1、第八章第八章 酶定向進化酶定向進化 天然酶的局限 v天然酶的穩(wěn)定性差天然酶的穩(wěn)定性差, ,活性低使催化效率很低活性低使催化效率很低, ,還還 缺乏有商業(yè)價值的催化功能缺乏有商業(yè)價值的催化功能 v天然酶的局限性源于酶的自然進化過程天然酶的局限性源于酶的自然進化過程. 現(xiàn)代生物工程的要求現(xiàn)代生物工程的要求 v能具備長期穩(wěn)定性和活性能具備長期穩(wěn)定性和活性 能適用于水及非水相環(huán)境能適用于水及非水相環(huán)境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底 物物 能夠在特殊環(huán)境中合成和拆分制作新藥物或藥物能夠在特殊環(huán)境中合成和拆分制作新藥物或藥物 的原材料的原材料 v如何

2、利用相對簡單的方法以達到對天然酶的改造 或構(gòu)建新的非天然酶就顯得非常有研究意義和應(yīng) 用前景. v1993年年,美國科學(xué)家美國科學(xué)家Arnold F H首先提出酶分首先提出酶分 子的定向進化的概念子的定向進化的概念,并用于天然酶的改造或并用于天然酶的改造或 構(gòu)建新的非天然酶構(gòu)建新的非天然酶. 酶分子定向進化酶分子定向進化 v簡稱酶定向進化，是模擬自然進化過程（隨 機突變和自然選擇），在體外進行酶基因的 人工隨機突變，建立突變基因文庫，在人工 控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有 優(yōu)良催化特征的酶的突變體的技術(shù)過程。 酶定向進化的基本過程 v隨機突變、構(gòu)建突變基因文庫、定向選擇 v酶定向進化的基

3、本過程： 酶基因酶基因 隨機突變隨機突變 構(gòu)建突變基因文庫構(gòu)建突變基因文庫 篩選篩選 負突變基因負突變基因 正突變基因正突變基因進化酶進化酶 反復(fù)進行反復(fù)進行 第一節(jié)第一節(jié) 酶定向進化的特點酶定向進化的特點 1 .1 .適應(yīng)面廣適應(yīng)面廣 v不需了解酶的結(jié)構(gòu)信息，因此稱為非理性化 設(shè)計。 2. 2. 目的性強目的性強 3. 3. 效果顯著效果顯著 第二節(jié)第二節(jié) 酶基因的隨機突變酶基因的隨機突變 v體外隨機突變的方法：體外隨機突變的方法：PCRPCR技術(shù)、技術(shù)、DNADNA重排重排 技術(shù)、基因家族重排技術(shù)技術(shù)、基因家族重排技術(shù) v基因隨機突變方法的特點基因隨機突變方法的特點P207P207表表8

4、81 1 一 易錯PCR技術(shù) v可以通過提高鎂離子濃度、添加一定濃度的可以通過提高鎂離子濃度、添加一定濃度的 錳離子、改變錳離子、改變4 4種底物（種底物（dAMPdAMP、dTMPdTMP、 dCMPdCMP、dGMPdGMP）的濃度比等反應(yīng)條件，使）的濃度比等反應(yīng)條件，使 DNADNA聚合酶在催化基因擴增時，增加堿基配聚合酶在催化基因擴增時，增加堿基配 對錯誤的出現(xiàn)頻率，而引起基因突變。對錯誤的出現(xiàn)頻率，而引起基因突變。 特點 v正突變的概率低，突變基因文庫較大，文庫正突變的概率低，突變基因文庫較大，文庫 篩選的工作量大，一般適用于較小基因的定篩選的工作量大，一般適用于較小基因的定 向進化

