1、二、常規細胞培養法二、常規細胞培養法 天然培養基培養法：取自動物體內天然天然培養基培養法：取自動物體內天然 成分培養細胞。成分培養細胞。 人工合成培養基培養法：合成培養基成人工合成培養基培養法：合成培養基成 分清楚，便于分析和人工調控。分清楚，便于分析和人工調控。 合成培養基單細胞培養合成培養基單細胞培養為近代主要的培為近代主要的培 養方法。養方法。 特點：特點： 組織和細胞剛剛離體，生物學性狀尚未發生很大變化，具組織和細胞剛剛離體，生物學性狀尚未發生很大變化，具 有二倍體遺傳性狀。有二倍體遺傳性狀。 在供體來源充分、生物條件穩定情況下（年齡、性別），在供體來源充分、生物條件穩定情況下（年齡、

2、性別）， 在一定程度上能反映體內狀態，適于做藥敏試驗。在一定程度上能反映體內狀態，適于做藥敏試驗。 初代培養所有機能上的改變，主要是表型上的改變，不一初代培養所有機能上的改變，主要是表型上的改變，不一 定是體細胞突變。定是體細胞突變。 初代培養細胞是研究基因表達的理想系統。初代培養細胞是研究基因表達的理想系統。 是建立各種細胞系（株）的必經階段。是建立各種細胞系（株）的必經階段。 異質性，初代培養的組織由多種細胞混合形成，在分析細異質性，初代培養的組織由多種細胞混合形成，在分析細 胞生物特性時有一定困難。胞生物特性時有一定困難。 （一）原代培養法：（一）原代培養法：又稱初代培養，是從供體獲取組

3、織又稱初代培養，是從供體獲取組織 后的首次培養。后的首次培養。 1. 消化培養法消化培養法 主要用品：主要用品： 人或動物的新鮮組織人或動物的新鮮組織 0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶 Hanks液液 含含10%20%牛血清的培養液牛血清的培養液 眼科剪刀、眼科鑷眼科剪刀、眼科鑷 吸管、培養皿、瓶和不銹鋼篩網、計數板等。吸管、培養皿、瓶和不銹鋼篩網、計數板等。 初代細胞培養主要方法：初代細胞培養主要方法： l流程：（注意流程：（注意無菌操作無菌操作） 15cm3新鮮組織用新鮮組織用Hanks液漂洗液漂洗23次次 眼科剪將組織剪成約眼科剪將組織剪成約1mm3的小塊的小塊 加加30 50倍原組織塊的倍原

4、組織塊的0.25%胰蛋白酶液胰蛋白酶液 溫消化溫消化37，14h 或或 冷消化冷消化4 ， 624h 不銹鋼網濾過除去大塊組織不銹鋼網濾過除去大塊組織 所得細胞懸液所得細胞懸液5001000rpm低速離心，低速離心，5min 棄上清，加適量營養液（含血清），棄上清，加適量營養液（含血清）， 吹打均勻制成細胞懸液吹打均勻制成細胞懸液 計數（計數（5105個個/ml），細胞密度過），細胞密度過 大時，補加營養液調整大時，補加營養液調整 37培養，注意培養，注意PH值（值（7.2 7.4） 冷消化冷消化 例：例：乳鼠腎細胞原代培養乳鼠腎細胞原代培養 （1 1）準備工作：）準備工作： 培養用品消毒后，

5、放在超凈工作臺內培養用品消毒后，放在超凈工作臺內 紫外線消毒，做好各項準備工作紫外線消毒，做好各項準備工作. . 點燃酒精燈，用品按布局放置，安裝點燃酒精燈，用品按布局放置，安裝 吸管等吸管等 采用頸椎脫臼法，將一只新生乳鼠處死采用頸椎脫臼法，將一只新生乳鼠處死 將小鼠放入盛有將小鼠放入盛有70%酒精的燒杯中數秒酒精的燒杯中數秒 置超凈工作臺內置超凈工作臺內 （二）取材：二）取材： 打開消毒器械包打開消毒器械包 用鑷子掀起乳鼠腹部皮用鑷子掀起乳鼠腹部皮 膚膚, ,用解剖剪剪開腹腔用解剖剪剪開腹腔, ,充分暴露腹腔。充分暴露腹腔。 用另一鑷子輕輕夾起腸管用另一鑷子輕輕夾起腸管, ,翻置一側翻置一

