1、 肺炎支原體肺炎流行病學、臨床特征與診療規范化研究肺炎支原體肺炎流行病學、臨床特征與診療規范化研究 潘長旺潘長旺 發展簡史 2 主要內容 3 4 5 DNA復制、轉錄和翻譯 DNA重組與基因工程重組與基因工程 基因與疾病基因與疾病 1 發展簡史 準備和醞釀準備和醞釀 建立和發展建立和發展 蛋白質是生命的主要基礎物質蛋白質是生命的主要基礎物質 DNA是遺傳的物質基礎是遺傳的物質基礎 遺傳中心法則的建立遺傳中心法則的建立 蛋白質翻譯合成的基本過程蛋白質翻譯合成的基本過程 1953年年 主要內容 基因工程技術基因工程技術 基因表達的調控基因表達的調控 生物大分子的結構和功能生物大分子的結構和功能 生

2、物信息學生物信息學 中心法則（ central dogma） 遺傳信息傳遞方向的規律遺傳信息傳遞方向的規律 DNA通過復制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過復制將遺傳信息由親代傳遞給子代； 通過轉錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質分通過轉錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質分 子，從而決定生物的表現型。子，從而決定生物的表現型。DNA的復制、轉的復制、轉 錄和翻譯過程就構成了錄和翻譯過程就構成了遺傳學的中心法則遺傳學的中心法則。 在在RNA病毒中，其遺傳信息貯存在病毒中，其遺傳信息貯存在RNA分子分子 中。遺傳信息的流向是中。遺傳信息的流向是RNA通過復制，將遺傳通過復制，將遺傳 信息由親代傳遞給子代

3、，通過反轉錄將遺傳信信息由親代傳遞給子代，通過反轉錄將遺傳信 息傳遞給息傳遞給DNA，再由，再由DNA通過轉錄和翻譯傳通過轉錄和翻譯傳 遞給蛋白質，這種遺傳信息的流向就稱為遞給蛋白質，這種遺傳信息的流向就稱為反中反中 心法則心法則。 染色體結構與染色體結構與DNA復制復制 基因的轉錄與加工基因的轉錄與加工 蛋白質的翻譯蛋白質的翻譯 蛋白質合成后的修飾加工蛋白質合成后的修飾加工 蛋白質合成后的靶向輸送蛋白質合成后的靶向輸送 一、染色體結構與一、染色體結構與DNA復制復制 （一）復制的基本規律（一）復制的基本規律 （二）（二）DNADNA復制的條件復制的條件 （三）（三）DNADNA生物合成過程生

4、物合成過程 （四）真核生物端粒（四）真核生物端粒 （五）逆轉錄（五）逆轉錄 染色體： 染色體 DNA 基因 基因和染色體，基因和染色體，DNADNA 和脫氧核苷酸的關系：和脫氧核苷酸的關系： 每一條染色體只含有一個每一條染色體只含有一個 DNADNA分子，每個分子，每個DNADNA分子上有分子上有 很多基因，基因是很多基因，基因是DNADNA片段，片段， 在染色體上呈線性排列，每在染色體上呈線性排列，每 個基因中又有成百上千個脫個基因中又有成百上千個脫 氧核苷酸。氧核苷酸。每個基因有特定每個基因有特定 的脫氧核苷酸排列順序，它的脫氧核苷酸排列順序，它 代表著遺傳信息代表著遺傳信息 是基因的載體

5、。是基因的載體。 DNA在復制時，以親代DNA的每一股作模板， 合成完全相同的兩個雙鏈子代DNA，每個子代 DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現象稱為 DNA的半保留復制(semi-conservative replication)。 1、半保留復制、半保留復制 （一）復制的基本規律（一）復制的基本規律 復制復制 親代親代DNA 子代子代DNA DNADNA半保留復制示意圖半保留復制示意圖 DNADNA半保留復制研究實驗結果示意圖半保留復制研究實驗結果示意圖 按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA的堿 基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信 息，體現了遺傳的保守性。 遺傳的保守性，是物種

