1、（三）熒光分析 熒光效率主要與物質的結構有關，具有熒光效率主要與物質的結構有關，具有-共軛共軛 結構的物質才能產生較強的熒光，共軛結構加長，結構的物質才能產生較強的熒光，共軛結構加長， 熒光增強。熒光增強。 含有黃酮、恩醌、香豆素、木脂素成分的生藥，含有黃酮、恩醌、香豆素、木脂素成分的生藥， 一般具有較強的熒光反應。一般具有較強的熒光反應。 5/3/2021 1 5/3/20212 熒光分析法在生藥鑒定中的應用熒光分析法在生藥鑒定中的應用 定性分析定性分析 紫外分析儀法紫外分析儀法 日光法日光法 熒光顯微鏡法熒光顯微鏡法 熒光光譜法熒光光譜法 1、觀察生藥整體、觀察生藥整體 2、觀察生藥的新鮮

2、斷面或飲片、觀察生藥的新鮮斷面或飲片 3、觀察生藥粉末、觀察生藥粉末 4、直接觀察生藥的某種溶劑浸、直接觀察生藥的某種溶劑浸 出液出液 5、將生藥提取液滴于濾紙上，、將生藥提取液滴于濾紙上， 揮干溶劑觀察揮干溶劑觀察 6、生藥提取液與化學試劑作用、生藥提取液與化學試劑作用 后產生熒光后產生熒光 7、多重觀察、多重觀察 定量分析：熒光分光光度法、薄層熒光掃描法 分光光度法是通過測定被測物質在某些特定波長處分光光度法是通過測定被測物質在某些特定波長處 或一定波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性或一定波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性 和定量分析的方法。和定量分析的方法。 p紫外分光光度法紫外

3、分光光度法 p可見分光光度法可見分光光度法 p紅外分光光度法紅外分光光度法 p原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法 5/3/2021 3 （四）分光光度法 一切物質都會對可見光及不可見光中的某些波長的一切物質都會對可見光及不可見光中的某些波長的 光線產生吸收。不過其吸收的程度是不同的。即物質對不光線產生吸收。不過其吸收的程度是不同的。即物質對不 同波長的光線表現出不同的吸收能力，物質的這一特性稱同波長的光線表現出不同的吸收能力，物質的這一特性稱 為選擇吸收。為選擇吸收。 物質對光線的選擇吸收反映了它們分子內部結構物質對光線的選擇吸收反映了它們分子內部結構 的差異。也就是說，通過研究物質得分子吸

4、收光譜，就可的差異。也就是說，通過研究物質得分子吸收光譜，就可 以鑒別物質的分子結構。這是分光光度法對生藥進行定性以鑒別物質的分子結構。這是分光光度法對生藥進行定性 鑒別的依據。鑒別的依據。 物質吸收光子能量的強度，不僅取決于物質的分子物質吸收光子能量的強度，不僅取決于物質的分子 結構，而且還與被光子所作用的物質的分子數目，即物質結構，而且還與被光子所作用的物質的分子數目，即物質 的濃度有關。這是分光光度法對生藥進行定量鑒別的依據的濃度有關。這是分光光度法對生藥進行定量鑒別的依據 。 5/3/20214 分光光度法在生藥定性分析中的應用分光光度法在生藥定性分析中的應用 原理：同種生藥的光譜具有

5、一定的穩定性及重現性不同原理：同種生藥的光譜具有一定的穩定性及重現性不同 種類生藥的光譜各不相同種類生藥的光譜各不相同 方法：方法：UVUV分光光度法分光光度法 比較光譜的一致性（與對照藥材比較；比較光譜的一致性（與對照藥材比較； 與文獻標準光譜核對）與文獻標準光譜核對） 比較導數光譜的一致性（用于比較導數光譜的一致性（用于UVUV光譜光譜 不易區分）不易區分） 比較光譜的特征吸收（常用特征數據：比較光譜的特征吸收（常用特征數據： 最大吸收波長和吸光度比值最大吸收波長和吸光度比值 ） 電子光譜，輻射波長電子光譜，輻射波長200-200- 400nm400nm，儀器為，儀器為UVUV分光光度分光

6、光度 計選擇性不如計選擇性不如 IRIR。主要用。主要用 于定量及物理常數測定于定量及物理常數測定 5/3/20215 5/3/20216 IR分光光度法 5/3/2021 7 振轉光譜，輻射波長振轉光譜，輻射波長2.5 - 15m2.5 - 15m。具特征峰多、專。具特征峰多、專 屬性強（特別是在屬性強（特別是在 7-15m7-15m一段稱指紋圖譜，峰多一段稱指紋圖譜，峰多 且尖銳）、用試樣量少快速簡便。用于生藥真偽鑒且尖銳）、用試樣量少快速簡便。用于生藥真偽鑒 別及結構鑒定。別及結構鑒定。 方法：方法： u 1、樣品的處理：直接粉末法、溶劑提取法 u 2、制片：壓片法、涂片法 u 3、光譜

