1、第六章第六章 基因與載體銜接基因與載體銜接 一、黏性末端與平末端的銜接一、黏性末端與平末端的銜接 二、其他銜接方法二、其他銜接方法 一、黏性末端與平末端的銜接一、黏性末端與平末端的銜接一黏性末端一黏性末端DNA分子間的銜接分子間的銜接DNA銜接酶把相銜接酶把相互接近的互接近的5端端磷酸與磷酸與3-OH連到一同。連到一同。 1. 兩段兩段DNA的銜接的銜接 依托粘性末端依托粘性末端依托粘性末端依托粘性末端2. DNA片斷片斷與載體的銜與載體的銜接接nickligase3.4 . 粘性末端的改換粘性末端的改換 在在DNA片段上某一酶切口處換成另一種酶切口片段上某一酶切口處換成另一種酶切口二二) 平

2、末端平末端blunt end的銜接的銜接5端與端與3端并列接近的時間太短，不端并列接近的時間太短，不容易被銜接酶銜接。容易被銜接酶銜接。1. 直接銜接直接銜接T4DNA銜接酶雖然能銜接平末端，但銜接酶雖然能銜接平末端，但效率很低，只需粘性末端的效率很低，只需粘性末端的1%。5 5 5 5 3 3 3 3 -OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3 -OH-PP-HO-5 3 1972年，斯坦福大學(xué)的年，斯坦福大學(xué)的P. Labban和和P. Kaiser提出。提出。1同聚物加尾同聚物加尾 法法 2. 人工加尾構(gòu)成人工加尾構(gòu)成 “粘性末端粘性末端 DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下末端轉(zhuǎn)移

3、酶能在沒有模板的情況下給給DNA的的3-OH端加上脫氧核苷酸。端加上脫氧核苷酸。原理：原理：分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。加尾加尾堿基互補(bǔ)堿基互補(bǔ)缺陷：缺陷：優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：能把任何能把任何片段銜接片段銜接起來起來不能把不能把插入片插入片段再切段再切下來。下來。非酶切位點(diǎn)非酶切位點(diǎn)5突出的末端 外源片段先用Klenow補(bǔ)平；然后用TdT補(bǔ)加polyC；載體片段也用Klenow補(bǔ)平，加polyG，退火不經(jīng)銜接即可轉(zhuǎn)化。目的是：不使酶切位點(diǎn)蒙受破壞。 5 3 3 5 5 3 3 5 外源基因載體TdTployCTdTployGKlenow補(bǔ)3平端5 5 5

4、 5 CCCCCCCCCCGGGGGGGGGG退火用用T4 DNA銜接酶連到平端銜接酶連到平端DNA上，然上，然后再用酶切，構(gòu)成一個人工粘性末端。后再用酶切，構(gòu)成一個人工粘性末端。2銜接物銜接物(linker)銜接銜接 linker用化學(xué)合成法合成的一段用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限的特定限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。GGAATTCC CCTTAAGGEcoRI linker： linker的作用的作用 缺陷：缺陷：1可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。假設(shè)插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能假設(shè)插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，

5、不能切下完好的插入片段切下完好的插入片段2能給載體銜接上能給載體銜接上Polylinker:優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：3DNA接頭接頭 (adapter)銜接法銜接法1978年康內(nèi)爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。年康內(nèi)爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p 5 BamH I adapter用用T4 DNA銜接酶連到銜接酶連到DNA分子的分子的兩端，直接成為人工粘性末端。兩端，直接成為人工粘性末端。 adapter一頭平末端、另一頭粘性末端某種酶一頭平末端、另一頭粘性末端某種酶切位點(diǎn)序列。切位點(diǎn)序列。 adapter的作用的作用Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 H

6、O-GGCC-p5 BamH I adapterP-P5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG -GGCCCTAG-P5 5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5 接頭自我銜接接頭自我銜接接頭與接頭會彼此以粘性末端接在一同，接頭與接頭會彼此以粘性末端接在一同，影響與影響與DNA片段的銜接。片段的銜接。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。連上后就能用。缺陷：缺陷：先用小牛腸堿性磷酸酶先用小牛腸堿性磷酸酶CIP處置接頭，處置接頭，水解掉其水解掉其5端的磷酸，防止自我銜接。端的磷酸，防止自我銜接。 以后再用以后再用

7、T4多核苷酸激酶加上磷酸。多核苷酸激酶加上磷酸。防止自我銜接防止自我銜接5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5 接頭之間不能構(gòu)成磷酸二酯鍵的自我銜接！接頭之間不能構(gòu)成磷酸二酯鍵的自我銜接！ 5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5 CIP處置處置-OHHO-Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamH I adapterP-P 5GATCCCGG- HO-GGCC CCGG-O