6、穩定性的分子基礎，但 不是絕對的。 半保留復制的意義半保留復制的意義 DNA在復制時，需在特定的位點起始，這是一 些具有特定核苷酸排列順序的片段，即復制起 始點(origin) 。 在原核生物中，復制起始點通常為一個，而在 真核生物中則為多個。 2、有一定的復制起始點、有一定的復制起始點 5 3 oriorioriori 5 3 5 5 3 3 5 5 3 復制子復制子 3 復制起始點與復制子示意圖復制起始點與復制子示意圖 習慣上把兩個相鄰DNA復制起始點之間的距離 （或DNA片段）定為一個復制子(replicon) 。 復制子是獨立完成復制的功能單位。 DNA復制時，局部雙螺旋解開形成兩條單

7、 鏈，這種叉狀結構稱為復制叉。 復制起始點、復制子與復制叉（動畫演示）復制起始點、復制子與復制叉（動畫演示） 參與DNA復制的DNA聚合酶，必須以一段具有 3端自由羥基（3-OH）的RNA作為引物 (primer) ，才能開始聚合子代DNA鏈。 RNA引物的大小，在原核生物中通常為50 100個核苷酸，而在真核生物中約為10個核苷 酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿 基順序相配對。 3、需要引物、需要引物 DNA復制時，以復制起始點(origin)為中心，向 兩個方向進行解鏈，形成兩個延伸方向相反的 復制叉，稱為雙向復制(bidirectional replication)。 但在低

8、等生物中，也可進行單向復制（如滾環 復制）。 4、雙向復制、雙向復制 DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA鏈， 即模板DNA鏈的方向必須是35。 由于DNA分子中兩條鏈的走向相反，因此當分 別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈 時，子代鏈的聚合方向也是不同的。 5、半不連續復制、半不連續復制 3 5 3 5 3 5 3 5 解鏈方向解鏈方向 領頭鏈領頭鏈 (leading strand) 隨從鏈隨從鏈 (lagging strand) DNADNA的半不連續復制的半不連續復制 3 5 以以35方向的親代方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復鏈作模板的子代鏈在復 制時基本上是連續進行的

9、，其子代鏈的聚合方向制時基本上是連續進行的，其子代鏈的聚合方向 為為53，這一條鏈被稱為，這一條鏈被稱為領頭鏈領頭鏈(leading strand)。 以以53方向的親代方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復鏈為模板的子代鏈在復 制時則是不連續的，其鏈的聚合方向也是制時則是不連續的，其鏈的聚合方向也是53， 這條鏈被稱為這條鏈被稱為隨從鏈隨從鏈(lagging strand)。 領頭鏈連續復制而隨從鏈不連續復制，就領頭鏈連續復制而隨從鏈不連續復制，就 是復制的是復制的半不連續性半不連續性。 由于親代DNA雙鏈在復制時是逐步解開的，因 此，隨從鏈的合成也是一段一段的。DNA在復 制時，由隨從鏈所形

10、成的一些子代DNA短鏈稱 為岡崎片段(Okazaki fragment)。 岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000 2000個核苷酸，而在真核生物中約為100個核 苷酸。 以四種脫氧核糖核酸(deoxynucleotide triphosphate)為底物，即dATP，dGTP， dCTP，dTTP。 1 1、底物、底物(substrate) (substrate) (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 +PPi （二）（二）DNA復制的條件復制的條件 DNADNA復制過程中脫氧核糖核苷酸的聚合反應復制過程中脫氧核糖核苷酸的聚合反應 DNA復制是模板依賴性的，必須要以親 代DNA

11、鏈作為模板。親代DNA的兩股鏈 解開后，可分別作為模板進行復制。 2 2、模板、模板(template)(template) 引物酶(primerase)本質上是一種依賴DNA的RNA聚合 酶（DDRP），該酶以DNA為模板，聚合一段RNA短 鏈引物(primer)，以提供自由的3-OH，使子代DNA鏈 能夠開始聚合。 引物酶需組裝成引發體才能催化RNA引物的合成。 3 3、引發體和、引發體和RNARNA引物引物 3 HO 5 3 5 3 5 引物酶催化合成短鏈引物酶催化合成短鏈RNARNA引物分子引物分子 引物引物 引物引物 酶酶 4 4、DNADNA聚合酶聚合酶 全稱：依賴DNA的DNA聚