7、分析：不需要確定光譜中各主要吸收峰 的歸屬， 只在只在4000-400cm 4000-400cm 范圍內比較光譜的差異。范圍內比較光譜的差異。 u A、在某一波數處，一方有明顯吸收峰，另一 方無。 u B、在某一波數內，兩吸收峰的形狀強度有明顯 不同。 u C、被鑒別雙方在指紋區的特征不同。 上述三種，只要有其中一種就可做出鑒別結論上述三種，只要有其中一種就可做出鑒別結論 （五）色譜法 (TLC, GC, HPLC,指紋 圖譜) 色譜法又稱層析法，是一種對混合物進行分離和分色譜法又稱層析法，是一種對混合物進行分離和分 析的物理化學方法，也是生藥化學成分分離和鑒別析的物理化學方法，也是生藥化學成

8、分分離和鑒別 的重要方法之一。的重要方法之一。 根據色譜分離原理分類可分為吸附色譜、分配色譜、根據色譜分離原理分類可分為吸附色譜、分配色譜、 離子交換色譜與排阻色譜等。離子交換色譜與排阻色譜等。 根據色譜分離方法分類可分為紙色譜法、薄層色譜根據色譜分離方法分類可分為紙色譜法、薄層色譜 法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。 5/3/2021 8 （五）色譜法 (TLC, GC, HPLC, 指紋圖譜) u常用以下三種色譜法： 薄層色譜法(TLC) 氣相色譜法(GC) 高效液相色譜法(HPLC) 5/3/2021 9 薄層色譜薄層色譜 操作：選擇

9、吸附劑操作：選擇吸附劑 制備薄層板制備薄層板 點樣點樣 定性參數的選測定定性參數的選測定 顯色顯色 展開展開 （比移值（比移值Rf、相對比移值、相對比移值Rst） 應用：定性分析應用：定性分析 定量分析定量分析 5/3/202110 以以RfRf做定性的依據，因影響做定性的依據，因影響RfRf因素多，需用標準因素多，需用標準 對照品作對照。在兩種或兩種以上展開系統種展開，對照品作對照。在兩種或兩種以上展開系統種展開， 若樣品中斑點的若樣品中斑點的RfRf值與標準對照品的值與標準對照品的RfRf值勻相同可基值勻相同可基 本肯定二者為同一化合物。本肯定二者為同一化合物。 定性鑒別定性鑒別 用標準物

10、用標準物 質對照別質對照別 標準標準 對照品對照品 對照藥材對照藥材 用相對比用相對比 移值鑒別移值鑒別 用文字描用文字描 述鑒別述鑒別 原點中心至斑點原點中心至斑點 中心的距離中心的距離 Rst = 原點中心至參考原點中心至參考 物質斑點中心的距離物質斑點中心的距離 5/3/202111 5/3/202112 定量鑒別定量鑒別 n分兩類： n一是將待測物從薄層板洗拖后，選擇適宜的 方法測定（洗脫法）； n二是薄層展開后，用薄層掃描儀在薄層板上 測定被分離組分的含量（薄層掃描法）。 n洗脫法分四步進行： n待測組分的分離 n斑點定位 n斑點的收集及洗脫 n測定（多采用UV及可見光分光度法） 5

11、/3/202113 （五）色譜法 (TLC, GC, HPLC, 指紋圖譜) 薄層掃描法：薄層掃描法： u波長的選擇（樣品波長、參比波長） u測定方式的確立（透射、反射、熒光） u掃描方式（直線式、鋸齒式） u標準曲線線性化（與散射參數有關，硅膠薄層板 SX=3，氧化鋁薄層板SX=7） u定量前需考察的主要內容：工作曲線、精密度、準 確度 u測定方法：外標一點法，外標二點法。 5/3/2021 14 HPLCHPLC 可用于定性和定量，色譜圖中各色譜峰的保留時可用于定性和定量，色譜圖中各色譜峰的保留時 間、色譜峰相對百分峰面積及主要色譜峰的間、色譜峰相對百分峰面積及主要色譜峰的UVUV吸收吸收

