1、最成功的基因工程藥物最成功的基因工程藥物 EPO 主要內容主要內容什么是什么是EPO? 主要用途主要用途 如何生產如何生產國內外現狀國內外現狀什么是什么是EPO? EPO是促紅細胞生成素（是促紅細胞生成素（Erythropoietin）的英文簡稱。）的英文簡稱。 人體中的人體中的EPO（促紅細胞生成素）是由腎臟和肝臟分泌的一種（促紅細胞生成素）是由腎臟和肝臟分泌的一種激素物質，能夠促進紅細胞生成。服用紅細胞生成素可以使患腎病激素物質，能夠促進紅細胞生成。服用紅細胞生成素可以使患腎病貧血的病人增加貧血的病人增加血流比溶度血流比溶度（即增加血液中紅細胞百分比）。這種（即增加血液中紅細胞百分比）。這

2、種藥物近年進入商業市場。人體缺氧時，此種激素生成增加，并導致藥物近年進入商業市場。人體缺氧時，此種激素生成增加，并導致紅細胞增生。紅細胞增生。 EPO興奮劑正是根據促紅細胞生成素的原理人工合成，它能興奮劑正是根據促紅細胞生成素的原理人工合成，它能促進肌肉中氧氣生成，從而使肌肉更有勁、工作時間更長。促進肌肉中氧氣生成，從而使肌肉更有勁、工作時間更長。 增加紅血球的數目，用于增加紅血球的數目，用于貧血、組織斷離、貧血、組織斷離、早產兒，用在癌學和血液學方面早產兒，用在癌學和血液學方面。用于治療慢。用于治療慢性腎衰患者的貧血癥。治療最初性腎衰患者的貧血癥。治療最初13周觀察到周觀察到血細胞比容增加，

3、且與劑量成比例，在血細胞比容增加，且與劑量成比例，在46周周中血細胞比容水平在不同研究中可達中血細胞比容水平在不同研究中可達30%40%之間不等，患者的生活質量提高，包括體之間不等，患者的生活質量提高，包括體力耐受、情緒、起居方式和性功能的提高。對力耐受、情緒、起居方式和性功能的提高。對慢性腎衰不需要透析的貧血患者的研究表明，慢性腎衰不需要透析的貧血患者的研究表明，使用本品也是有利的。使用本品也是有利的。醫療用途醫療用途 增加訓練耐力和訓練負荷，屬于國際奧委會規定的增加訓練耐力和訓練負荷，屬于國際奧委會規定的違禁藥物違禁藥物。在在2008年北京奧運會中第一例的興奮劑檢查呈陽性的西班牙自行車年北

4、京奧運會中第一例的興奮劑檢查呈陽性的西班牙自行車選手瑪麗亞選手瑪麗亞莫里諾，就是被發現使用使用促紅細胞生成素莫里諾，就是被發現使用使用促紅細胞生成素(EPO)，國際奧委會于國際奧委會于2008年年8月月11日宣布取消其參賽資格。日宣布取消其參賽資格。體育用途體育用途EPO發展歷程發展歷程 如何生產？如何生產？方法一：方法一：用基因重組法用基因重組法生產紅細胞生成素生產紅細胞生成素(EP O) 19851985年科學家應用基因年科學家應用基因重組技術，在實驗室獲得重組重組技術，在實驗室獲得重組人人EPOEPO（rhEPOrhEPO）。）。 以小以小 鼠鼠L L一一92 9 92 9 細細 胞為宿

5、主胞為宿主 , , 使使 用病毒用病毒S vS v一一40 40 中組中組 入了入了E P O E P O 基基 因因 的的載載 體體 時時,80 % ,80 % 的的 轉化細胞能轉化細胞能產生產生EPO , EPO , 多代多代 培養后培養后 產生產生 能力仍穩能力仍穩 定定 目前國內外均采用目前國內外均采用CHOCHO細胞細胞( (中國倉鼠卵巢細胞中國倉鼠卵巢細胞) )表達生表達生產產 Epo , Epo ,但是細胞但是細胞表達的成本比較昂貴表達的成本比較昂貴, , 而用而用轉基因動物轉基因動物生產生產 Epo Epo , ,可能是一條十分理想的途徑。我們將構建的可能是一條十分理想的途徑。

6、我們將構建的 pGEM-7zf(+) -LG-Epo pGEM-7zf(+) -LG-Epo 表達載體轉基因小鼠表達載體轉基因小鼠, ,經經PCR PCR 擴增擴增, , 斑點雜交和斑點雜交和 Southern Southern 雜交檢測證實雜交檢測證實, ,有有4 4只轉基因陽性小只轉基因陽性小鼠。其中鼠。其中3 3只母鼠在哺乳期只母鼠在哺乳期 , ,采集乳汁采集乳汁 , ,用用Epo-ELISA Epo-ELISA 檢測檢測為陽性。又從部分為陽性。又從部分G1G1代母鼠中篩出代母鼠中篩出 6 6 只獲得遺傳的小鼠只獲得遺傳的小鼠 , ,經經 Dot-ELISA Dot-ELISA 檢測檢測

