1、第二章 PCR技術原理及其應用 PCR (Polymerase Chain Reaction) 聚合鏈式反應聚合鏈式反應 Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization. Peoples Choice Reaction 一、PCR技術簡史 DNA的復制 聚合酶鏈反應的發明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 53 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 35 解旋酶 解鏈酶 DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 PCR技術簡史 DNA的復制 聚合酶鏈反應的發明 ATCGCGATAGCGT

2、AGCTGCGACCTAGC 53 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 35 DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 GGAUCG 5 AUCGCG 5 引物酶 引物酶 RNA引物 RNA引物 PCR技術簡史 DNA的復制 聚合酶鏈反應的發明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 53 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 35 DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 GGAUCG 5 AUCGCG 5 TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3 ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG 3 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 PCR技術簡

3、史 DNA的復制 聚合酶鏈反應的發明 19711971年，年，KhoranaKhorana美國美國MITMIT教授、教授、19681968年年 諾貝爾醫學獎得主提出：經過諾貝爾醫學獎得主提出：經過DNADNA變性，變性， 與合適引物雜交，用與合適引物雜交，用DNADNA聚合酶延伸引物，聚合酶延伸引物， 并不斷重復該過程便可克隆并不斷重復該過程便可克隆tRNAtRNA基因。基因。 但由于測序和引物合成的困難，以及但由于測序和引物合成的困難，以及7070 年代基因工程技術的發明使克隆基因成年代基因工程技術的發明使克隆基因成 為可能，所以，為可能，所以，KhoranaKhorana的設想被人們遺的設

4、想被人們遺 忘了忘了 Kary Mullis(1985)Kary Mullis(1985) 發明過程發明過程 Mullis Mullis 在在“偶然想出的聚合酶鏈反應偶然想出的聚合酶鏈反應”一文中寫到一文中寫到: : “這種簡單得令人驚奇，可以無限量地拷貝這種簡單得令人驚奇，可以無限量地拷貝DNADNA片段的片段的 方法是在不可想象的情況下，方法是在不可想象的情況下， 即駕車行駛在月色下的加即駕車行駛在月色下的加 利福尼亞山間公路上時想出來的利福尼亞山間公路上時想出來的”。 發展過程：發展過程： 開始使用大腸桿菌開始使用大腸桿菌 DNADNA聚合酶聚合酶KlenowKlenow片段，該酶不片段

5、，該酶不 耐熱，每次加熱變性耐熱，每次加熱變性DNADNA后都要重新補加。耗時、費力、后都要重新補加。耗時、費力、 易出錯。耐熱易出錯。耐熱DNADNA聚合酶的應用使得自動化聚合酶的應用使得自動化。 PCR技術簡史 DNA的復制 聚合酶鏈反應的發明 19851985年，美國年，美國PE-CetusPE-Cetus公司的公司的MullisMullis等人發明了聚合酶等人發明了聚合酶 鏈反應（鏈反應（PCRPCR） 基本原理是在試管中模擬細胞內的基本原理是在試管中模擬細胞內的DNADNA復制復制 最初采用最初采用E-coli DNAE-coli DNA聚合酶進行聚合酶進行PCRPCR，由于該酶不耐

6、熱，由于該酶不耐熱， 使這一過程耗時，費力，且易出錯使這一過程耗時，費力，且易出錯 耐熱耐熱DNADNA聚合酶的應用使得聚合酶的應用使得PCRPCR能高效率的進行，隨后能高效率的進行，隨后PE-PE- CetusCetus公司推出了第一臺公司推出了第一臺PCRPCR自動化熱循環儀自動化熱循環儀 19931993年，年，MullisMullis等因此項技術獲諾貝爾化學獎等因此項技術獲諾貝爾化學獎 引物引物 引物引物 專利官司專利官司 19871987年美國專利局專利授權年美國專利局專利授權 19891989年，年，DuPontDuPont異議，大小公司對簿公堂，將決定誰將獲異議，大小公司對簿公堂

7、，將決定誰將獲 得諾貝爾獎。得諾貝爾獎。DuPontDuPont理由是，理由是，19711971年年PCRPCR的雛形已由的雛形已由 KhoranaKhorana一系列文章闡明，并公布于眾，應當是公共產權。一系列文章闡明，并公布于眾，應當是公共產權。 斯坦福大學斯坦福大學KornbergKornberg（研究（研究DNADNA聚合酶獲諾貝爾獎）也認為，聚合酶獲諾貝爾獎）也認為， 任何具備生物技術知識的人都可以從任何具備生物技術知識的人都可以從KhoranaKhorana等的文章中推等的文章中推 知如何操作知如何操作PCRPCR。 美國專利局駁回美國專利局駁回DuPontDuPont異議，地方法