12、 光譜，均可作為生藥真實性鑒定的指紋資料。光譜，均可作為生藥真實性鑒定的指紋資料。 是生是生 藥及制劑質量分析常用的方法。藥及制劑質量分析常用的方法。 （五）色譜法 (TLC, GC, HPLC, 指紋圖譜) 5/3/2021 15 （五）色譜法 (TLC, GC, HPLC, 指紋圖譜) GCGC 主要用于含揮發性成分的定性和定量。用于鑒定的主要用于含揮發性成分的定性和定量。用于鑒定的 數據主要是保留時間、相對百分峰面積。常常和質數據主要是保留時間、相對百分峰面積。常常和質 譜聯用，快速鑒定成分譜聯用，快速鑒定成分 5/3/2021 16 5、DNA分子遺傳標記鑒定 生藥傳統的四大鑒定方法在

13、藥材的真偽鑒別、生藥傳統的四大鑒定方法在藥材的真偽鑒別、 品種鑒定上發揮著重要作用品種鑒定上發揮著重要作用,但是對于一些近緣但是對于一些近緣 種、種與亞種、變種、種內變異的藥材就很難種、種與亞種、變種、種內變異的藥材就很難 準確鑒定。而分子遺傳標記作為一種先進的遺準確鑒定。而分子遺傳標記作為一種先進的遺 傳標記技術，表現出其相對于傳統遺傳標記的傳標記技術，表現出其相對于傳統遺傳標記的 巨大優勢。國內外學者采用分子生物學技術對巨大優勢。國內外學者采用分子生物學技術對 許多難鑒定藥材的鑒定做了大量研究工作許多難鑒定藥材的鑒定做了大量研究工作,取得取得 了許多進展。了許多進展。 DNA分子鑒定是分子

14、鑒定是20世紀世紀90年代中后期開始的年代中后期開始的 新技術，主要用于解決形態特征破壞或鑒定非新技術，主要用于解決形態特征破壞或鑒定非 常困難；同屬多來源藥材（人參和西洋參）的常困難；同屬多來源藥材（人參和西洋參）的 鑒別，道地藥材（同一物種，不同產地如冬蟲鑒別，道地藥材（同一物種，不同產地如冬蟲 夏草、金銀花、人參夏草、金銀花、人參 ）的鑒別等。）的鑒別等。 5/3/2021 17 5、DNA分子遺傳標記鑒定 比較物種間比較物種間DNADNA分子的遺傳多樣性的差異鑒別物種。分子的遺傳多樣性的差異鑒別物種。 DNADNA分子是由分子是由G G、A A、C C、T T四種堿基構成，為雙螺旋四種

15、堿基構成，為雙螺旋 結構的長鏈分子，生物體特定的遺傳信息便包含在特結構的長鏈分子，生物體特定的遺傳信息便包含在特 定的堿基排列順序中，不同物種遺傳上的差異表現在定的堿基排列順序中，不同物種遺傳上的差異表現在 這這4 4種堿基排列順序的變化，這就是生物的遺傳多樣種堿基排列順序的變化，這就是生物的遺傳多樣 性性（Genetic diversity)。 5/3/2021 18 5、DNA分子遺傳標記鑒定 （一）（一）DNADNA分子鑒定方法的特點：分子鑒定方法的特點： u1、遺傳物質穩定：每一個體的任一體細胞均含有相 同的遺傳信息。能最準確的鑒別物種。 u生藥生藥 DNA 分子遺傳標記鑒定是指通過比

16、較生藥間分子遺傳標記鑒定是指通過比較生藥間 DNA 分子遺傳多樣性差異來鑒別生藥基源，確定其分子遺傳多樣性差異來鑒別生藥基源，確定其 學名的方法。學名的方法。DNA 是絕大多數生物是絕大多數生物 ( 除少數病毒外除少數病毒外 ) 的遺傳物質。的遺傳物質。 u2、遺傳多樣性：能根據四種堿基排列順序的變化區 分物種之間非常微小的差異。如道地藥材與非道地藥 材。 u3、化學穩定性、不易分解：能保證試驗檢測材料的 獲得。 在陳舊標本中所保存下來的DNA仍能夠用于 DNA分子遺傳標記的研究。 5/3/2021 19 （二）（二） DNA分子標記方法分子標記方法 限制性內切酶酶切片段長度多態性限制性內切酶

17、酶切片段長度多態性(RFLP)(RFLP) 聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應(PCR)(PCR) 隨機擴增多態性隨機擴增多態性DNA(RAPD)DNA(RAPD)和任意引物和任意引物PCR(AP-PCR(AP- PCR) PCR) PCRPCR擴增的特定片段的限制行位點分析擴增的特定片段的限制行位點分析(PCR-RFLP)(PCR-RFLP)、 RAPD-RFLPRAPD-RFLP DNADNA測序方法測序方法 5/3/2021 20 PCR (Polymerase chain reaction) PCR fragments Interested DNA sequences Primer Prim