5、。向進化。 實例 v枯草桿菌蛋白酶:洗滌劑合成、鞣革和醫(yī)藥領(lǐng)域的重 要工業(yè)酶制劑。 vChen 等采用易錯PCR 對該酶進行了體外進化研究。 他們通過降低反應(yīng)體系中dATP 的濃度, 對編碼該酶 從第49 位氨基酸到C 端的DNA 片段進行易錯PCR , 經(jīng)篩選得到的幾個突變株在高濃度的二甲基甲酰胺 (DMF) 中酶活性明顯提高 v突變體PC3 在60 %的DMF 中, 酶活力是野生型的 256 倍。將PC3 再進行兩個循環(huán)的定向進化, 得到的 突變體13M酶活力比PC3 還要高3 倍。 二二 DNADNA重排技術(shù)重排技術(shù) v概念：又稱為概念：又稱為DNADNA改組技術(shù)，是從正突變改組技術(shù)，是

6、從正突變 基因文庫中分離得到的同源基因文庫中分離得到的同源DNADNA，用酶切，用酶切 割成隨機片斷，經(jīng)過不加引物的多次割成隨機片斷，經(jīng)過不加引物的多次PCRPCR循循 環(huán)，使環(huán)，使DNADNA的堿基序列重新排布而引起基的堿基序列重新排布而引起基 因突變的技術(shù)過程。因突變的技術(shù)過程。 DNA重排技術(shù)的基本過程重排技術(shù)的基本過程 兩條以上正突變基因兩條以上正突變基因 DNADNA隨機片斷隨機片斷 突變基因突變基因 構(gòu)建突變基因文庫構(gòu)建突變基因文庫 篩選篩選 負突變基因負突變基因 正突變基因正突變基因進化酶進化酶 酶切酶切 （反復(fù)進行）（反復(fù)進行） 無引物無引物PCRPCR 基因重組基因重組 酶切

7、酶切 三基因家族重排技術(shù)三基因家族重排技術(shù) v又稱為基因家族改組技術(shù)，是從基因家族又稱為基因家族改組技術(shù)，是從基因家族 的若干同源基因出發(fā)，用酶的若干同源基因出發(fā)，用酶(DNase )(DNase )切割切割 成隨機片斷，經(jīng)過不加引物的多次成隨機片斷，經(jīng)過不加引物的多次PCRPCR循環(huán)，循環(huán)， 使使DNADNA的堿基序列發(fā)生重新排布而引起基的堿基序列發(fā)生重新排布而引起基 因突變的技術(shù)過程。因突變的技術(shù)過程。 基因家族重排技術(shù)的基本過程基因家族重排技術(shù)的基本過程 基因家族若干同源基因基因家族若干同源基因 酶切酶切 DNADNA隨機片斷隨機片斷 突變基因突變基因 突變基因文庫突變基因文庫 基因重組

8、基因重組 篩選篩選 負突變基因負突變基因 正突變基因正突變基因 進化酶進化酶 無引物無引物PCRPCR 酶切酶切 反復(fù)進行反復(fù)進行 DNADNA家族重排技術(shù)與家族重排技術(shù)與DNADNA重排技術(shù)的異同點重排技術(shù)的異同點 v相同點：相同點：DNADNA家族重排技術(shù)與家族重排技術(shù)與DNADNA重排技術(shù)的過程重排技術(shù)的過程 大致相同，都要經(jīng)過基因的隨機切割、無引物大致相同，都要經(jīng)過基因的隨機切割、無引物PCRPCR 等步驟以獲得突變基因，然后經(jīng)過構(gòu)建突變基因文等步驟以獲得突變基因，然后經(jīng)過構(gòu)建突變基因文 庫、采用高通量篩選技術(shù)篩選獲得正突變基因。庫、采用高通量篩選技術(shù)篩選獲得正突變基因。 v不同點：不