8、院判屬異議，地方法院判屬CetusCetus。CetusCetus 獲勝后馬上反訴，指出獲勝后馬上反訴，指出DuPontDuPont已侵犯另一項與已侵犯另一項與 PCRPCR有關的有關的 專利并要求對方賠償以及不再銷售與專利并要求對方賠償以及不再銷售與PCRPCR有關試劑和儀器。有關試劑和儀器。 根據ABI（美國應用生物系統公司）和Roche（羅氏） 的協議，PCR專利可分為方法專利和儀器專利，ABI 得到儀器專利，Roche掌握方法專利。 在應用領域，Roche的勢力范圍是診斷、親子鑒定、獸醫； ABI爭到的領地包括研發，質控、法醫、環境、農業等。 對于科研人員來說，主要關注的是科研領域也就

9、是ABI 的領地。 PCR專利意味著什么？所有科研用途的儀器或者試劑的生產 商在生產銷售PCR相關產品時需要上繳專利使用費給ABI， ABI平均每年獲得的5千萬美元PCR專利版稅的來源。 () 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 二、PCR的基本原理 類似于DNA的體內復制。首先待擴增DNA模 板加熱變性解鏈，隨之將反應混合物冷卻 至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶 序列發生退火，再將溫度升高使退火引物 在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變 性-復性-延伸的過程就是一個PCR循環， PCR就是在合適條件下的這種循環的不斷 重復。 PCR Cycle

10、- Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC) Target Sequence Target Sequence PCR原理示意圖原理示意圖 模板模板DNA的變性：模板的變性：模板DNA經加熱至經加熱至93左右一定時間后，使左右一定時間后，使 模板模板DNA雙鏈或經雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，解離，使之成為單鏈， 以便它與引物結合，為下輪反應作準備；以便它與引物結合，為下輪反應作準備； PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primer

11、s anneal to target sequences Target Sequence Target Sequence Primer 1 Primer 2 5 3 5 5 3 5 3 3 模板模板DNA與引物的退火與引物的退火(復性復性)：模板：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫經加熱變性成單鏈后，溫 度降至度降至55左右，引物與模板左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；單鏈的互補序列配對結合； PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nu

12、cleotides are incorporated Target Sequence Target Sequence Primer 1 Primer 2 5 3 5 5 3 5 3 3 Taq DNA Polymerase 引物的延伸：引物的延伸： DNA模板模板-引物結引物結 合物在合物在TaqDNA聚聚 合酶的作用下，以合酶的作用下，以 dNTP為反應原料，為反應原料， 靶序列為模板，按靶序列為模板，按 堿基配對與半保留堿基配對與半保留 復制原理，合成一復制原理，合成一 條新的與模板條新的與模板DNA 鏈。鏈。 End of the 1st PCR Cycle Results in two

13、 copies of target sequence Target Sequence Target Sequence 每完成一個每完成一個 循環需循環需24 分鐘，分鐘， 23 小時就能將小時就能將 待擴目的基待擴目的基 因擴增放大因擴增放大 幾百萬倍。幾百萬倍。 Target Amplification No. ofNo. Amplicon Cycles Copies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8

14、Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon 三、PCR反應 PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點 標準的PCR反應條件： 10X10X緩沖液緩沖液 10 10 L L 4 4種種dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L 引物引物 各各1010100pmol100pmol 模板模板DNA DNA 0.10.12 2 g g Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5U2.5U MgMg2+ 2+ 1.5mm

15、ol/L1.5mmol/L PCR儀 PCR反應 PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點 12345 22 55 72 94 時間（min） 溫度 （） PCR反應 PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復13步 2530輪 目的DNA片段 擴增100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復性 DNA變性 形成2條單鏈 子鏈延伸 DNA加倍 模板DNA 95 PCR的基本原理 PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點50 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點 引物1 引物2 DNA引物 72

16、 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點 72 第1輪結束 第2輪開始 PCR的基本原理 PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點 95 50 72 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點 72 第2輪結束 PCR的基本原理 PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點 重復30輪后 230=1,073,741,824 模板DNA 第1輪擴增 第2輪擴增 第3輪擴增 第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增 理想拷貝數=2n n 循環次數 實際拷貝數=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環次數 PCR反應

