1、中山大學附屬第一醫院腎內科實驗室 免疫熒光通用操作規程 冰凍切片的免疫熒光 1, 動物組織直接OCT包埋，或灌流后的組織30%蔗糖溶液4C過夜 后，OCT包埋。-20C保存3月，-80C長期保存。請勿保存于液氮。 2, 冰凍切片機切片至少10um,空氣干燥2分鐘后，-20C儲存 3, 切片從-20取出后，在通風櫥放10-30分鐘以去除水汽，4%PFA 固定15分鐘，或-20 C丙酮固定15分鐘置通風櫥2小時 4, 1XPBS清洗玻片，3X5min從此請保持玻片濕潤 5, 有時，抗原修復3小時會得到更好的結果。為此請：選用穩定的 抗原修復方式（真空負壓微波修復高壓修復隔水加熱電爐加熱） 關注修復

2、的溫度，時間（抗原修復時在有效的溫度范圍內所持續的 時間），抗原修復液必須遵循自然降溫規律，使用足量的抗原修復液 選擇不同PH值的修復液（A液 枸鹽酸緩沖液 PH6.0, B液 EDTA-Na緩沖液PH8.0,C液枸鹽酸緩沖液PH4.5） 6, 室溫圭寸閉1小時 封閉液：5%BSA+10%二抗種屬來源的正常血清 in 1xPBS 條件封閉液：1%BSA+3%二抗種屬來源的正常血清in 1xPBS （細 胞因子，無需圭封閉的蛋白 7, 一抗4C過夜 請用圭寸閉液稀釋一抗 8, 第二天 Wash,1XPBS, 2x1min 9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （dyeligh

3、t ）in 封閉液，避光室 溫1小時 10, Wash,1XPBS, 3x5mi n 11, DAPI 染核 5min , 12, DDW Rinse 13, 抗淬滅劑封片，（避免氣泡）避光置于通風櫥過夜 14, 干片后4C保存 石蠟切片的免疫熒光 1, 動物組織取出后經固定-脫水-包埋（見隨后操作步驟），制成石蠟 包塊 2, 組織學染色切片厚度 2um,免疫熒光染色切片厚度至少6um, 切片復水： 58 C 20mi n- xyle ne 2x10mi n- 100%EtoH2x10mi n 95%EtoH2x10mi n- 70%EtoH10mi n-, DDW5mi n 4, Rinse

4、玻片IxPBS,從此請保持玻片濕潤 5, 抗原修復過夜。為此請： 選用穩定的抗原修復方式 （真空負壓. 微波修復高壓修復隔水加熱電爐加熱）關注修復的溫度，時間 （抗原修復時在有效的溫度范圍內所持續的時間），抗原修復液必須 遵循自然降溫規律，使用足量的抗原修復液 選擇不同PH值的修復 液（A液枸鹽酸緩沖液 PH6.0, B液EDTA-Na緩沖液PH8.0, C液 枸鹽酸緩沖液PH4.5） 6, 室溫圭寸閉1小時 封閉液：5%BSA+10%二抗種屬來源的正常血清 in IxPBS 條件封閉液：1%BSA+3%二抗種屬來源的正常血清in 1xPBS （細 胞因子，無需圭封閉的蛋白 7, 一抗4C過夜

5、 請用封閉液稀釋一抗，如果沒有二抗種屬來源的正常血清，細胞 因子用1%BSA封閉，同時一定要有一個陰性對照。 8, 第二天 Wash,1XPBS, 2x1min 9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （ Dyelight ）in 封閉液，避光室 溫1小時 10, Wash,1XPBS, 3x5mi n 11, DDW Rinse , DAPI 染核 5min, 12, DDW Rinse 13, 抗淬滅劑封片，（避免氣泡）避光置于通風櫥過夜 14, 干片后4C保存 備注: 多重熒光染色原則 A:盡量選擇不同種屬來源的一抗：可同時染 B:如果種屬來源相同的一抗：可順次染色，

6、抗原修復：0/N 第一個一抗：4C O/N ,第二天對應二抗 RT 1hr紅光 短暫地封閉 第二個一抗：RT 2hr,對應二抗RT 1hr綠光 DAPI 封片 備注：對照實驗 A:陰性對照：組織免疫熒光必做 相同標本：只加熒光二抗：排除非特異性染色 不同樣本：采用確定不含一抗對應抗原的標本驗證熒光信號的特異性 B :陽性對照：采用確定含有一抗對應抗原的標本 TUNEL與免疫熒光共染時 細胞的免疫熒光 1, 細胞生長貼壁到80%融合，倒掉細胞培養液 2, Rinse,用固定劑rinse 到兩次 3, 首選 4%多聚甲醛固定 15min , 0.2%TritonX-100 打孔 5-10min;

7、或者選用不同的固定方式： 甲醇（分析純 or HPLC）-20C 10min 丙酮（HPLC）-20 C 10min 4%多聚甲醛 +0.2%TritonX-100 10min 4%多聚甲醛+0.2%Sap onin slOmin細胞核核膜 4%多聚甲醛15min + -20C甲醇5min細胞膜 4%多聚甲醛15min + -20C丙酮5min細胞骨架/微管蛋白 4%多聚甲醛10min RT+4 C 10min+ -20C甲醇1min細胞膜+胞漿蛋白+ 細胞核 4, Wash,1xPBS,2x1min從此請保持細胞濕潤 5, 室溫圭寸閉1小時 封閉液：5%BSA+10%二抗種屬來源的正常血清 in 1xPBS 條件封閉液：1%BSA+3%二抗種屬來源的正常血清in 1xPBS 6, 一抗4C過夜 請用圭封閉液稀釋一抗 7, 第二天 Wash,1XPBS, 2x1min 8, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （Dyelight ）in