度刺激和包括脂質代謝產物在內的內源性配體直接激活。 在包括 內皮素和緩激肽在內的“炎癥池物質聯合作用下，可以降低TRPV1的激活閾值。從小靜脈注射丙泊酚時 , 經常導致注射痛 , 緩激肽和前列腺素在其中發揮重要的作用。對大鼠背根神經節感覺神經元使用較大劑量的TRPV1沖動劑導致TRPV1的敏感性下降,而丙泊酚可以通過PKG和TRPA1途徑使其敏感性恢復。在基因敲除B1和B2的小鼠中,醋酸導致的內臟傷害反響大約減少 70%可 見，丙泊酚也許是通過敏化TRPV1增強了醋酸的傷害作

13、用。然而,很難解釋相同劑量的丙泊酚會減弱辣椒素的傷害反響。 一些研究證實, 全身注射大劑量的丙泊酚在導致正常反射消失外 , 還會產生止痛作用 , 而全身注 射亞催眠劑量的丙泊酚會產生致痛作用。腹腔內注射亞催眠劑量的丙泊酚 ,或者側腦室和中腦導水管周圍灰質腹外側 區注射微量的丙泊酚會產生顯著的致痛作用 , 這一結論已通過清醒大鼠的熱板痛 覺實驗和福爾馬林實驗所證實 , 而椎管內注射丙泊酚顯示出良好的止痛作用。因 此, 人們認為丙泊酚通過脊髓上機制產生致痛作用。途徑完成的熱板痛覺試驗說明 , 小鼠腹腔內注射丙泊酚產生抗傷害作用 , 而醋酸導致的 小鼠扭體反響是通過 N-甲基-D-天冬氨酸(N-me

14、thyl-D-aspartic acid, NMDA) 和 a -氨基-3-羥基-5-甲基4 異惡唑丙酸(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid, AMPA) 聯合注射丙泊酚可以抑制蜂毒導致的疼痛反響。綜上所述, 丙泊酚使用的劑量和途徑決定了產生止痛作用還是致痛作用。與 之前的研究不同 ,我們的研究發現 , 腹腔內聯合注射相同劑量的丙泊酚同時表現 出致痛作用和止痛作用。它增加了醋酸和硫酸鎂導致的扭體反響 , 同時也降低了辣椒素導致的傷害時 間。我們的研究顯示 ,經過辣椒素處理的新生小鼠 , 成年后聯合注射丙泊酚和醋酸 的扭體反響

15、減少，與丙泊酚的TRPV1 乍用有關。丙泊酚鼻內輸注導致的疼痛反響和動脈內注射導致的屈肌反射都是由TRPA價導的。只有表達TRPA1的神經元，丙泊酚才能引起內向電流，而對于轉染 了 TRPV啲HEK293細胞，丙泊酚并不能引起內向電流。有研究說明，丙泊酚不能改變辣椒素和TRPV1的結合反響。然而,另一個研究 證明,丙泊酚使轉染了 Wistar大鼠TRPVIcDNA勺HEK29細胞內鈣離子濃度升高。對于轉染了人TRPV1 cDNA勺HEK293細胞,聯合使用辣椒素和丙泊酚的內向 電流反而比單獨使用辣椒素的內向電流小。 這些研究都說明丙泊酚和TRPV1之間 有著功能上的關聯。某些沖動劑直接與TRPV1結合的同時，也起到強化介質的作用。例如,輕微的 酸性環境能降低TRPV1的溫度閾值并增強熱刺激和辣椒素導致的電流。雞的TRPV1對辣椒素不敏感,但是高濃度的辣椒素可以增強質子激發的電流。 當不同物質對同一受體的結合位點有重合時 , 會導致競爭性拮抗 , 例如, 陽離子和 質子都作用于TRPV1上的E600和E648區域。鎂離子在1-10mM的環境下敏化TRPV1在 5-10mM勺環境下阻止了 TRPV1與 質子的反響。丙泊酚可能在細胞膜內和 TRPV1發生作用,或者與TRPV1穿越脂質雙