1、2021/6/161 急性毒性試驗方法急性毒性試驗方法 2021/6/162 一、急性毒性一、急性毒性 急性毒性指人或動物急性毒性指人或動物一次一次或或24 h 之內之內多次多次接觸外源化學物后，在短接觸外源化學物后，在短 期內所發生的毒性效應，包括致死期內所發生的毒性效應，包括致死 效應。效應。 2021/6/163 一次：指瞬間給實驗動物染毒，如經一次：指瞬間給實驗動物染毒，如經 口、經靜脈注射染毒。口、經靜脈注射染毒。 24 h之內多次：指外源化學物毒性過之內多次：指外源化學物毒性過 低，需給予動物較大劑量。低，需給予動物較大劑量。 2021/6/164 急性毒性效應出現的快慢和毒性反應

2、的強急性毒性效應出現的快慢和毒性反應的強 度與外源化學物的度與外源化學物的性質性質和染毒劑量的大小和染毒劑量的大小 有關。有關。 如：丙烯腈，過氧化二碳酸二環己酯如：丙烯腈，過氧化二碳酸二環己酯 2021/6/165 急性毒性試驗目的 n了解外源化學物急性毒性的強度，求出了解外源化學物急性毒性的強度，求出LD50 n了解外源化學物毒作用的性質、毒效應的特征了解外源化學物毒作用的性質、毒效應的特征 及可能的靶器官，初步評價外源化學物的危險及可能的靶器官，初步評價外源化學物的危險 性。性。 n探求外源化學物的劑量探求外源化學物的劑量-反應（效應）關系，反應（效應）關系， 為亞慢性毒性、蓄積毒性和慢

3、性毒性及特殊毒為亞慢性毒性、蓄積毒性和慢性毒性及特殊毒 性試驗染毒性試驗染毒劑量的設計和觀察指標的選擇提供劑量的設計和觀察指標的選擇提供 參考。參考。 n初步了解動物致死的原因，為研究毒作用的機初步了解動物致死的原因，為研究毒作用的機 制提供線索，進而為制定中毒急救治療措施提制提供線索，進而為制定中毒急救治療措施提 供依據供依據。 2021/6/166 由急性毒性試驗可得到兩類毒性參數由急性毒性試驗可得到兩類毒性參數 l上限參數上限參數 是以死亡為終點的毒性，包是以死亡為終點的毒性，包 括絕對致死量、半數致死量、最小致括絕對致死量、半數致死量、最小致 死量、最大耐受量等；死量、最大耐受量等；

4、l下限參數下限參數 是以非致死性急性毒作用是以非致死性急性毒作用 為終點的毒性，包括急性閾劑量和無為終點的毒性，包括急性閾劑量和無 作用劑量等。作用劑量等。 2021/6/167 用小動物試驗可求出外源化學物對一種或幾種用小動物試驗可求出外源化學物對一種或幾種 實驗動物的急性實驗動物的急性LD50或或LC50; 用 大 動 物 試 驗 可 求 出用 大 動 物 試 驗 可 求 出 近 似 致 死 劑 量近 似 致 死 劑 量 （approximate lethal dose, ALD）; 根據根據LD50（LC50）值可進行急性毒性分級，以）值可進行急性毒性分級，以 初步評價外源化學物對機體急

5、性毒性大小和急初步評價外源化學物對機體急性毒性大小和急 性毒作用的強度。性毒作用的強度。 2021/6/168 急性毒性試驗項目急性毒性試驗項目 n急性半數致死量測定急性半數致死量測定 n半數耐受限量測定半數耐受限量測定 n7d喂養試驗喂養試驗 n其他：近似致死量試驗、其他：近似致死量試驗、固定劑量法、固定劑量法、 急性毒性分級法、階梯法、金字塔法、急性毒性分級法、階梯法、金字塔法、 限量試驗、急性系統毒性試驗等限量試驗、急性系統毒性試驗等。 2021/6/169 急性毒性試驗設計急性毒性試驗設計 實驗動物選擇實驗動物選擇 品種品種 品系品系 個體個體 性別性別 年齡年齡 體重體重 生理病理狀