17、 PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點 靈敏度高靈敏度高 皮克皮克(pg=10(pg=10-12 -12) )量級擴增到微克 量級擴增到微克(ug=10(ug=10-6 -6) )水平 水平 能從能從100100萬個細胞中檢出一個靶細胞萬個細胞中檢出一個靶細胞 病毒檢測的靈敏度可達病毒檢測的靈敏度可達3 3個個RFURFU 細菌檢測的最小檢出率為細菌檢測的最小檢出率為3 3個細菌個細菌 簡便、快速簡便、快速 一次性加好反應液，一次性加好反應液，2 24 4 小時完成擴增小時完成擴增 擴增產物一般用電泳分析擴增產物一般用電泳分析 對標本的純度要求低對標本的純度要求低 u血液、體腔液、洗嗽液、

18、毛發、細胞、活組織等組織血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等組織 的粗提的粗提DNADNA 以DNA為模板的反應 反應體積：50100l 緩沖液 引物 底物：4種dNTP 模板：102105拷貝 TaqDNA聚合酶 礦物油 以mRNA為模板的反應（逆轉錄PCR） 逆轉錄反應體系 體積：20 l 緩沖液 底物：4種dNTP 引物：oligo(dT)1218 模板：RNA 逆轉錄酶 其他試劑：RNA酶抑制劑， MgCl2.DTT.牛血清白蛋白 PCR反應體系同以DNA模板的反應體系 1050mmol/L Tris-Cl 緩沖液，72 時pH7.2, 調節反應體系的pH值，使Taq DNA聚合

19、酶 的作用環境維持偏堿性。緩沖液含 50mmol/L的KCl可促進引物退火，大于此濃 度將會抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入適 量二甲基亞砜或甲酰胺有利于破壞模板的二 級結構。 （6） PCR反應的緩沖液 （五）PCR產物的積累規律 在在PCR反應中，反應中，DNA擴增過程遵循酶的催化動力學原擴增過程遵循酶的催化動力學原 理。理。反應初期，目的反應初期，目的DNA片段呈指數擴增。隨著目的片段呈指數擴增。隨著目的DNA 產物逐漸積累，擴增產物逐漸積累，擴增DNA片段的增加減慢進入相對穩定狀片段的增加減慢進入相對穩定狀 態，即出現態，即出現“停滯效應停滯效應”，又稱，又稱“平臺期平臺期”。到達平

20、臺期。到達平臺期 所需所需PCR循環次數取決于樣品中模板的拷貝數、循環次數取決于樣品中模板的拷貝數、PCR擴增擴增 效率、效率、DNA聚合酶種類和活性、以及非特異產物的競爭等聚合酶種類和活性、以及非特異產物的競爭等 因素。到達平臺期前，因素。到達平臺期前，TaqDNA聚合酶一般要進行聚合酶一般要進行25次以次以 上上PCR循環。循環。 多數情況下，平臺期在多數情況下，平臺期在PCR反應中不可避免。反應中不可避免。 PCR產物的積累規律示意 圖 （一） 引物長度在1530堿基。引物過短，會 使特異性降低。過長會提高相應的退火 溫度，且合成引物的成本增加。 引物中堿基的分布是隨機的，避免4個以 上

21、的嘌呤或嘧啶的連續排列，G+C含量宜 在 4555左右。 引物的3端不能有任何修飾，也不能有 形成任何二級結構的可能。 引物的5端限定著PCR產物的長度，可根 據產物的要求不同， 可以選用不同的引物 修飾法。 引物與非擴增序列的同源性不應超過引物與非擴增序列的同源性不應超過7070。 直接提交模板序列到特定網頁。 如：; 引物設計軟件。功能：首先是引物分析評價功能，其中以 “Oligo 6”最為優秀；其次是引物的自動搜索功能，各種 軟件在這方面的側重點不同。 （二）引物設計的方法（二）引物設計的方法 （一）瓊脂糖凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳 是是PCRPCR擴增產物的分離、純化和鑒定最常用的方

22、法。擴增產物的分離、純化和鑒定最常用的方法。 其分辨率很高，可測出其分辨率很高，可測出1ng DNA1ng DNA。一般一般800bp800bp以上的片段用以上的片段用 0.8%0.8%的膠，的膠，800bp800bp以下的片段用以下的片段用1.0%1.0%2.0%2.0%的膠。的膠。 靈敏度比瓊脂糖凝膠電泳高靈敏度比瓊脂糖凝膠電泳高，主要用于分離制備小于，主要用于分離制備小于 1kb長度的低分子質量基因片段，因此特別適用于合成長度的低分子質量基因片段，因此特別適用于合成 的基因片段的分離和檢測。適用于的基因片段的分離和檢測。適用于PCR擴增效率低時產擴增效率低時產 物的檢測。根據擴增片段的大