18、er Extracts Genomic DNA DNA sequencing 尋找特征性基因尋找特征性基因 PCR-RFLP DNA Chip Diagnostic PCR PCR (Polymerase chain reaction) PCR fragments Interested DNA sequences Primer Primer Extracts Genomic DNA DNA sequencing 尋找特征性基因尋找特征性基因 PCR-RFLP DNA Chip Diagnostic PCR PCR (Polymerase chain reaction) Interested D

19、NA sequences Primer Primer Extracts Genomic DNA TCM materials DNA sequencing 尋找特征性基因尋找特征性基因 PCR-RFLP DNA Chip Diagnostic PCR DNA分子鑒定的具體方法舉例分子鑒定的具體方法舉例 5/3/202121 PCR fragments 5、DNA分子遺傳標記鑒定 1 1、DNADNA提取技術提取技術 DNA DNA 的提取是現代生物技術進行中藥鑒別的最的提取是現代生物技術進行中藥鑒別的最 關鍵步驟?？傟P鍵步驟。總 DNA DNA 的有效提取要求材料中的的有效提取要求材料中的 DN

20、A DNA 盡可能少的降解。但用于生藥真實性鑒別的藥材在盡可能少的降解。但用于生藥真實性鑒別的藥材在 干燥、加工、貯藏等過程中均造成了干燥、加工、貯藏等過程中均造成了 DNA DNA 不同程不同程 度的降解，一般度的降解，一般 DNA DNA 的含量也比較低。另外藥材的含量也比較低。另外藥材 中次生代謝產物含量較高和可能有微生物引起的外中次生代謝產物含量較高和可能有微生物引起的外 源源 DNA DNA 的污染干擾提取。的污染干擾提取。 5/3/2021 22 DNA提取技術 從植物藥材中提取從植物藥材中提取 DNA DNA 一般可分為兩個階段一般可分為兩個階段 第一階段是植物細胞破裂后釋放出第

21、一階段是植物細胞破裂后釋放出 DNA DNA 。若不能。若不能 破碎所有的細胞或者在破碎細胞過程中破碎所有的細胞或者在破碎細胞過程中 DNA DNA 不能不能 得到保護，得到保護， DNA DNA 的完整性和最后得率都會大大降的完整性和最后得率都會大大降 低。低。 第二階段是第二階段是 DNA DNA 與其它細胞組分如蛋白質、碳水與其它細胞組分如蛋白質、碳水 化合物、膜和細胞壁相分離，在這個階段，重要的化合物、膜和細胞壁相分離，在這個階段，重要的 是要保證大量的是要保證大量的 DNA DNA 不能混雜在細胞碎片中，不能混雜在細胞碎片中， DNA DNA 要與蛋白質和其它污染物完全分離，因為這些

22、要與蛋白質和其它污染物完全分離，因為這些 污染物的存在會干擾下一步的分析。污染物的存在會干擾下一步的分析。 5/3/2021 23 對于幼嫩器官的材料，一般方法都可以得到質量符合對于幼嫩器官的材料，一般方法都可以得到質量符合 要求的要求的 DNA 。但對于中藥材，情況則要復雜得多，。但對于中藥材，情況則要復雜得多， 需要針對具體材料，設計合適的試劑盒進一步純化需要針對具體材料，設計合適的試劑盒進一步純化 DNA 。常用的。常用的 DNA 提取方法主要有提取方法主要有 CTAB 法、法、 高鹽低高鹽低 pH 法、尿素法和試劑盒提取等方法。法、尿素法和試劑盒提取等方法。 DNA 的質量將直接關系到

23、實驗的成敗。不同的的質量將直接關系到實驗的成敗。不同的 研究目的對研究目的對 DNA 的純度和量的要求不盡相同。一般的純度和量的要求不盡相同。一般 而言，所得的而言，所得的 DNA 應完整、有足夠的量，電泳檢查應完整、有足夠的量，電泳檢查 時可給出精確性高、重復性好的遷移帶型，此外，還時可給出精確性高、重復性好的遷移帶型，此外，還 應滿足下游操作的要求，如用于應滿足下游操作的要求，如用于 PCR 分析的分析的 DNA 不應含干擾不應含干擾 PCR 反應的污染物。反應的污染物。 5/3/202124 2、選擇特一性的限制性酶 生物在進化過程中，由于種種原因引起的基因突變生物在進化過程中，由于種種