6、況生理病理狀況 對外源化學物毒性反應與人近似；對外源化學物毒性反應與人近似； 易于飼養管理，方便實驗操作；易于飼養管理，方便實驗操作； 易于獲得，品系純化，價格低廉。易于獲得，品系純化，價格低廉。 原則原則 2021/6/1610 實驗動物的年齡與體重的關系實驗動物的年齡與體重的關系 動動 物物 大鼠大鼠 小鼠小鼠 豚鼠豚鼠 兔兔 犬犬 貓貓 成年年齡（周）成年年齡（周） 3 2 2 34 34 34 體重（克）體重（克） 150 15 250 1.5kg 715kg 1kg 壽命（年）壽命（年） 23 23 68 49 1520 1012 2021/6/1611 急性急性毒性試驗的動物體重毒

7、性試驗的動物體重 n大鼠大鼠 120150 n小鼠小鼠 1822 n豚鼠豚鼠 200250 n家兔家兔 22.5 kg n犬犬 1015kg（成年）（成年） n變異范圍不得超過所用動物平均體變異范圍不得超過所用動物平均體 重的重的10。 2021/6/1612 急性急性毒性試驗的動物要求毒性試驗的動物要求 n動物數量：小動物動物數量：小動物46組，每組至組，每組至 少少10只；犬等大動物每組只；犬等大動物每組6只。只。 n性別：雌雄各半，也有例外，如，性別：雌雄各半，也有例外，如， 致畸試驗的劑量準備，只作雌性動致畸試驗的劑量準備，只作雌性動 物物LD50。 n年齡：剛成年，未曾受孕、交配年齡

8、：剛成年，未曾受孕、交配 2021/6/1613 實驗實驗動物的標記動物的標記 染色法染色法 耳緣孔口法耳緣孔口法 烙印法烙印法 掛牌法掛牌法 2021/6/1614 染色法染色法 用不同顏色的染料涂擦于動物不同部位來用不同顏色的染料涂擦于動物不同部位來 表示不同號碼，適用于大鼠、小鼠和豚鼠。表示不同號碼，適用于大鼠、小鼠和豚鼠。 常用染料：常用染料： 35苦味酸酒精飽和液，呈黃色；苦味酸酒精飽和液，呈黃色； 甲基紫酒精飽和液，呈紫色；甲基紫酒精飽和液，呈紫色； 0.5中性紅或品紅溶液，呈紅色等。中性紅或品紅溶液，呈紅色等。 2021/6/1615 實驗實驗動物的標記動物的標記 方法一：方法一

9、： 按右前肢、右肋、右后肢、頸部、背中、尾根、左按右前肢、右肋、右后肢、頸部、背中、尾根、左 前肢、左肋、左后肢，順序編號為前肢、左肋、左后肢，順序編號為19號，不染色號，不染色 為為10號。在動物相同部位涂染另一種顏色染料表示號。在動物相同部位涂染另一種顏色染料表示 十位，兩種顏色可編十位，兩種顏色可編199號。號。 方法二：方法二： 以頭部為以頭部為1號，順時針方向依次從右耳、右前肢、右號，順時針方向依次從右耳、右前肢、右 后肢、頸部、背中、尾根、左耳、左前肢、左后肢后肢、頸部、背中、尾根、左耳、左前肢、左后肢 染色，分別為染色，分別為210號。號。 6 2021/6/1616 2021/