9、同點： DNADNA家族重排技術(shù)從基因家族的若干同源家族重排技術(shù)從基因家族的若干同源 基因出發(fā)進行基因出發(fā)進行DNADNA序列的重新排布，而后者則從采序列的重新排布，而后者則從采 用易錯用易錯PCRPCR等技術(shù)所獲得的兩個以上的正突變基因等技術(shù)所獲得的兩個以上的正突變基因 出發(fā)進行出發(fā)進行DNADNA序列的重新排布。序列的重新排布。 第三節(jié)第三節(jié) 酶突變基因的定向選擇酶突變基因的定向選擇 v突變基因的定向選擇基本過程突變基因的定向選擇基本過程 突變基因突變基因基因載體基因載體 突變基因文庫突變基因文庫 基因重組基因重組 篩選篩選 目的基因目的基因 一、構(gòu)建突變基因文庫的主要過程一、構(gòu)建突變基因

10、文庫的主要過程 v載體的選擇載體的選擇 1 1）質(zhì)粒載體：微生物細胞染色體外，閉合環(huán)狀雙鏈）質(zhì)粒載體：微生物細胞染色體外，閉合環(huán)狀雙鏈 DNADNA分子。分子。 2 2）噬菌體）噬菌體DNADNA載體：由噬菌體載體：由噬菌體DNADNA改造而成的具有改造而成的具有 自我復(fù)制能力的載體。自我復(fù)制能力的載體。 3 3）黏粒載體：是一類人工構(gòu)建的含有）黏粒載體：是一類人工構(gòu)建的含有DNADNA黏性末黏性末 端和質(zhì)粒復(fù)制子的質(zhì)粒載體，又稱為柯斯質(zhì)粒。端和質(zhì)粒復(fù)制子的質(zhì)粒載體，又稱為柯斯質(zhì)粒。 4 4）噬菌粒載體：是一類人工構(gòu)建的由）噬菌粒載體：是一類人工構(gòu)建的由M13M13噬菌體單噬菌體單 鏈鏈DNA

11、DNA的基因間隔區(qū)與質(zhì)粒載體結(jié)合而成的基因載的基因間隔區(qū)與質(zhì)粒載體結(jié)合而成的基因載 體。體。 基因重組基因重組 在體外通過在體外通過DNADNA連接酶的作用，將基因與載體連接酶的作用，將基因與載體 連接在一起形成重組連接在一起形成重組DNADNA的技術(shù)過程。的技術(shù)過程。 黏性末端連接黏性末端連接 平頭末端連接平頭末端連接 修飾末端連接修飾末端連接 形成基因文庫形成基因文庫 將重組將重組DNADNA轉(zhuǎn)入受體細胞或包裝成有感染活性轉(zhuǎn)入受體細胞或包裝成有感染活性 的噬菌體的過程。的噬菌體的過程。 重組質(zhì)粒載體：轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒載體：轉(zhuǎn)化 重組噬菌體重組噬菌體DNADNA載體：需要用噬菌體外殼蛋白載體：需

12、要用噬菌體外殼蛋白 將重組將重組DNADNA進行包裝，稱為有感染活性的重進行包裝，稱為有感染活性的重 組噬菌體，而形成基因文庫。組噬菌體，而形成基因文庫。 二、突變基因的篩選二、突變基因的篩選 （一）（一）定向選擇環(huán)境條件的設(shè)定定向選擇環(huán)境條件的設(shè)定 （1 1）提高酶的穩(wěn)定性，高溫篩選重組細胞，每一次）提高酶的穩(wěn)定性，高溫篩選重組細胞，每一次 突變篩選的循環(huán)中逐步提高重組細胞的培養(yǎng)溫突變篩選的循環(huán)中逐步提高重組細胞的培養(yǎng)溫 度。度。 （2 2）如果定向進化的目的是提高）如果定向進化的目的是提高內(nèi)酰胺酶的活內(nèi)酰胺酶的活 性，從而提高對性，從而提高對內(nèi)酰胺酶類抗生素的耐受性，內(nèi)酰胺酶類抗生素的耐受