24、原因引起的基因突變 和和 DNA DNA 分子結構重排，造成了分子內核苷酸排列分子結構重排，造成了分子內核苷酸排列 順序的改變，在一處或幾處發生某種差異，當這種順序的改變，在一處或幾處發生某種差異，當這種 改變（即使是很小的改變）涉及到限制性酶切位點改變（即使是很小的改變）涉及到限制性酶切位點 時，酶切后產生的時，酶切后產生的 DNA DNA 片段長度將發生變化，即片段長度將發生變化，即 限制性酶譜的條帶方式將出現不同，產生多態性。限制性酶譜的條帶方式將出現不同，產生多態性。 5/3/2021 25 18S r DNA ITS ITS Spacer region ASAS-1 5S-rRNA

25、Coding region Coding region 在高等植物中， 5SDNA是編碼5S核 糖體RNA的多拷貝 基因，以串聯重復 的形式存在，每個 重復單位包括一個 大約120bp的編碼 區和長度在 100700bp之間的 轉錄間隔區 5/3/202126 5、DNA分子遺傳標記鑒定 3 3、PCRPCR擴增技術擴增技術 聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction (polymerase chain reaction ， PCR) PCR) 是是 80 80 年代中期發展起來的體外核酸擴增技術，年代中期發展起來的體外核酸擴增技術， 是一種模擬自然是一

26、種模擬自然 DNA DNA 復制過程的體外酶促合成特復制過程的體外酶促合成特 異性核酸片段技術。它以待擴增的兩條異性核酸片段技術。它以待擴增的兩條 DNA DNA 鏈為鏈為 模板，由一對人工合成的寡核苷酸作為介導，通過模板，由一對人工合成的寡核苷酸作為介導，通過 DNA DNA 聚合酶促反應，在體外進行特異聚合酶促反應，在體外進行特異 DNA DNA 序列擴序列擴 增。由于在每一循環中合成的引物延伸產物可作為增。由于在每一循環中合成的引物延伸產物可作為 下一循環中的模板，因而每次循環中靶下一循環中的模板，因而每次循環中靶 DNA DNA 的拷的拷 貝數幾乎呈幾何級數增長。貝數幾乎呈幾何級數增長

27、。 5/3/2021 27 PCR 技術具有特異、敏感、產率高、快速、簡 便、重復性好、易自動化等優點；能在一個離 心管內將所要研究的目的基因或某一 DNA 片 段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍，在溴化 乙錠染色及電泳后，肉眼能直接觀察和判斷； 可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增 出足量的 DNA 供分析研究和檢測鑒定。 5/3/202128 5、DNA分子遺傳標記鑒定 4 4、DNA DNA 序列測定序列測定 生藥的生藥的 DNA DNA 測序鑒定就是運用測序鑒定就是運用 DNA DNA 測序技術建測序技術建 立正品藥材及相關混偽品的原動植物的基因序列數立正品藥材及相關混偽品的原動植物

28、的基因序列數 據庫，用同樣的方法對待檢測樣品進行測序，對照據庫，用同樣的方法對待檢測樣品進行測序，對照 數據庫即可鑒定出中藥材的真偽。該方法重現性好，數據庫即可鑒定出中藥材的真偽。該方法重現性好， 鑒定結果準確可靠。但是，實際應用中，采用全序鑒定結果準確可靠。但是，實際應用中，采用全序 列比對的方法比較麻煩，為此又在序列測定的基礎列比對的方法比較麻煩，為此又在序列測定的基礎 上發展了更加簡便的上發展了更加簡便的 PCR PCR 擴增的特定片段的限制性擴增的特定片段的限制性 位點分析（位點分析（ PCR-RFLP PCR-RFLP ）和位點特異性鑒別）和位點特異性鑒別 PCR PCR 方方 法（

29、法（ diagnostic PCR diagnostic PCR ）。）。 5/3/2021 29 5、DNA分子遺傳標記鑒定 5/3/2021 30 DNADNA分子鑒定在生藥學研究中應用分子鑒定在生藥學研究中應用 在在 DNA DNA 分子上，有編碼與物種存活密切相關的基分子上，有編碼與物種存活密切相關的基 因區域、編碼與物種存活不十分密切相關的基因區因區域、編碼與物種存活不十分密切相關的基因區 域和非編碼基因區域。域和非編碼基因區域。 基因組基因組 DNA DNA 的這些不同區域在生物進化過程中所的這些不同區域在生物進化過程中所 受到的選擇壓力不同，前者所受選擇壓力大，表現受到的選擇壓力

30、不同，前者所受選擇壓力大，表現 出高度保守，后者所受選擇壓力小，表現出較大的出高度保守，后者所受選擇壓力小，表現出較大的 變異。變異。正是由于這種正是由于這種 DNA DNA 分子不同區域承受的選分子不同區域承受的選 擇壓力不同，使得擇壓力不同，使得 DNA DNA 分子的不同區域有不同程分子的不同區域有不同程 度的遺傳多樣性。度的遺傳多樣性。 因此，我們能夠選擇適當的因此，我們能夠選擇適當的 DNA DNA 分子遺傳標記，分子遺傳標記， 在屬、種、亞種、居群或個體水平上對研究對象進在屬、種、亞種、居群或個體水平上對研究對象進 行準確地鑒別。行準確地鑒別。 DNA分子鑒定在生藥學研究中 應用