6、側, ,充充 分暴露位于腹腔背壁脊柱。分暴露位于腹腔背壁脊柱。 取下雙側腎臟，放入消毒培養皿中取下雙側腎臟，放入消毒培養皿中 用吸管吸取用吸管吸取PBS加入培養皿中，清洗腎臟加入培養皿中，清洗腎臟 3次，盡量去掉血污。次，盡量去掉血污。 將腎組織用解剖剪剪成幾塊，再用將腎組織用解剖剪剪成幾塊，再用PBS漂漂 洗，洗凈血液為止洗，洗凈血液為止。 （3 3）胰蛋白酶消化：）胰蛋白酶消化： l l 將洗凈的組織塊移入消毒小瓶中，用眼科剪剪切至將洗凈的組織塊移入消毒小瓶中，用眼科剪剪切至0.5 mm 大小的組織塊。大小的組織塊。 l l 加入加入1020倍體積的倍體積的0.25%胰蛋白酶，放入胰蛋白酶

7、，放入37水浴中水浴中 消化消化3060分鐘，注意應每隔分鐘，注意應每隔1015分鐘振搖分鐘振搖1次。次。 l l 當組織塊變得疏松，顏色略白時，取出置于超凈工作臺當組織塊變得疏松，顏色略白時，取出置于超凈工作臺 內用吸管反復吹打組織塊，使大部分組織塊分散成細胞團內用吸管反復吹打組織塊，使大部分組織塊分散成細胞團 或單個細胞狀態?；騿蝹€細胞狀態。 l l 加入加入12ml培養液終止消化，凈置片刻，讓未消化完的培養液終止消化，凈置片刻，讓未消化完的 組織塊自然下沉，將上部的組織懸液移入無菌離心管中。組織塊自然下沉，將上部的組織懸液移入無菌離心管中。 （4 4）離心及計數）離心及計數 l l 以以

8、8001000r/min低速離心低速離心810min，超，超 凈工作臺內開蓋，取上清加入適量培養液，細凈工作臺內開蓋，取上清加入適量培養液，細 胞計數后分裝。胞計數后分裝。 l l 在細胞瓶（板）上標明細胞名稱，代數，在細胞瓶（板）上標明細胞名稱，代數， 日期。日期。 l l 倒置顯微鏡下觀察細胞分散情況后置倒置顯微鏡下觀察細胞分散情況后置37 培養箱中培養。培養箱中培養。 （5）細胞觀察）細胞觀察 l l 培養細胞每天觀察，檢查：培養細胞每天觀察，檢查：A.污染與否污染與否? B.細胞生長狀態細胞生長狀態 l l 如見培養液變為黃色且又混濁，為污染；如培養液為如見培養液變為黃色且又混濁，為污

9、染；如培養液為 桔紅色，表明細胞狀況良好。在無污染時，桔紅色，表明細胞狀況良好。在無污染時，4h內有細胞內有細胞 貼壁，圓形懸浮狀的細胞延展成多角型。貼壁，圓形懸浮狀的細胞延展成多角型。 l l 培養培養34天，細胞生長繁殖，可見細胞島形成。細胞天，細胞生長繁殖，可見細胞島形成。細胞 透明，顆粒少，界限清。透明，顆粒少，界限清。 l l 由于細胞生長旺盛，代謝產物堆積，由于細胞生長旺盛，代謝產物堆積，CO2增多，培養增多，培養 液逐漸變酸呈黃色，但液體澄清，此時應換液。液逐漸變酸呈黃色，但液體澄清，此時應換液。 胰蛋白酶消化培養法特點：胰蛋白酶消化培養法特點： 能把組織塊分散成細胞團或單個細胞

10、，便于細能把組織塊分散成細胞團或單個細胞，便于細 胞從培養液中攝取營養和排出代謝產物，細胞能胞從培養液中攝取營養和排出代謝產物，細胞能 較快長成單層。較快長成單層。 尤其適用于培養大量組織，細胞產量高。尤其適用于培養大量組織，細胞產量高。 用于經常性小量培養工作稍顯繁瑣，易污染。用于經常性小量培養工作稍顯繁瑣，易污染。 2 2組織塊培養法組織塊培養法 l l 不用消化液不用消化液 l l 盡可能剪碎盡可能剪碎 l l 兩種技術：兩種技術： 翻轉干涸法（翻轉干涸法（37溫箱中）溫箱中） 薄層營養液培養法薄層營養液培養法 2h（不超過（不超過4h) 小塊相互距離以小塊相互距離以 0.5cm為宜為宜