12、合酶 ( DNA- dependent DNA polymerase, DDDP ) 簡稱：DNA-pol 活性：1. 53 的聚合酶活性 2. 核酸外切酶活性 DNA連接酶(DNA ligase)可催化兩段DNA 片段之間磷酸二酯鍵的形成，從而把兩段 相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。 5 5、DNADNA連接酶連接酶 DNA連接酶連接酶 ATP（NAD+） ADP+Pi（NMN+AMP） HO 5 P O O- O- O 3 53 P O O- O- O 3 5 53 DNADNA連接酶的連接作用連接酶的連接作用 DNA復制過程簡圖復制過程簡圖 DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。連

13、接酶在復制中起最后接合缺口的作用。 在在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。 是基因工程的重要工具酶之是基因工程的重要工具酶之一。一。 DNA連接酶的作用連接酶的作用 解螺旋酶(helicase) ， 又稱解鏈酶或rep蛋 白，是用于解開 DNA雙鏈的酶蛋白。 每解開一對堿基， 需消耗2分子ATP。 6、解螺旋酶、解螺旋酶 單鏈DNA結合蛋白（single strand binding protein, SSB），又稱螺旋反穩蛋白(HDP)， 是一些能夠與單鏈DNA結合的蛋白質因子。 7 7、單鏈、單鏈DNADNA結合蛋白結合蛋白 SSB的生理作用的生

14、理作用 使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩定存在， 即穩定單鏈DNA，便于其作為模板復制子 代DNA； 保護單鏈DNA，避免核酸酶的降解。 8、DNA拓撲異構酶 人類拓撲異構酶人類拓撲異構酶的分子結構的分子結構 能夠松解能夠松解DNA超螺旋結構的酶。超螺旋結構的酶。 1010 8 8 局部解鏈后局部解鏈后 DNADNA復制過程中正超螺旋的形成復制過程中正超螺旋的形成 解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成 拓撲異構酶的作用特點拓撲異構酶的作用特點 既能水解既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵、又能連接磷酸二酯鍵 拓撲異構酶拓撲異構酶 拓撲異構酶拓撲異構酶 分分 類類 拓撲異拓撲異 構酶構酶

15、切斷切斷DNA雙鏈中雙鏈中一股一股鏈，使鏈，使DNA 解鏈旋轉不致打結；適當時候封解鏈旋轉不致打結；適當時候封 閉切口，閉切口，DNA變為松弛狀態變為松弛狀態。 反應反應不需不需ATP。 拓撲異拓撲異 構酶構酶 切斷切斷DNA分子分子兩股兩股鏈，斷端通過鏈，斷端通過 切口旋轉使超螺旋松弛。切口旋轉使超螺旋松弛。 利用利用ATP供能，連接斷端，供能，連接斷端， DNA 分子進入負超螺旋狀態。分子進入負超螺旋狀態。 DNA拓撲異構酶的作用機制拓撲異構酶的作用機制 1、復制的起始、復制的起始 （三）（三） DNA生物合成過程生物合成過程 解旋解鏈，形成復制叉解旋解鏈，形成復制叉 引發體組裝和引物合成

16、引發體組裝和引物合成 2、復制的延長、復制的延長 DNA聚合酶聚合酶 5 5 3 3 5 5 dATPdGTPdTTP dCTP dTTP dGTPdATP dCTP OH 3 3 3 DNA-pol DNADNA復制的延長過程復制的延長過程 3 3、復制的終止、復制的終止 去除引物，填補缺口去除引物，填補缺口 連接岡崎片段連接岡崎片段 端粒（telomere） 是指真核生物染色 體線性DNA分子末 端的結構部分，通 常膨大成粒狀。 （四）真核生物端粒（四）真核生物端粒 功能功能 維持染色體的穩定性維持染色體的穩定性 保證保證DNA復制的完整性復制的完整性 端粒的結構特點端粒的結構特點 由末端