31、1 1、鑒定近緣生藥品種、鑒定近緣生藥品種 如如WenWen等對人參屬等對人參屬1212種植物的種植物的ITSITS區和區和5.8S-rRNA5.8S-rRNA基基 因進行了序列分析因進行了序列分析, ,結果區分出這結果區分出這1212種在植物形態特種在植物形態特 征上非常一致的不同種類植物，而且還利用征上非常一致的不同種類植物，而且還利用ITSITS序列序列 證明了它們之間的親緣關系遠近。證明了它們之間的親緣關系遠近。 國內外學者運用國內外學者運用RAPDRAPD、RFLPRFLP、AFLPAFLP等分子標記法等分子標記法 對淫羊藿屬、黃芪屬、木藍屬、黃連屬、山麥冬屬、對淫羊藿屬、黃芪屬、木

32、藍屬、黃連屬、山麥冬屬、 貝母屬、栝樓屬、鐵線蓮屬、香茶菜屬、姜黃屬、貝母屬、栝樓屬、鐵線蓮屬、香茶菜屬、姜黃屬、 蒼術屬、大麻屬、沙參屬、紫蘇屬、天南星屬、百蒼術屬、大麻屬、沙參屬、紫蘇屬、天南星屬、百 合屬、澳茄屬、萵苣屬、柑橘屬等藥用植物進行了合屬、澳茄屬、萵苣屬、柑橘屬等藥用植物進行了 較為系統的研究。較為系統的研究。 5/3/2021 31 DNA分子鑒定在生藥學研究中 應用 5/3/2021 32 2 2、鑒定名貴易混淆生藥品種、鑒定名貴易混淆生藥品種 珍稀名貴中藥是祖國傳統醫藥寶庫的精粹之一珍稀名貴中藥是祖國傳統醫藥寶庫的精粹之一, , 同時亦是生藥品種混亂及偽劣藥材的高頻區。不

33、少同時亦是生藥品種混亂及偽劣藥材的高頻區。不少 珍稀品種如冬蟲夏草、番紅花、金釵石斛、麝香、珍稀品種如冬蟲夏草、番紅花、金釵石斛、麝香、 穿山甲、犀角、虎骨、天然牛黃、天然熊膽、蛤士穿山甲、犀角、虎骨、天然牛黃、天然熊膽、蛤士 螞、海馬、玳瑁等來源有限螞、海馬、玳瑁等來源有限, ,采用采用DNADNA分子遺傳標記分子遺傳標記 技術鑒定技術鑒定, ,取樣量少取樣量少, ,避免了貴重樣品的損耗避免了貴重樣品的損耗, ,即使從動即使從動 植物生物標本上直接取樣也不會造成標本整體的破植物生物標本上直接取樣也不會造成標本整體的破 壞壞, ,因而具有獨到的優勢。因而具有獨到的優勢。 u如 Fushimi等

34、通過變異等位基因擴增技術(MASA)對matK 基因片段測序發現,人參與西洋參、竹節參間的matK基因片 段上第102號核苷酸序列不同,以此來鑒別人參、西洋參,結 果非?？煽俊?u 陳月琴等采用末端終止法對杜仲大分子rRNA基因 (25SrDNA)5端基因進行測序,根據序列中核苷酸的變化可 有效地鑒別杜仲與其它相關類群。 DNA分子鑒定在生藥學研究中 應用 3 3、鑒定動物類生藥品種、鑒定動物類生藥品種 DNADNA分子遺傳標記技術不僅能對有形的動物藥整分子遺傳標記技術不僅能對有形的動物藥整 體及破碎部分器官組織進行準確的鑒定體及破碎部分器官組織進行準確的鑒定, ,而且而且對以動對以動 物粉末

35、、體液、分泌物和排泄物入藥的生藥及制劑物粉末、體液、分泌物和排泄物入藥的生藥及制劑 進行有效的真偽鑒定、純度檢查與質量評價進行有效的真偽鑒定、純度檢查與質量評價, ,如龜鱉如龜鱉 膠囊、純蛇粉、鹿血粉、犀角粉、水牛角粉和麝香膠囊、純蛇粉、鹿血粉、犀角粉、水牛角粉和麝香 等。等。 l 如王義權等將RAPD標記技術用于蛇類動物的分類學研 究和鑒定,結果表明RAPD標記技術不僅能夠用于蛇類動 物種間系統演化、種內個體間遺傳多樣性,并且可以用 于蛇類藥材的鑒定。 l吳平等應用RAPD分析能有效地鑒定海馬類藥材。 5/3/2021 33 DNA分子鑒定在生藥學研究中 應用 4 4、鑒定藥材道地性、鑒定藥

