1、化妝品微生物標準檢驗方法細菌總數測定及注解化妝品微生物標準檢驗方法細菌總數測定及注解中華人民共和國國家標準化妝品微生物標準檢驗方法細菌總數測定 udc 668：576 .85.07(gb7918.287)standard methods of microbiological examination for cosmetics standard plate count細菌總數系指1g或1ml化妝品中所含的活菌，數量。測定細菌總數可用來判明化妝品被細菌污染的程度，以及生產單位所用的原料、工具設備、工藝流程、操作者的衛生狀況，是對化妝品進行衛生學評價的綜合依據。本標準采用標準平板計數法。1 方法提要

2、化妝品中污染的細菌種類不同，每種細菌都有它一定的生理物質性，培養時對營養要求，培養溫度、培養時間、ph值、需氧性質等均有所不同。在實際工作中，不可能做到滿足所有菌的要求，因此所測定的結果，只包括在本方法所使用的條件下（在卵磷脂、吐溫80營養瓊脂上，于37培養48h)生長的一群嗜中溫的需氯及兼性厭氧的細菌總數。2 培養基和試劑2.1 生理鹽水：見gb 7918-87化妝品微生物標準檢驗方法 總則。2.2 卵磷脂、吐溫80-營養瓊脂培養基成分： 蛋白胨 20g牛肉膏 3g氯化鈉 5g瓊脂 15g卵磷脂 1g吐溫80 7g蒸餾水 1000ml制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80將

3、其他成分(除瓊脂外)加到其余蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80，混勻，調ph值為7.17.2，加入瓊脂，121(15 1b)20min高壓滅菌，儲存于冷暗處備用。3 儀器3.1 錐形燒瓶。3.2 量筒。3.3 ph計或精密ph試紙。3.4 高壓消毒鍋。3.5 試管。3.6 滅菌平皿：直徑9cm。3.7 滅菌刻度吸管：10ml、2ml、1ml。3.8 酒精燈。3.9 恒溫培養箱。3.10 放大鏡。4 操作步驟4.1 用滅菌吸管吸取1:10稀釋的檢樣2ml，分別注入到兩個滅菌平甲內，每皿1ml。另取1ml注入到9ml滅菌生理鹽水試管中(注意勿使吸管接觸液面)，更換一支吸管，并充分混勻，使

4、成1:100稀釋液。吸取2ml,分別注入到兩個滅菌平皿內，每皿1ml。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000，1:10000，等，每種稀釋度應換1支吸管。4.2 將熔化并冷至4550的卵磷脂、吐溫80、營養瓊脂培養基傾注平皿內，每皿約15ml，另傾注一個不加樣品的滅菌空平皿，作空白對照。隨即轉動平皿，使樣品與培養基充分混合均勻，待不瓊脂凝固后，翻轉平皿，置37培養箱內培養48h。5 菌落計數方法先用肉眼觀察，點數菌落數，然后再用放大510倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數后。求出同一稀釋度各平皿生長的平均菌落數。若平皿中有連成片狀的菌落或花點樣菌落蔓延生長時，該平皿不宜計數。若片狀

5、菌落不到平皿中的一半，面其余一半中菌落數分布又很均勻，則可將此半個平皿菌落計數后乘2，以代表全皿菌落數。6 菌落計數及報告方法6.1 首先選取平均菌落數在30300之間的平皿，作為菌落總數測定的范圍。當只有一個稀釋度的平均菌落數符合此范圍時，即以該平皿菌落數乘其稀釋倍數（見表中例）。6.2 若有兩個稀釋度，其平均菌落數均在30300個之間，則應求出兩者菌落總數之比值來決定。若其比值小于或等于2應報告其平均數，若大于2則報告其中較小的菌落數(見表中例2及例3)。6.3 若所有稀釋度的平均菌落數均大于300個，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見表中例4)。6.4 若所有稀釋度的平均

6、菌落數均少于30個，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見表中例5)。6.5 若所有稀釋度的平均菌落數均不在30300個之間，其中一個稀釋度大于300個，而相鄰的另一稀釋度小于30個時，則以接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見表中例6)。6.6 若所有的稀釋度均無菌生長，報告數為每克或每毫升小于10個。6.7 菌落計數的報告，菌落數在10以內時，按實有數值報告之，大于100時，采用二位有效數字，在二位有效數字后面的數值，應以四舍五入法計算。為了縮短數字后面零的個數，可用10的指數來表示(見下表報告方式欄)。在報告菌落數為“不可計”時，應注明樣品的稀釋度。細菌計數結果及