10、6/1617 染色法染色法 優點：優點： 簡單方便，不痛苦，無損傷。簡單方便，不痛苦，無損傷。 缺點：缺點： 時間較長時，染色劑易褪色；時間較長時，染色劑易褪色； 標記容易模糊不清。標記容易模糊不清。 2021/6/1618 耳緣孔口法：耳緣孔口法： 在耳緣先用針穿孔和用剪刀剪口，再用酒精墨在耳緣先用針穿孔和用剪刀剪口，再用酒精墨 汁涂抹，使黑色滲入孔口，傷口愈合后不易脫汁涂抹，使黑色滲入孔口，傷口愈合后不易脫 落，這種標號亦可標號。落，這種標號亦可標號。 適用于大、小鼠。適用于大、小鼠。 2021/6/1619 烙印法：烙印法： 將鑄鐵號碼加熱后，在動物體表部位燒烙，以將鑄鐵號碼加熱后，在動

11、物體表部位燒烙，以 破壞毛囊，留下印記。適用于大動物。破壞毛囊，留下印記。適用于大動物。 掛牌法：掛牌法： 用金屬或塑料制成號牌，固定在動物的耳部或用金屬或塑料制成號牌，固定在動物的耳部或 系于其頸部。適用于較大動物。系于其頸部。適用于較大動物。 2021/6/1620 實驗動物分組實驗動物分組 目的：目的：減少個體差異對實驗結果的影響；減少個體差異對實驗結果的影響； 原則：按統計學原則隨機分組，使非處理原則：按統計學原則隨機分組，使非處理 因素最大限度地保持一致，提高每組實驗因素最大限度地保持一致，提高每組實驗 動物間的均衡性。動物間的均衡性。 常用方法：常用方法：完全隨機完全隨機和和隨機區

12、組隨機區組 2021/6/1621 完全隨機設計完全隨機設計 將實驗動物編號，從隨機數字表上任意橫將實驗動物編號，從隨機數字表上任意橫 行或縱行的任意數字開始，順序取下數字，行或縱行的任意數字開始，順序取下數字， 標于每個動物號下，然后用計劃組數去除標于每個動物號下，然后用計劃組數去除 隨機數字，所得余數即為所屬組別。如將隨機數字，所得余數即為所屬組別。如將 只動物分為組，從隨機數字表的第只動物分為組，從隨機數字表的第 行開始，順序取個數字，用除行開始，順序取個數字，用除 的余數即為組別。的余數即為組別。 2021/6/1622 20只動物的完全隨機分配只動物的完全隨機分配 2021/6/16

13、23 完全隨機分配后各組所屬動物號完全隨機分配后各組所屬動物號 2021/6/1624 20只動物完全隨機分配的結果 2021/6/1625 20只動物的完全隨機分配只動物的完全隨機分配 動物編號動物編號1234567891011121314151617181920 隨即數字隨即數字5483805390755378934772095466954468676786 除除4后余數后余數23012312130122300332 所屬組別所屬組別二二三三四四一一二二三三一一二二 一一三三四四一一二二二二三三四四四四三三三三二二 2021/6/1626 完全隨機分配后各組所屬動物號完全隨機分配后各組所屬

14、動物號 組別組別動物編號動物編號 一一47912 二二1581320 14 三三26101518 19 四四3111617 2021/6/1627 20只動物完全隨機分配的結果 組別組別動物編號動物編號 一一4791219 二二1581314 三三2 6101518 四四311161720 2021/6/1628 隨機區組設計隨機區組設計 將動物稱重，按體重順序依次排列編號，分成若將動物稱重，按體重順序依次排列編號，分成若 干個區組，每一區組的動物體重相近，每一區組干個區組，每一區組的動物體重相近，每一區組 的動物數即為組數。再從隨機數字表上任意抄下的動物數即為組數。再從隨機數字表上任意抄下

15、隨機數字，依次標在每個動物的編號下，如欲將隨機數字，依次標在每個動物的編號下，如欲將 動物分為組，則將每一區組動物編號下的隨機動物分為組，則將每一區組動物編號下的隨機 數字，按順序分別用、除之，根據數字，按順序分別用、除之，根據 余數大小將動物分入各組。余數大小將動物分入各組。 2021/6/1629 原則是余數即為所屬組別，余數原則是余數即為所屬組別，余數0屬最后一組。當同一區屬最后一組。當同一區 組中有相同余數時，非組中有相同余數時，非0余數按順序分配至未分配動物的余數按順序分配至未分配動物的 首位組，而首位組，而0余數則按順序分配至未分配動物的末尾組。余數則按順序分配至未分配動物的末尾組