13、性， 可以通過在含有一定濃度的可以通過在含有一定濃度的內(nèi)酰胺酶類抗生素內(nèi)酰胺酶類抗生素 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組細胞，并在每一次突變篩的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組細胞，并在每一次突變篩 選循環(huán)中逐步提高抗生素的濃度。選循環(huán)中逐步提高抗生素的濃度。 （二）高通量篩選技術(shù)（二）高通量篩選技術(shù)P217P217表表8 82 2 1. 1.平板篩選法平板篩選法 v平板篩選法所依據(jù)的重組細胞的表型包括細平板篩選法所依據(jù)的重組細胞的表型包括細 胞生長情況、顏色變化情況、透明圈情況。胞生長情況、顏色變化情況、透明圈情況。 1 1）依據(jù)細胞生長情況篩選突變基因）依據(jù)細胞生長情況篩選突變基因 在提高酶的熱穩(wěn)定性、抗生素耐受性、在

14、提高酶的熱穩(wěn)定性、抗生素耐受性、pHpH穩(wěn)穩(wěn) 定性和對其他極端環(huán)境條件的耐受能力等方定性和對其他極端環(huán)境條件的耐受能力等方 面有廣泛應(yīng)用。面有廣泛應(yīng)用。 2 2）依據(jù)顏色變化篩選突變基因）依據(jù)顏色變化篩選突變基因 （1 1）在采用噬菌體）在采用噬菌體DNADNA載體構(gòu)建突變基因文庫時，載體構(gòu)建突變基因文庫時， 可以用大腸桿菌可以用大腸桿菌半乳糖苷酶的基因片斷半乳糖苷酶的基因片斷 （lacZlacZ）插入到噬菌體）插入到噬菌體DNADNA的間隔區(qū)域中，當(dāng)它的間隔區(qū)域中，當(dāng)它 感染了相應(yīng)的大腸桿菌宿主細胞時，在含有感染了相應(yīng)的大腸桿菌宿主細胞時，在含有IPTGIPTG和和 底物底物X Xgalga

15、l的平板培養(yǎng)基上可以形成藍色噬菌斑。的平板培養(yǎng)基上可以形成藍色噬菌斑。 （2 2）在對磷酸酯酶進行定向進化的過程中，可以在）在對磷酸酯酶進行定向進化的過程中，可以在 平板培養(yǎng)基中加入硝基酚磷酸，接種重組細胞培養(yǎng)平板培養(yǎng)基中加入硝基酚磷酸，接種重組細胞培養(yǎng) 一段時間后，有些重組細胞周圍出現(xiàn)黃色（硝基一段時間后，有些重組細胞周圍出現(xiàn)黃色（硝基 酚）。酚）。 3）依據(jù)透明圈情況篩選突變基因）依據(jù)透明圈情況篩選突變基因 依據(jù)透明圈情況篩選突變基因是在平板培養(yǎng)依據(jù)透明圈情況篩選突變基因是在平板培養(yǎng) 基中加入目的酶的作用底物，然后接種重組基中加入目的酶的作用底物，然后接種重組 細胞，在一定條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時細胞，在一定條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時 間后，在一些重組細胞的菌落周圍會出現(xiàn)較間后，在一些重組細胞的菌落周圍會出現(xiàn)較 大的透明圈。大的透明圈。 自自 學(xué)學(xué) 2. 2.熒光篩選法熒光篩選法 3.3.噬菌體表面展示法噬菌體表面展示法 4.4.酵母細胞表面展示法酵母細胞表面展示法 第四節(jié)第四節(jié) 酶定向進化的應(yīng)用酶定向進化的應(yīng)用 vP221表表83，總結(jié)應(yīng)用，總結(jié)應(yīng)用 一、提高酶的催化效率一、提高酶的催化效率 二、增加酶的穩(wěn)定性二、增加酶的穩(wěn)定性 三、改變酶的底物特異性三、改變酶的底物特異性 提高酶分子的催化活力 v例如，吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點實 驗室張今教授