17、單鏈由末端單鏈DNA序列和蛋白質構成。序列和蛋白質構成。 末端末端DNA序列是多次重復的富含序列是多次重復的富含G、T堿基堿基 的短的短 序列。序列。 TTTTGGGGTTTTGGGG 線性線性DNA在復制完成后，其末端由于引物在復制完成后，其末端由于引物RNA 的水解而可能出現縮短。故需要在端粒酶的水解而可能出現縮短。故需要在端粒酶 （telomerase）的催化下，進行延長反應。）的催化下，進行延長反應。 5 3 3 5 5 3 3 5 端粒酶端粒酶(telomerase) n端粒酶是一種端粒酶是一種RNA- 蛋白質復合體，它可蛋白質復合體，它可 以其以其RNA為模板，通為模板，通 過逆轉

18、錄過程對末端過逆轉錄過程對末端 DNA鏈進行延長。鏈進行延長。 端粒酶的分子結構端粒酶的分子結構 端粒酶的爬行模型（動畫演示）端粒酶的爬行模型（動畫演示） （五）（五） 逆轉錄逆轉錄 1、逆轉錄病毒和逆轉錄酶、逆轉錄病毒和逆轉錄酶 逆轉錄病毒細胞內的逆轉錄現象：逆轉錄病毒細胞內的逆轉錄現象： RNA 模板模板 逆轉錄酶逆轉錄酶 DNA-RNA 雜雜 化雙鏈化雙鏈 RNA酶酶 單鏈單鏈DNA 逆轉錄酶逆轉錄酶 雙鏈雙鏈DNA 2 2、逆轉錄研究的意義、逆轉錄研究的意義 逆轉錄酶和逆轉錄現象，是分子生物學研究中逆轉錄酶和逆轉錄現象，是分子生物學研究中 的重大發現。的重大發現。 逆轉錄逆轉錄現象說明

19、：至少在某些生物，現象說明：至少在某些生物，RNA同同 樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。 對逆轉錄病毒的研究，拓寬了對逆轉錄病毒的研究，拓寬了20世紀初已注意世紀初已注意 到的病毒致癌理論。到的病毒致癌理論。 （一）（一）RNARNA的轉錄過程的轉錄過程：（略）（略） 轉錄起始轉錄起始 鏈的延伸鏈的延伸 轉錄終止轉錄終止 二、基因的轉錄與加工二、基因的轉錄與加工 （二）（二）RNARNA的轉錄后加工的轉錄后加工 在細胞內，由在細胞內，由RNARNA聚合酶合成的原初轉錄物聚合酶合成的原初轉錄物 （primary transcriptprimary transcript

20、）往往需要一系列的變）往往需要一系列的變 化，才轉變為成熟的化，才轉變為成熟的RNARNA分子。此過程總稱為分子。此過程總稱為 RNARNA的成熟的成熟或稱為或稱為RNARNA的轉錄后加工。的轉錄后加工。 1 1、mRNAmRNA前體的加工前體的加工： 原核生物原核生物的的mRNAmRNA轉錄后轉錄后一般一般不需要加工，轉不需要加工，轉 錄的同時即進行翻譯（半壽期短）。亦有少錄的同時即進行翻譯（半壽期短）。亦有少 數多順反子的數多順反子的mRNAmRNA需要核酸酶切成小單位，需要核酸酶切成小單位， 然后再翻譯。然后再翻譯。 真核生物真核生物mRNAmRNA（半壽期較長）轉錄物很大，在加工過（半

21、壽期較長）轉錄物很大，在加工過 程中形成許多分子大小不等的中間物，它們被稱為程中形成許多分子大小不等的中間物，它們被稱為 核內不均一核內不均一RNARNA（heterogeneous nuclear RNA, heterogeneous nuclear RNA, hnRNA)hnRNA)，需要進一步進行加工修飾轉化為，需要進一步進行加工修飾轉化為mRNAmRNA。加。加 工包括：工包括： （1 1）hnRNAhnRNA被剪接，把內含子（被剪接，把內含子（DNADNA上非編碼序列）上非編碼序列） 轉錄序列剪掉，把轉錄序列剪掉，把外顯子外顯子（DNADNA上的編碼序列）轉錄上的編碼序列）轉錄 序列