16、。 如下表第一區組中，第一個余數是如下表第一區組中，第一個余數是0，將，將1號大鼠分到第號大鼠分到第 4組；第組；第2個余數為個余數為1，2號大鼠分到第號大鼠分到第1組；第組；第3個余數仍個余數仍 為為1，未分配動物的第，未分配動物的第2組居首位，故將組居首位，故將3號大鼠分到第號大鼠分到第2 組；余下組；余下4號大鼠則分到第號大鼠則分到第3組。組。 優點：各組的動物數目相等，動物平均體重相近，可以優點：各組的動物數目相等，動物平均體重相近，可以 減少實驗誤差；動物數目較多時比完全隨機法快。減少實驗誤差；動物數目較多時比完全隨機法快。 2021/6/1630 20只小鼠按隨機區組設計分組表 2

17、021/6/1631 隨機分配到各組的動物 2021/6/1632 劑量選擇及分組 n劑量選擇劑量選擇 廣泛查閱文獻資料，估計毒性中值廣泛查閱文獻資料，估計毒性中值 預試，求出待測化學物預試，求出待測化學物0 %100 %或或 10 %90 %的大致致死劑量范圍的大致致死劑量范圍 設計正式試驗的劑量和分組設計正式試驗的劑量和分組 2021/6/1633 劑量分組劑量分組 ilgLD100-lgLD0/n-1 或或ilgLD90-lgLD10/n-1 n：設計的劑量組數：設計的劑量組數 i：組距，相鄰兩個劑量組對數劑量：組距，相鄰兩個劑量組對數劑量 之差之差 2021/6/1634 受試物的配制

18、受試物的配制 n溶劑的選擇溶劑的選擇 n配制方法配制方法 n等容量稀釋等容量稀釋 n等濃度稀釋等濃度稀釋 2021/6/1635 受試物的配制受試物的配制 等容量稀釋：等容量稀釋： 要求不同劑量組實驗動物單位體重所要求不同劑量組實驗動物單位體重所 給受試物的體積相同時，就將受試物給受試物的體積相同時，就將受試物 配成不同濃度。等比稀釋法（配成不同濃度。等比稀釋法（1：k） 等濃度稀釋：等濃度稀釋： 將受試化學物配成一種濃度，不同劑將受試化學物配成一種濃度，不同劑 量組實驗動物單位體重所給受試化學量組實驗動物單位體重所給受試化學 物的體積不同。物的體積不同。 2021/6/1636 試驗期限及觀

19、察指標 n觀察期限為觀察期限為714d n求求LD50時，目前國內外一般要求計算實驗動時，目前國內外一般要求計算實驗動 物接觸外源化學物后物接觸外源化學物后14 d內的總死亡數內的總死亡數 n對于速發性死亡的化學物也可只計算對于速發性死亡的化學物也可只計算24 h的的 死亡數，如久效磷死亡數，如久效磷24 h與與14 d的的LD50沒有差沒有差 別別 2021/6/1637 觀察指標觀察指標 n中毒癥狀：確定靶器官中毒癥狀：確定靶器官 行動：不安定、多動、發聲；行動：不安定、多動、發聲； 神經系統反應：舉尾、振顫、痙攣、運動失神經系統反應：舉尾、振顫、痙攣、運動失 調、姿態異常；調、姿態異常；