8、H -GGCCCTAG5 5GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5 缺口缺口缺口缺口HO-OHCIP處置處置T4 ligase雖然有缺口，但依然能與雖然有缺口，但依然能與DNADNA片斷銜接。片斷銜接。一一PCR產(chǎn)物的銜接產(chǎn)物的銜接1. 在引物的在引物的5端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)(MCS)；1設(shè)計(jì)原那么設(shè)計(jì)原那么防止與所擴(kuò)增的防止與所擴(kuò)增的DNADNA片斷內(nèi)部酶切位點(diǎn)反復(fù)。片斷內(nèi)部酶切位點(diǎn)反復(fù)。二、其他銜接方式二、其他銜接方式2帶酶切位點(diǎn)的引物構(gòu)造帶酶切位點(diǎn)的引物構(gòu)造3端端1520bp與模板互補(bǔ)；與模板互補(bǔ)； 5端端610bp是某個內(nèi)切酶的識別序

9、列。是某個內(nèi)切酶的識別序列。5端多余的端多余的35bp屬維護(hù)堿基屬維護(hù)堿基引物引物1GCAGAATTC 互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列模板模板EcoRI位點(diǎn)位點(diǎn)5-3 GCAGAATTC 互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列5-3 3 模板模板GCAGAATTC 互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列 PCR產(chǎn)物產(chǎn)物5-3 3 復(fù)性復(fù)性延伸延伸模板模板模板模板3 3 GCTAGCCGG 互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列模板模板BamH I 位點(diǎn)位點(diǎn)-5 3- 5 復(fù)性復(fù)性延伸延伸模板模板模板模板3 3 GCTAGCCGG 互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列-5 3-模板模板5 GCTAGCCGG PCR產(chǎn)物產(chǎn)物 互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列-5 3-引物引物2帶酶切位點(diǎn)的帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物

10、產(chǎn)物GCAGAATTC PCR產(chǎn)物產(chǎn)物5-3 GCTAGCCGG PCR產(chǎn)物產(chǎn)物-5 3- CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點(diǎn)位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)位點(diǎn)AATTC PCR產(chǎn)物產(chǎn)物5-3 GCTAG PCR產(chǎn)物產(chǎn)物-5 3- GCEcoRI BamHI兩頭各有一個粘性末端！兩頭各有一個粘性末端！2. 與與T載體直接銜接載體直接銜接1PCR產(chǎn)物兩個產(chǎn)物兩個3端普通都有一個端普通都有一個ATaq DNA聚合酶的特性：在聚合酶的特性：在DNA雙雙鏈的鏈的3端再加上一個多余的核苷酸端再加上一個多余的核苷酸優(yōu)先加優(yōu)先加A。2T載體的兩個載體的兩個3端人為地各加一個端人為地各加一個T利用利用Ta

11、q DNA聚合酶，當(dāng)原料中只聚合酶，當(dāng)原料中只需需dTTP時，被迫在平端載體上添加時，被迫在平端載體上添加T！AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶聚合酶載體載體PCR產(chǎn)物產(chǎn)物TATA二二DNA體外銜接應(yīng)留意的事項(xiàng)體外銜接應(yīng)留意的事項(xiàng) 插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)一樣的粘性末端才干有效地銜接一樣的粘性末端才干有效地銜接盡量防止平端銜接盡量防止平端銜接決不能進(jìn)展非粘性末端銜接決不能進(jìn)展非粘性末端銜接1用一樣的酶切用一樣的酶切2用同尾酶切用同尾酶切BamH I、Bcl I、Bgl II、Sau3A I、XhoII都產(chǎn)生都產(chǎn)生GATC4個堿基的粘性末端。個堿基的粘性

12、末端。2. DNA插入的方向正確插入的方向正確1用雙酶切用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向銜接。固定方向銜接。EcoR IBamH IEcoR IBamH IEcoR IBamH I 3. 插入基因的開放閱讀框插入基因的開放閱讀框ORF正確正確1DNA定向插入定向插入2起始密碼起始密碼要留意載體上有要留意載體上有ATG起始密碼時起始密碼時ATGGAATTC載體載體ATGCGGAATTCT插入片斷插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTC T重組重組但移碼突變！但移碼突變！4. 防止載體本身環(huán)化銜接防止載體本身環(huán)化銜接1提高插入片斷的用量提高插入片斷的用量銜接反響體系中，插入片斷比載體多銜接反響體系中，插入片斷比載體多10倍以上。倍以上。2用堿性磷酸酶處置載體用堿性磷酸酶處置載體載體切口的載體切口的5磷酸被除去，不能自我磷酸被除去，不能自我銜接。但可以與插入片斷以單鏈銜接。銜接。但可以與插入片斷以單鏈銜接。5 3 載體載體插入片斷插入片斷三三 載體和外源載體和外源DNA插入片段的銜接結(jié)果插入片段的銜接結(jié)果三、重組率三、重組率 較為理想的重