11、 37 加入培養液少許 小結小結 動物細胞的培養步驟：動物細胞的培養步驟： 切取擬培養的動物器官或大組織塊切取擬培養的動物器官或大組織塊 洗去血污洗去血污 剔除多余成分剔除多余成分 切成約切成約1mm3大小的組織塊大小的組織塊 將所有組織剪碎將所有組織剪碎 用于組織培養用于組織培養 蛋白酶溶液消化蛋白酶溶液消化 機械方法吹打組織塊機械方法吹打組織塊 離心、培養液懸浮離心、培養液懸浮 計數、調節細胞密度計數、調節細胞密度 用于分離細胞培養用于分離細胞培養 （二）傳代培養法：（二）傳代培養法： 細胞達到細胞達到80%以上匯合或剛匯合以上匯合或剛匯合時是理想的時是理想的 傳代階段。傳代階段。 1.

12、1. 用品：用品： 80%以上匯合單層細胞以上匯合單層細胞 0.25%胰蛋白酶或胰蛋白酶或0.02%EDTA Hanks液液 細胞培養液細胞培養液 培養瓶培養瓶 吸管吸管 2 2流程：流程： 棄去細胞培養瓶中舊營養液棄去細胞培養瓶中舊營養液 加適量消化液加適量消化液 胞質回縮，細胞間隙增大時終止消化胞質回縮，細胞間隙增大時終止消化 棄去消化液，加棄去消化液，加Hanks液輕洗單層細胞液輕洗單層細胞 用吸管吸取營養液輕輕吹打瓶壁細胞，使用吸管吸取營養液輕輕吹打瓶壁細胞，使 之脫落制成單細胞懸液之脫落制成單細胞懸液 分裝細胞培養瓶，分裝細胞培養瓶，37，CO2培養箱培養培養箱培養 3 3注意注意：

13、 掌握好傳代時機掌握好傳代時機，80-90%左右匯合最好左右匯合最好 （過早細胞數量少；過晚細胞健康狀態不佳）（過早細胞數量少；過晚細胞健康狀態不佳） 消化時間適度消化時間適度（過短細胞不易從瓶壁脫落；（過短細胞不易從瓶壁脫落； 過長細胞脫落流失受影響）過長細胞脫落流失受影響） 消化液濃度要適宜消化液濃度要適宜 不同細胞對消化液的反應不同不同細胞對消化液的反應不同 三、特殊培養法三、特殊培養法 1 1二倍體細胞培養法：二倍體細胞培養法：是指培養的細胞是指培養的細胞 始終維持二倍體生物學性狀始終維持二倍體生物學性狀的培養方法。的培養方法。 正常細胞的原代培養即為二倍體細胞，但正常細胞的原代培養即

14、為二倍體細胞，但 長期旺盛地增殖生長，并保持二倍體性狀并非長期旺盛地增殖生長，并保持二倍體性狀并非 易事。易事。 種細胞種細胞 （stock） 凍存細胞凍存細胞 （stock-2） 使用細胞使用細胞 凍存細胞凍存細胞 （stock-1） 使用細胞使用細胞 使用細胞使用細胞 凍存細胞凍存細胞 （stock-2） 凍存凍存 使用使用 凍存凍存 使用使用 凍存凍存 使用使用 凍存凍存 使用使用 低溫凍存：低溫凍存： l l措施：措施： 采用妥善的培養方法：采用妥善的培養方法： 嚴格控制嚴格控制PH，最好在，最好在5%CO2培養箱中培養。培養箱中培養。 換液時間間隔不能太長，部分換液。換液時間間隔不能

15、太長，部分換液。 掌握好傳代時機，傳代期不能過長，細胞不能掌握好傳代時機，傳代期不能過長，細胞不能 過于密集，應及時傳代。過于密集，應及時傳代。 高質量血清和培養基，盡量維持不變。高質量血清和培養基，盡量維持不變。 每次傳代均一分為二（細胞數量、營養液量、每次傳代均一分為二（細胞數量、營養液量、 培養瓶空間和面積不變）進行培養。培養瓶空間和面積不變）進行培養。 傳代后細胞如不用于實驗，立即低溫凍存。傳代后細胞如不用于實驗，立即低溫凍存。 2加支持物培養法：加支持物培養法：預先向培養容器內加入各預先向培養容器內加入各 種可使細胞貼附的支持物，進行培養的方法。種可使細胞貼附的支持物，進行培養的方法