36、材道地性 道地性藥材的質量、療效、產量等受到所在道地性藥材的質量、療效、產量等受到所在 地的限制的原因是植物的遺傳物質地的限制的原因是植物的遺傳物質DNADNA及初生的和次及初生的和次 生代謝過程中的酶系統發生了道地性的變化。生代謝過程中的酶系統發生了道地性的變化。因道因道 地性藥材與非道地性藥材是同種，二者在形態和生地性藥材與非道地性藥材是同種，二者在形態和生 藥性狀等特征上差別不明顯，給鑒別帶來困難，采藥性狀等特征上差別不明顯，給鑒別帶來困難，采 用用DNADNA分子遺傳技術并輔以等位酶技術，可以從分子分子遺傳技術并輔以等位酶技術，可以從分子 水平區分道地性藥材。水平區分道地性藥材。 如：

37、肖小河研究表明如：肖小河研究表明,RAPD,RAPD技術不僅能正確鑒別技術不僅能正確鑒別 姜黃屬姜黃屬不同種間群體不同種間群體, ,而且對種內等級亦能進行有效而且對種內等級亦能進行有效 的刻劃的刻劃, ,可作為姜黃屬藥用植物的分類鑒定與道地性可作為姜黃屬藥用植物的分類鑒定與道地性 評價的新手段。評價的新手段。 5/3/2021 34 劉玉萍等用劉玉萍等用PCR直接測序對直接測序對6個不同產地的個不同產地的廣藿廣藿 香香之之matK基因和基因和18SrRNA基因進行測序分析研究基因進行測序分析研究, 結果表明結果表明,廣藿香廣藿香6個樣本間的個樣本間的matK基因存在基因存在47個變個變 異位點

38、異位點, 18SrRNA基因存在基因存在17個變異位點個變異位點,結合有關結合有關 揮發油化學組成數據揮發油化學組成數據,為廣藿香的物種鑒定和道地性評為廣藿香的物種鑒定和道地性評 價提供分子依據價提供分子依據. 李萍等對不同產地李萍等對不同產地浙貝母和金銀花浙貝母和金銀花不同居群的不同居群的 5SrRNA基因基因ITS區的片段進行擴增和測序區的片段進行擴增和測序,結果表明結果表明 不同產地或居群的同種樣品不同產地或居群的同種樣品5SrRNA 基因基因ITS區具有區具有 相同的基因型相同的基因型,其種內差異遠小于種間的遺傳距離其種內差異遠小于種間的遺傳距離. 5/3/202135 F.unibr

39、acteata F.cirrhosa F.przewalskii 浙貝母浙貝母 5/3/202136 F.thunbergii 金銀花存在明顯的道地性，同一物種金銀花存在明顯的道地性，同一物種 產地不同質量差異明顯產地不同質量差異明顯 37 5/3/2021 金銀花道地 藥材的鑒定 DNA分子鑒定在生藥學研究中 應用 5/3/2021 38 4 4、鑒定野生與家種、鑒定野生與家種( (養養) )生藥生藥 由于生態環境改變和人們生產活動的影響由于生態環境改變和人們生產活動的影響, ,生物生物 的遺傳特性及其生藥品質在一定程度上產生了變化，的遺傳特性及其生藥品質在一定程度上產生了變化， 以栽培品冒

40、充野生品的現象時有發生以栽培品冒充野生品的現象時有發生, ,給臨床使用及給臨床使用及 商品流通造成混亂。栽培品和野生品都來自同一個商品流通造成混亂。栽培品和野生品都來自同一個 物種物種, ,植物形態、藥材性狀、化學成分、生物活性等植物形態、藥材性狀、化學成分、生物活性等 往往無明顯差異。往往無明顯差異。DNADNA分子遺傳標記技術因不受藥分子遺傳標記技術因不受藥 材的生境條件等因素的影響材的生境條件等因素的影響, ,在野生藥材與其栽培品在野生藥材與其栽培品 的比較研究方面具有良好的應用前景的比較研究方面具有良好的應用前景, ,如野山參與園如野山參與園 參的參的DNADNA分子標識鑒別、栽培姜黃