7、 , ,其中兩只母鼠乳汁中其中兩只母鼠乳汁中Epo Epo 含量為含量為0.5g/mL0.5g/mL。實驗證實。實驗證實,867bp,867bp的山羊的山羊-LG -LG 啟動子可以指導啟動子可以指導外源基因在轉基因小鼠乳汁中表達外源基因在轉基因小鼠乳汁中表達 。方法二：轉基因動物生產方法二：轉基因動物生產 Epo 采用噬菌體表面表達和重組抗體技術，從已建立的鼠抗采用噬菌體表面表達和重組抗體技術，從已建立的鼠抗rhEPO rhEPO 雜交瘤細胞株雜交瘤細胞株D3D3中克隆出抗中克隆出抗rhEPOrhEPO單鏈抗體單鏈抗體ScFvScFv基因片段，基因片段，經噬菌體表面呈現，與固經噬菌體表面呈現

8、，與固 相抗原相抗原rhEPOrhEPO結合，結合，“吸附吸附洗脫洗脫富富集集”，酶聯免疫吸附法，酶聯免疫吸附法(ELISA)(ELISA)檢測，酶切鑒定檢測，酶切鑒定 及及PCRPCR擴增鑒定，擴增鑒定，將陽性克隆重組質粒轉化非抑制型將陽性克隆重組質粒轉化非抑制型E.coli HB2151,E.coli HB2151,誘導表達抗誘導表達抗rhEPO rhEPO 單鏈抗體，單鏈抗體，Western blotWestern blot和和Dot-blotDot-blot雜交檢測其抗原特異雜交檢測其抗原特異性。最后對陽性克隆進行序列測性。最后對陽性克隆進行序列測 定，進行序列分析。結果挑定，進行序列

9、分析。結果挑選出了噬菌體表面表達抗選出了噬菌體表面表達抗rhEPOrhEPO單鏈抗體的陽性克隆，單鏈抗體的陽性克隆， 可溶性表可溶性表達的單鏈抗體主要分布于細菌培養上清中，并且保留了親本單抗達的單鏈抗體主要分布于細菌培養上清中，并且保留了親本單抗對對rhEPOrhEPO的的 抗原特異性和免疫活性。表達產物分子量約為抗原特異性和免疫活性。表達產物分子量約為32kD32kD左左右。結論本實驗成功地獲得了右。結論本實驗成功地獲得了 抗抗rhEPOrhEPO抗體的可變區抗體的可變區VHVH、VLVL基基因，并表達出單鏈抗體因，并表達出單鏈抗體ScFvScFv片段。片段。方法三：采用噬菌體表面表達和重組

10、抗體技術方法三：采用噬菌體表面表達和重組抗體技術 1989年安進（年安進（Amgen）公司的第一個基因重組藥物）公司的第一個基因重組藥物Epogen獲得獲得FDA的批準，的批準，適應癥為慢性腎功能衰竭導致的貧血、惡性腫瘤或化療導致的貧血、失血后貧血適應癥為慢性腎功能衰竭導致的貧血、惡性腫瘤或化療導致的貧血、失血后貧血等，其市場表現不俗，等，其市場表現不俗，1999年銷售值達到年銷售值達到17.6億美元，億美元，2000年年19.6億美元，億美元，2002年年22.6億美元，億美元，2003年年24.4億美元，成為名副其實的億美元，成為名副其實的“重磅炸彈重磅炸彈”基因藥物。基因藥物。國外市場國

11、外市場 用于治療惡性貧血癥的用于治療惡性貧血癥的第二代促紅細胞生成素新產品第二代促紅細胞生成素新產品Arnesp2001年得到年得到FDA的的批準，批準，Arnesp2002年初正式上市。年初正式上市。Arnesp是一種是一種“高糖基化高糖基化”促紅素產品，其促促紅素產品，其促進紅細胞生成的能力大大優于第一代進紅細胞生成的能力大大優于第一代EPO（促紅細胞生成素）產品。第一年上市即（促紅細胞生成素）產品。第一年上市即大獲全勝，贏得開們紅，大獲全勝，贏得開們紅，Aranesp2002年全年銷售額為年全年銷售額為4.2億美元，億美元，2003年全年銷售年全年銷售額為額為15.4億美元。估計在今后億美元。估計在今后3年內，年內，Arnesp將創造將創造10億億15億美元的市場銷售額并億美元的市場銷售額并奪取現有奪取現有EPO生產商的部分市場，其市場前景不可估量。生產商的部分市場，其市場前景不可估量。 2001年，年，EPO（包括（包括Arnesp）的全球銷售額達）的全球銷售額達21.1億美元，億美元，2002年達年達26.8億美億美元，元，2003年全世界年全世界EPO的年銷售額超過的年銷售額超過50億美元。創下生物工程藥品單個品種