16、。 （1）玻璃片：便于進行各種固定、染色處理）玻璃片：便于進行各種固定、染色處理 和觀察。和觀察。 蓋玻片做支持物的處理：自來水浸泡蓋玻片做支持物的處理：自來水浸泡24h 96% 酒精酒精30 60 min 蒸餾水浸泡蒸餾水浸泡30 60min 干凈軟布擦干凈干凈軟布擦干凈 裝入裝入 培養皿培養皿 高壓滅菌備用高壓滅菌備用 （2）聚四氟乙烯）聚四氟乙烯：適于做電鏡技術，可以進行：適于做電鏡技術，可以進行 包埋和切片。包埋和切片。 l l 特點：特點： （1）可在任何時間取出支持物，做各）可在任何時間取出支持物，做各 種觀察和實驗。種觀察和實驗。 （2）需將支持物處理干凈，不殘留任）需將支持物處

17、理干凈，不殘留任 何對細胞有害成分，避免不利因素影響細何對細胞有害成分，避免不利因素影響細 胞貼附和生長。胞貼附和生長。 3單細胞分離培養（又稱細胞克?。﹩渭毎蛛x培養（又稱細胞克?。?即把即把單個細胞單個細胞從群體內分離出來從群體內分離出來單獨培養單獨培養，使之，使之 重新繁衍成一個重新繁衍成一個新的細胞群體新的細胞群體的培養技術。的培養技術。 細胞經克隆后，形成細胞經克隆后，形成純系純系，稱細胞株稱細胞株。 要點和原理要點和原理 細胞群體細胞群體單細胞培養單細胞培養新的細胞群體新的細胞群體純系純系 基本原則基本原則：保證分離出的細胞保證分離出的細胞確為一個確為一個而而 不是兩個或更多。不是

18、兩個或更多。 理論上各種培養細胞都可進行克隆培養，但原理論上各種培養細胞都可進行克隆培養，但原 代培養細胞和有限細胞系（二倍體細胞）較困難，代培養細胞和有限細胞系（二倍體細胞）較困難， 而無限細胞系、轉化細胞系和腫瘤細胞則較容易。而無限細胞系、轉化細胞系和腫瘤細胞則較容易。 細胞對營養液的細胞對營養液的同化作用同化作用，具有，具有促克隆細胞生長促克隆細胞生長作用。作用。 不同細胞同化營養液的能力不同。不同細胞同化營養液的能力不同。 對培養環境適應性強和具有較強獨立生存能力的細胞均對培養環境適應性強和具有較強獨立生存能力的細胞均 易做細胞克隆。易做細胞克隆。 克隆細胞時，要把細胞制備成克隆細胞時

19、，要把細胞制備成單細胞懸液單細胞懸液，再接種到底，再接種到底 物上進行培養，讓細胞物上進行培養，讓細胞單獨生長單獨生長。 適應性大和活力好的細胞能增殖形成細胞小群（適應性大和活力好的細胞能增殖形成細胞小群（Colony) 克隆。克隆。 原理：原理： 無限細胞系，不低于無限細胞系，不低于10%； 原代細胞、有限細胞系，原代細胞、有限細胞系，0.55%。 Coloning Efficiency 克隆形成率克隆形成率（Coloning Efficiency）：）： 細胞群中細胞群中單個細胞單個細胞形成克隆的百分形成克隆的百分 數稱克隆形成率，也稱數稱克隆形成率，也稱接種率接種率（Seeding Ef

20、ficiency)。用于表示細胞生活力和獨立。用于表示細胞生活力和獨立 生長能力。生長能力。 克隆形成率與細胞的密度成正比克隆形成率與細胞的密度成正比 培養基：培養基：自制自制適應性培養基適應性培養基是一種是一種不含不含 細胞細胞而已被細胞生活過或同化過的培養基。而已被細胞生活過或同化過的培養基。 選取同源選取同源指數生長期指數生長期細胞細胞（半匯合）（半匯合） 換培養液換培養液1次次 繼續培養繼續培養2448h后，吸取所有培養液后，吸取所有培養液 3000-4000rpm，離心，離心10min 提高克隆形成率的措施提高克隆形成率的措施 上清用上清用0.22m微孔濾膜過濾（避免形成假克微孔濾膜