7、報告方法例次不同稀釋度的平均菌落數兩稀釋度菌數之比菌落總數個/g或個/ml報告方式個/g或個/ml10110-210311365164201640016000或1.610422760296461.63800038000或3.810432890271602.22710027000或2.71044不可計4650513-523000510000或5.1105527115-270270或2.71026不可計30512-3050031000或3.1104附加說明：本標準由中國預防醫學科學院環境衛生監測所歸口。本標準由“化妝品微生物標準檢驗方法”起草小組起草。本標準主要起草人周淑玉。本標準由中國預防醫學科

8、學院環境衛生監測所負責解釋注解:（1）操作注意事項1）盡量使菌細胞分散開，使每個菌細胞生成一個菌落，否則將會導致重大的技術誤差。2）制成供試液后，應盡快稀釋，注皿。一般稀釋后應在1小時內操作完畢。3）注意抑菌現象。由于防腐劑未被中和，往往使平板計數結果受影響，如低稀釋時菌落少。而高釋釋度時菌落數反而增大。4) 對照試驗。化妝品的稀釋液（特別是1:1o的稀釋液）常帶有化妝品顆粒，有時與菌落很難區分，為了避免與細菌菌落發生混淆，可作一個檢樣稀釋液與瓊脂混合的平板，不經培養放到4環境中，以便計數檢樣菌落時用作對照。另一種防止化妝品顆粒與菌落混淆的方法是培養基中加ttc（2）細菌總數其他測定法1) 改

9、良的細菌總數測定法一ttc法化妝品一般由多種物質混合而成，在進行細菌測定前雖然經過處理，但有時還會存在極難溶解的顆粒,特別是粉類化妝品和某些膏霜類化妝品。化妝品在前處理時有氣泡產生，顆粒和氣泡容易與細菌菌落相混，影響計數的準確性。方法：在已熔化的卵磷脂吐-80營養瓊脂中，按100ml加入1m1 0.5的氯化三苯四氮唑（2,3,5 triphenyi terazoloride ，ttc）水溶液之量加入，操作方法同標準法。培養后如系化妝品的顆粒，不見變化，如為細菌，則生成紅色菌落。配好的含ttc培養基，應先用未加ttc的對照，以觀察其計數是否有不利影響（ttc在一定濃度下對革蘭氏陽性菌有抑制作用）

10、。ttc溶液要放冷暗處保存，以防受熱與光照而發生分解。ttc溶液在使用前應在水浴中煮沸半小時。原理：無色的ttc是作為受氫體加入培養基中，如果有細菌存在，培養后在細菌脫氫酶的作用下，ttc便接受氫而成為紅色的三苯基甲*（*表示月、牙、牙和日組成的字，因無此字）（fomazan），使菌落呈現紅色，其反應式見結構圖：2）平板表面涂布法將培養基制成平板，經干燥后，于其上滴加檢樣稀釋液0.2ml，用“l形玻璃棒涂布于整個平板的表面，放置片刻（約10分鐘）將平板翻轉，放入37溫箱內培養48小時，取出進行菌落計數，然后乘以5，即為1ml稀釋樣中的菌落數，再乘以稀釋倍數，即得每克（或每毫升）檢樣所含菌落數。

11、此法的優點：菌落生長在表面，便于識別和檢查其形態，與檢樣中的顆粒易區別；細菌不必遭受融化瓊脂的熱力，不致因此而使細菌細胞受到損傷而不生長。此法缺點：取樣量較傾注法少，代表性將受到一定的影響；本來只有0.2ml的量又被 “l”棒蘸去部分，使菌落數受影響。（3）菌落計數及報告注意事項1）如果稀釋度大的平板上菌落數反比稀釋度小的平板上菌落數高，有兩種可能性：一是檢驗工作中發生差錯；二是受防腐劑影響。這二種情況均不可用作檢樣計數報告的依據。2）如果平板上出現鏈狀菌落，菌落之間沒有明顯的界限，這是在瓊脂與檢樣混合時，一個細胞塊被分散所造成。一條鏈作為一個菌落計，如有來源不同的幾條鏈，每條鏈應作為一個菌落計，不要把鏈上生長的各個菌落分開來數。此外，如皿內瓊脂凝固后未及時進行培養而遭受昆蟲侵入，在昆蟲爬過的地方也會出現鏈狀菌落，也不應分開來數。3）如果所有平板上都菌落密布，不要用多不可計報告，而應在稀釋最大的平板上，任意數其中兩個平方厘米中的菌落數，除以2求出lcm2內平均菌落數，乘以皿底面積63.6cm2，再乘以其稀釋倍數。以此結果作報告，例如：10-110-3稀釋度的所有平板上均菌落密布，而在10-3稀釋度的平板上任意數兩個平方厘米內的菌落數是60個，皿底直徑為9cm，則該檢樣每克（或ml）中“估計”菌落數為：602