20、 自主神經系統反應：眼球突出、流涎、流淚、自主神經系統反應：眼球突出、流涎、流淚、 排尿、下瀉、豎毛、皮膚變色、呼吸。排尿、下瀉、豎毛、皮膚變色、呼吸。 n體重：隔日測量體重：隔日測量 n死亡和死亡時間死亡和死亡時間 n病理學檢查及其他指標病理學檢查及其他指標 2021/6/1638 LD50的計算的計算 nLD50測定是以動物死活為指標的質反應，當測定是以動物死活為指標的質反應，當 死亡呈正態分配時，一般具有以下特點：死亡呈正態分配時，一般具有以下特點： n劑量對數值與動物死亡頻數之間為正態分劑量對數值與動物死亡頻數之間為正態分 布曲線關系；布曲線關系； n劑量對數值與死亡率之間為正劑量對數

21、值與死亡率之間為正“S”型曲線；型曲線； n從實驗數據可計算從實驗數據可計算LD50以外的其它信息。以外的其它信息。 2021/6/1639 對數劑量劑量 曲線：中間高、 兩側低，右側 延長較遠 正態曲線 中 點 中 點 2021/6/1640 n計算計算LD50的常用方法的常用方法: n概率單位法概率單位法 nBliss法法 n改良寇氏（改良寇氏（Krber）法等）法等 2021/6/1641 LD50的計算公式的計算公式 2021/6/1642 校正公式校正公式 2021/6/1643 LD50的標準誤的標準誤 2021/6/1644 LD50 的的95 %可信限可信限 LD50 的的95

22、 %可信限可信限 =log-1(log LD501.96Sx50) 2021/6/1645 n i組距，即相鄰兩組劑量對數劑量之差組距，即相鄰兩組劑量對數劑量之差 nXm最大劑量對數最大劑量對數 nP各劑量組死亡率各劑量組死亡率(死亡率均用小數表示死亡率均用小數表示) nPm最高死亡率最高死亡率 nq各劑量組存活率，各劑量組存活率，q=1-p nPn最低死亡率最低死亡率 np各劑量組死亡率之和各劑量組死亡率之和 nn各組動物數各組動物數 nSx50logLD50的標準誤的標準誤 2021/6/1646 n寇氏原法：要求最小劑量的反應率（寇氏原法：要求最小劑量的反應率（P）為）為0 ，最大劑量反

23、應率（，最大劑量反應率（P）為）為100，結果才，結果才 精確。精確。 n 改良寇氏法只要求在最小劑量時改良寇氏法只要求在最小劑量時P0.2，最，最 大劑量大劑量p0.8即可。還要求每個劑量組的組間即可。還要求每個劑量組的組間 距呈等比或劑量對數等差，每個劑量組動物數距呈等比或劑量對數等差，每個劑量組動物數 相等，中間劑量接近于相等，中間劑量接近于LD50。 2021/6/1647 九靈胃康在小鼠的經口急性毒性試驗結果九靈胃康在小鼠的經口急性毒性試驗結果 2021/6/1648 n LD50=log-10.8859-0.11(2.8-0.5) = log-10.6329 =4.29 （g/kg

24、） n Sx50=0.0307 n logLD50及其及其95%可信限可信限 =0.63291.960.0307=0.63290.0602 n 小鼠的經口小鼠的經口LD50為為4.29g/kg，其，其95%可信范圍可信范圍 為為3.744.93g/kg 2021/6/1649 急性毒性評價 外源化學物相對毒性分級標準外源化學物相對毒性分級標準 2021/6/1650 急性毒性分級（急性毒性分級（WHO） 2021/6/1651 魚類急性毒性分級魚類急性毒性分級 2021/6/1652 LD50的局限性的局限性 n消耗動物量大消耗動物量大 n獲得的信息有限獲得的信息有限 n動物死亡和觀察的癥狀不足以反應生理學、動物死亡和觀察的癥狀不足以反應生理學、 血液學和其它化驗檢查所提供的毒性信息血液學和其它化驗檢查所提供的毒性信息 n有許多因素影響有許多因素影響LD50值的測定，實際上測得值的測定，實際上測得 的的LD50是近似值是近