21、過濾（避免形成假克 ?。┞。蜏貎龃鎮溆?，低溫凍存備用 用時取用時取1份適應性培養基份適應性培養基+2份新份新 配制培養基混合使用配制培養基混合使用 血清：胎牛血清血清：胎牛血清小牛血清小牛血清馬血清，滅馬血清，滅 活處理活處理56，0.5h. 應先做克隆形成率實驗，選最佳者使用。應先做克隆形成率實驗，選最佳者使用。 激素：含激素：含110u/ml的胰島素培養液能促進很多的胰島素培養液能促進很多 細胞克隆的形成。細胞克隆的形成。 CO2：CO2對絕大多數細胞克隆形成率都有提高，對絕大多數細胞克隆形成率都有提高， 多用多用5%，成纖維細胞和膠質細胞，成纖維細胞和膠質細胞2%. 飼細胞（飼細胞（

22、Feeder cells）：也稱滋養細胞，是一層）：也稱滋養細胞，是一層 經過射線照射或絲裂霉素傷害處理的、用作克隆經過射線照射或絲裂霉素傷害處理的、用作克隆 細胞附著底物的細胞層。細胞附著底物的細胞層。失去分裂能力，但仍然失去分裂能力，但仍然 生存并有同化營養液的能力生存并有同化營養液的能力。 飼細胞制備后三周內即死亡，應及時應用。飼細胞制備后三周內即死亡，應及時應用。 飼養層克隆培飼養層克隆培 養養 適應性底物：適應性底物： 無限細胞系無限細胞系塑料底物；塑料底物； 原代培養細胞原代培養細胞膠原層或血漿纖維蛋白層。膠原層或血漿纖維蛋白層。 病毒轉化細胞或惡性細胞病毒轉化細胞或惡性細胞 瓊脂

23、層（瓊脂層（2%），）， 惡變細胞或惡性轉化細胞在軟瓊脂（惡變細胞或惡性轉化細胞在軟瓊脂（1.2%）中的）中的 生長與致瘤性有很大一致性。生長與致瘤性有很大一致性。 方法（多孔塑料培養板單細胞克隆法）：方法（多孔塑料培養板單細胞克隆法）： 48孔或孔或96孔塑料細胞培養板孔塑料細胞培養板 （培養（培養612h后）鏡下檢測每孔所含后）鏡下檢測每孔所含 細胞數，標記下含單細胞孔細胞數，標記下含單細胞孔 制備低密度的細胞懸液（制備低密度的細胞懸液（10個細胞個細胞/ml） 每孔接種每孔接種100l細胞懸液細胞懸液 37培養培養 標記孔細胞增殖成群即為細胞克隆標記孔細胞增殖成群即為細胞克隆 繼續培養繼

24、續培養3-4周，待孔內細胞增至周，待孔內細胞增至500-600個個 時，進行分離培養時，進行分離培養 擴大再培養擴大再培養 注意事項：注意事項： 確為一個細胞確為一個細胞后方可進行標記后方可進行標記 注意觀察孔底邊緣部位注意觀察孔底邊緣部位 選健康細胞的孔標記選健康細胞的孔標記 細胞克隆培養的其他方法細胞克隆培養的其他方法: 軟瓊脂培養、軟瓊脂培養、 甲基纖維素半固體培養、有限稀釋法甲基纖維素半固體培養、有限稀釋法 4懸浮培養法懸浮培養法 ：使貼附性細胞呈懸浮狀態：使貼附性細胞呈懸浮狀態 生長。生長。 懸浮生長型：離心去除舊培養液懸浮生長型：離心去除舊培養液添加添加 新培養液新培養液混勻分裝即

25、可混勻分裝即可 貼附生長型：干擾細胞貼附，方可形成貼附生長型：干擾細胞貼附，方可形成 懸浮生長狀態。懸浮生長狀態。 常用方法：常用方法：a.大培養瓶增加含有鐵芯的無毒聚大培養瓶增加含有鐵芯的無毒聚 苯乙烯棒，培養中進行電磁攪拌。苯乙烯棒，培養中進行電磁攪拌。 b.試管培養細胞，把試管置入帶有試管培養細胞，把試管置入帶有 懸轉鼓的溫箱中培養。懸轉鼓的溫箱中培養。 5.5.球體細胞培養球體細胞培養 能使培養細胞長成球體型，球體中心部細胞吸收能使培養細胞長成球體型，球體中心部細胞吸收 營養和排出代謝產物要通過外圍細胞，周邊部細胞卻營養和排出代謝產物要通過外圍細胞，周邊部細胞卻 是直接的，兩者生存條件