22、序列拼接拼接上上( (真核生物一般為不連續基因真核生物一般為不連續基因) )。 （2 2）33端添加端添加polyA “polyA “尾巴尾巴”； （3 3）55端連接端連接“帽子帽子”結構（結構（m m7 7G G5 5 pppppp5 5 NmpNp-NmpNp-）；）； （4 4）分子內部的核苷酸甲基化修飾。）分子內部的核苷酸甲基化修飾。 2 2、tRNAtRNA前體的加工：前體的加工： 原核與真核生物的原核與真核生物的tRNAtRNA轉錄后都需轉錄后都需 要加工。要加工。 3 3、 rRNArRNA前體的加工：前體的加工： 原核與真核生物的原核與真核生物的rRNArRNA轉錄后也都需要

23、進行加工。轉錄后也都需要進行加工。 原核：剛轉錄的原核：剛轉錄的rRNArRNA為為30S30S，先在特定的堿基上進行，先在特定的堿基上進行 甲基化（核糖甲基化（核糖2 2 - -羥基）修飾，后逐步裂解。羥基）修飾，后逐步裂解。 真核：真核：45S45S（哺乳動物）、（哺乳動物）、38S38S（果蠅）、（果蠅）、37S37S（酵母）（酵母） tRNAs are cleaved from transcripts of rRNA operons 三、蛋白質的翻譯三、蛋白質的翻譯 1、遺傳密碼、遺傳密碼 (genetic code): DNA（或（或mRNA）中核苷酸序列與蛋白質中氨）中核苷酸序列與

24、蛋白質中氨 基酸序列之間的對應關系?；嵝蛄兄g的對應關系。 2、密碼子、密碼子(codon)： mRNA上每上每3個相鄰核苷酸編碼多肽鏈中一個氨基個相鄰核苷酸編碼多肽鏈中一個氨基 酸，這三個核苷酸稱一個密碼子或三聯體密碼。酸，這三個核苷酸稱一個密碼子或三聯體密碼。 （一）遺傳密碼兩個概念（一）遺傳密碼兩個概念 3、 遺傳密碼字典遺傳密碼字典 mRNA：蛋白質的蛋白質的DNA序列信息的中間體。序列信息的中間體。 tRNA：運送特定氨基酸到核糖體上合成蛋白質。運送特定氨基酸到核糖體上合成蛋白質。 rRNA：核糖體的組成元件。核糖體的組成元件。 （二）蛋白質合成中使用的（二）蛋白質合成中使用的RN

25、A 1、mRNA 是蛋白質合成的模板 原核生物原核生物mRNA與真核生物與真核生物mRNA結構比較結構比較 核糖體可以不從核糖體可以不從mRNAmRNA上解離連續合成三個蛋白質上解離連續合成三個蛋白質 Eukaryotic mRNA Prokaryotic mRNA 2、 tRNA 轉運活化的氨基酸至mRNA模板上 有有20種分子轉換器，每種氨基酸一個種分子轉換器，每種氨基酸一個 3、 rRNA 核糖體是蛋白質合成的工廠 核糖體得到分離后，發現含有核糖體得到分離后，發現含有RNA，即稱，即稱 rRNA。 （三）核糖體大小亞基的生物學功能（三）核糖體大小亞基的生物學功能 小亞基：小亞基： 通過密碼子與反密碼子的配對，識別并通過密碼子與反密碼子的配對，識別并結合模板結合模板 mRNAmRNA，蛋白質合成中，蛋白質合成中A A位、位、P P位、位、E E位的一部分等。位的一部分等。 大亞基：大亞基： 結合多肽鏈結合多肽鏈，催化肽鍵形成、蛋白質合成中，催化肽鍵形成、蛋白質合成中A A位、位、 P P位、位、E E位的一部分等。位的一部分等。 mRNA結合部位；結合部位； 結合結合AA-tRNA部位（部位（A位）；位）； 結合肽基結合肽基 tRNA部位（部位（P位）；位）； 空載空載tRNA移出部位（移出部位（E位）；位）