41、與野生姜黃的鑒分子標識鑒別、栽培姜黃與野生姜黃的鑒 別、野生天麻與栽培天麻等。別、野生天麻與栽培天麻等。 DNA分子鑒定在生藥學研究中 應用 5 5、鑒定特殊藥材、鑒定特殊藥材 當今人們從自然界獲取藥物的來源越來越多當今人們從自然界獲取藥物的來源越來越多, ,而而 且來源越來越復雜且來源越來越復雜, ,生藥不再局限于傳統生藥的形式生藥不再局限于傳統生藥的形式, , 如人工發酵產品如人工發酵產品( (如冬蟲夏草和靈芝菌絲體等如冬蟲夏草和靈芝菌絲體等) )、海、海 洋湖泊生物洋湖泊生物( (魚類、海藻類、螺旋藻類、軟體動物類魚類、海藻類、螺旋藻類、軟體動物類 等等) )、土壤微生物類等已成為新一輪

42、天然藥物研究與、土壤微生物類等已成為新一輪天然藥物研究與 開發的熱點開發的熱點, ,將大大豐富祖國醫藥寶庫將大大豐富祖國醫藥寶庫; ;與此同時與此同時, ,生生 藥新人工代用品藥新人工代用品( (如水牛角代犀牛角等如水牛角代犀牛角等) )以及新生摻以及新生摻 偽品不斷涌現偽品不斷涌現, ,給生藥鑒定帶來新的問題。采用給生藥鑒定帶來新的問題。采用DNADNA 分子遺傳標記技術能夠在分子水平對任何來源的生分子遺傳標記技術能夠在分子水平對任何來源的生 藥樣品進行分析鑒定藥樣品進行分析鑒定, ,且不受形態、來源等因素的影且不受形態、來源等因素的影 響響, ,對來源于生物工程的樣品同樣可以進行分析鑒定。

43、對來源于生物工程的樣品同樣可以進行分析鑒定。 5/3/2021 39 DNA分子鑒定在生藥學研究中 應用 6 6、鑒定中藥原粉制劑、鑒定中藥原粉制劑 絕大部分中成藥是經過化學提取而制成的不含絕大部分中成藥是經過化學提取而制成的不含 原生藥的中藥制劑。但傳統劑型如散劑、丸劑及現原生藥的中藥制劑。但傳統劑型如散劑、丸劑及現 代劑型袋泡茶、片劑、膠囊等中成藥仍含部分或微代劑型袋泡茶、片劑、膠囊等中成藥仍含部分或微 量生藥如玉屏風散、大活絡丸等量生藥如玉屏風散、大活絡丸等, ,有的甚至為全原生有的甚至為全原生 藥藥, ,如龜鱉膠囊、純蛇粉、鹿血粉等。如龜鱉膠囊、純蛇粉、鹿血粉等。由于中成藥的由于中成藥

44、的 組成及成分復雜性組成及成分復雜性, ,干擾因素多、用傳統生藥學方法干擾因素多、用傳統生藥學方法 鑒定上述含生藥中藥制劑或鑒定全原生藥制劑的真鑒定上述含生藥中藥制劑或鑒定全原生藥制劑的真 偽及純度存有較大的難度偽及純度存有較大的難度,DNA,DNA分子遺傳標記不僅能分子遺傳標記不僅能 準確地鑒別中成藥中的微量生藥成分準確地鑒別中成藥中的微量生藥成分, ,而且有效地檢而且有效地檢 測全原生藥制劑純度及質量。測全原生藥制劑純度及質量。 因而因而DNADNA分子遺傳標記技術在中成藥鑒別與質量研分子遺傳標記技術在中成藥鑒別與質量研 究方面具有良好的應用前景。究方面具有良好的應用前景。 5/3/202

45、1 40 如：如：RAPDRAPD標記技術首次用于復方中藥制劑的研究是標記技術首次用于復方中藥制劑的研究是 對對玉屏風散中黃芪、白術、防風玉屏風散中黃芪、白術、防風3 3味生藥的檢查味生藥的檢查, ,作者作者 首先從首先從400400個寡核苷酸隨機引物中篩選個寡核苷酸隨機引物中篩選RAPDRAPD引物引物 OPP-10,OPP-10,含有含有3 3組分的制劑總組分的制劑總DNADNA分子以分子以OPP-10OPP-10為引為引 物的物的RAPDRAPD增產物能夠分別標記這增產物能夠分別標記這3 3個組分個組分 ,200bpDNA,440bpDNA,500bpDNA,200bpDNA,440bpDNA,500bpDNA分子標記分別是分子標記分別是 黃芪、白術、防風黃芪、白術、防風3 3組分的特殊組分的特殊DNADNA片段片段, ,由此由此3 3個組個組 分得以檢出。分得以檢出。 Hakamat-sukaHakamat-suka等運用定量等運用