26、不同，是直接的，兩者生存條件不同，與腫瘤組織和體內上與腫瘤組織和體內上 皮組織情況相似皮組織情況相似，對研究細胞分化很有價值。，對研究細胞分化很有價值。 6.6.微載體細胞培養法微載體細胞培養法 可獲得大量細胞。目前使用的載體主要有三種類可獲得大量細胞。目前使用的載體主要有三種類 型，都是帶有不同基團的葡萄糖交聯而成的大分子，型，都是帶有不同基團的葡萄糖交聯而成的大分子， 分別為分別為、型。對細胞無毒性，適于各種附著型。對細胞無毒性，適于各種附著 型細胞的生長，尤其是附著性差和存活率低的細胞。型細胞的生長，尤其是附著性差和存活率低的細胞。 第六章第六章 細胞培養的污染、細胞培養的污染、 檢測和

27、排除檢測和排除 一、污染種類：一、污染種類： 凡混入培養環境中對細胞生存有凡混入培養環境中對細胞生存有 害的成分和造成細胞不純的異物都視害的成分和造成細胞不純的異物都視 為污染。為污染。 微生物：細菌、真菌、支原體和病毒等微生物：細菌、真菌、支原體和病毒等 化學物質：影響細胞生存、非細胞生存化學物質：影響細胞生存、非細胞生存 所需的化學成分所需的化學成分 細胞：非同種的其他細胞細胞：非同種的其他細胞 二、污染途徑：二、污染途徑： 1空氣：超凈工作臺，凈化工作區域的空氣，空氣：超凈工作臺，凈化工作區域的空氣， 每立方米內含菌數每立方米內含菌數不應超過不應超過5個個。 2清洗消毒：滅菌不徹底，清洗

28、不干凈。清洗消毒：滅菌不徹底，清洗不干凈。 3操作：細胞交叉污染操作：細胞交叉污染 系統污染系統污染 微生物污染微生物污染 單一污染單一污染 4血清：實驗材料質量不過關，以支原體最血清：實驗材料質量不過關，以支原體最 為常見。為常見。 5組織標本：取組織時的污染或取自開放性組織標本：取組織時的污染或取自開放性 器官的組織器官的組織 三、污染對培養細胞的影響：三、污染對培養細胞的影響： 1 細胞受有害物污染時間短，程度輕并能細胞受有害物污染時間短，程度輕并能 及時排除污染物的情況下，部分細胞可恢復，及時排除污染物的情況下，部分細胞可恢復， 特別是化學物污染。特別是化學物污染。 2污染物持續存在于

29、培養環境中，輕者細污染物持續存在于培養環境中，輕者細 胞生長緩慢，分裂相減少，細胞變得粗糙，輪胞生長緩慢，分裂相減少，細胞變得粗糙，輪 廓增強，胞漿出現較多的顆粒；污染較重時，廓增強，胞漿出現較多的顆粒；污染較重時， 細胞增殖停止，分裂相消失，胞質中出現大量細胞增殖停止，分裂相消失，胞質中出現大量 的堆積物，細胞變圓、脫落或崩解。的堆積物，細胞變圓、脫落或崩解。 3不同污染物對細胞的影響有差別。有的微不同污染物對細胞的影響有差別。有的微 生物如支原體，無致死毒性，可與細胞長期生物如支原體，無致死毒性，可與細胞長期 共存，但對細胞形態和功能有潛在影響。而共存，但對細胞形態和功能有潛在影響。而 病

30、毒、細菌和霉菌的增殖迅速，能在短時間病毒、細菌和霉菌的增殖迅速，能在短時間 內在數量上壓過細胞或產生有毒物殺死細胞。內在數量上壓過細胞或產生有毒物殺死細胞。 污染物對細胞的影響可通過目測、顯微污染物對細胞的影響可通過目測、顯微 鏡觀察、電鏡觀察、特殊染色鑒定、微生物鏡觀察、電鏡觀察、特殊染色鑒定、微生物 培養實驗、免疫學和分子生物學實驗等。培養實驗、免疫學和分子生物學實驗等。 真菌污染：真菌污染：微生物污染中，以真菌最多微生物污染中，以真菌最多 種類繁多，形態各異，但污染后均不難發現。種類繁多，形態各異，但污染后均不難發現。 細菌污染：細菌污染：污染后大多能改變培養液污染后大多能改變培養液pH

31、pH使培養液使培養液 變渾濁，也有的對培養液無肉眼可見影響，鏡下觀變渾濁，也有的對培養液無肉眼可見影響，鏡下觀 察才可見。察才可見。 增殖迅速，能消耗營養液和產生毒素抑制細胞增殖迅速，能消耗營養液和產生毒素抑制細胞 生長，毒性大的細菌很快導致細胞崩解死亡。生長，毒性大的細菌很快導致細胞崩解死亡。 應用抗生素對預防細菌污染有效。應用抗生素對預防細菌污染有效。 支原體污染：支原體污染：是細胞培養中最常見、不易被察是細胞培養中最常見、不易被察 覺和干擾實驗結果的一種污染。是細胞培養研究覺和干擾實驗結果的一種污染。是細胞培養研究 中重點預防對象。中重點預防對象。 （1）支原體生物學性狀：）支原體生物學

32、性狀：一種介于細菌和病毒之間一種介于細菌和病毒之間 的目前所知能獨立生活的最小微生物。可通過除菌濾的目前所知能獨立生活的最小微生物?？赏ㄟ^除菌濾 器。器。 多形態性，光鏡下難以看清其結構。多形態性，光鏡下難以看清其結構。 多吸附于細胞表面或散在細胞之間。多吸附于細胞表面或散在細胞之間。 對青霉素普遍有抗藥性。對青霉素普遍有抗藥性。 （2）對細胞的影響：）對細胞的影響：多數細胞受污染后，無明顯變化，多數細胞受污染后，無明顯變化， 或有微細變化卻由于傳代和換液而被緩解?；蛴形⒓氉兓瘏s由于傳代和換液而被緩解。 污染細胞會受到多方面潛在的影響，如：污染細胞會受到多方面潛在的影響，如： 影響影響DNA合

33、成，引起一系列嚴重后果（改變細胞染色體合成，引起一系列嚴重后果（改變細胞染色體 核型、增加染色體畸變、抑制核型、增加染色體畸變、抑制PHA促淋巴細胞轉化等）；促淋巴細胞轉化等）； 影響影響RNA合成；合成； 抑制細胞合成干擾素，降低細胞抵抗力等。抑制細胞合成干擾素，降低細胞抵抗力等。 支原體對細胞的影響非常廣泛和深遠，因此，在建立支原體對細胞的影響非常廣泛和深遠，因此，在建立 細胞系和進行各種實驗時，應首先證明所用細胞有無支原細胞系和進行各種實驗時，應首先證明所用細胞有無支原 體污染。體污染。 各類細胞對支原體的感受性和反應亦有差異，一般初各類細胞對支原體的感受性和反應亦有差異，一般初 代培養

34、和二倍體細胞對支原體耐受性強。染色體多的多倍代培養和二倍體細胞對支原體耐受性強。染色體多的多倍 體和無限細胞系較敏感；支原體對轉化細胞和腫瘤細胞似體和無限細胞系較敏感；支原體對轉化細胞和腫瘤細胞似 有親和力。有親和力。 （3 3）支原體的檢測：）支原體的檢測：污染細胞后，培養基可不發生渾污染細胞后，培養基可不發生渾 濁，細胞病理變化輕微或不顯，難以發現。濁，細胞病理變化輕微或不顯，難以發現。 檢測方法：檢測方法： 相差顯微鏡檢測：相差顯微鏡檢測：支原體呈暗色微小顆粒，有類似布朗運支原體呈暗色微小顆粒，有類似布朗運 動的表現，多位于動的表現，多位于細胞表面細胞表面和細胞之間。和細胞之間。 低漲處理地衣紅染色觀察法：低漲處理地衣紅染色觀察法：固定染色，簡便易行，標本固定染色，簡便易行，標本 可長期保存，亦可用于檢測真菌和細菌。鏡下支原體呈暗可長期保存，亦可用于檢測真菌和細菌。鏡下支原體呈暗 紫色小體，附于細胞外或散在于細胞之間。紫色小體，附于細胞外或散在于細胞之間。 熒光染色法：熒光染色法：熒光染料熒光染料Hoechst33258能與能與DNA特異結合，特異結合， 支原體內含有支原體內含