23、小選擇合適的膠濃度，電物的檢測。根據擴增片段的大小選擇合適的膠濃度，電 泳后可用銀染或溴乙錠染色檢測，銀染比泳后可用銀染或溴乙錠染色檢測，銀染比EB染色檢測靈染色檢測靈 敏度高敏度高210倍。倍。 （二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳 高效液相色譜高效液相色譜(HPLC)是在常壓基礎上發展起來的一是在常壓基礎上發展起來的一 項現代化分析技術，其特點是分離速度快、效果好，是目項現代化分析技術，其特點是分離速度快、效果好，是目 前基因片段分離純化所廣泛采用的方法之一。前基因片段分離純化所廣泛采用的方法之一。 離子交換層析（離子交換層析（ IEC ）的基礎是溶質分子所攜帶的）的基礎是溶質

24、分子所攜帶的 電荷，而合成的基因片段恰好具有這一性質。因此，電荷，而合成的基因片段恰好具有這一性質。因此，IEC 分析廣泛應用于分析廣泛應用于DNA的合成及其擴增后的分離純化。的合成及其擴增后的分離純化。 （三）層析技術（三）層析技術 為了確定為了確定PCR產物是否是預先設計的目的片段，或產物是否是預先設計的目的片段，或 產物是否有突變，都需做分子雜交檢測。分子雜交包括產物是否有突變，都需做分子雜交檢測。分子雜交包括 點雜交和點雜交和Southern印跡雜交。點雜交靈敏度較高，特別印跡雜交。點雜交靈敏度較高，特別 適用于特異性不高的適用于特異性不高的PCR擴增產物分析。擴增產物分析。 Sout

25、hern印跡雜交可鑒定印跡雜交可鑒定PCR產物的大小和特異性，產物的大小和特異性， 檢測靈敏度可達檢測靈敏度可達10ng。基本過程是。基本過程是PCR產物進行常規的產物進行常規的 瓊脂糖凝膠電泳，然后，印跡轉移到尼龍膜上，再用標瓊脂糖凝膠電泳，然后，印跡轉移到尼龍膜上，再用標 記的探針進行雜交檢測。記的探針進行雜交檢測。 （四）分子雜交（四）分子雜交 若知道若知道PCR擴增片段的序列或限制性內切酶酶切圖譜，則擴增片段的序列或限制性內切酶酶切圖譜，則 可選擇合適的限制酶消化可選擇合適的限制酶消化PCR產物，再進行電泳分析，根據產物，再進行電泳分析，根據 PCR酶切產物的電泳圖譜，可判定酶切產物的

26、電泳圖譜，可判定PCR產物的特異性及是否產物的特異性及是否 存在突變。存在突變。 （六）（六）PCR擴增產物的直接測序擴增產物的直接測序 直接序列分析是指在直接序列分析是指在PCR擴增基因組擴增基因組DNA序列的基礎上，序列的基礎上， 直接進行基因核苷酸序列分析的方法，是檢測基因突變最有效、直接進行基因核苷酸序列分析的方法，是檢測基因突變最有效、 最直接的方法。最直接的方法。 （五）限制性內切酶酶切分析（五）限制性內切酶酶切分析 六、PCR中應注意的事 項 （一）防止污染 試劑小量分裝 吸頭及Ep管一次性使用 器皿及工作區域要分開，無菌操作 （二）設立對照： 陽性對照：陽性模板 陰性對照：陰性

27、模板 試劑對照：除模板外的所有組分 無擴增產物 非特異性擴增 拖尾 假陽性 第二節 PCR技術應用 一、PCR技術的主要類型 反向PCR 錨定PCR 不對稱PCR 原位PCR RT-PCR 重組PCR 差異顯示PCR免疫PCR 實時定量PCR多重PCR mRNA cDNA 雜化雙鏈雜化雙鏈 逆轉錄酶 聚合酶 PCR擴增 某些病原微生物，某些遺傳病或癌基因， 型別較多，或突變或缺失存在多個好發 部位，多重PCR可提高其檢出率并同時 鑒定其型別及突變等可系統應用的有: 乙型肝炎病毒的分型;乳頭瘤病毒的分 型;單純皰疹病毒的分型;杜氏肌營養不 良癥的分型及癌基因的檢測等. 多重PCR的特點 高效性，

28、在同一PCR反應管內同時檢出多種病原微生物， 或對有多個型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可 檢測多種病原體. 系統性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病 毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰傷感染細菌 及細菌戰劑的同時偵檢. 經濟簡便性，多種病原體在同一反應管內同時檢出，將大 大的節省時間，節省試劑，節約經費開支，為臨床提供更多 更準確的診斷信息. 利用同位素、熒光素等對引物利用同位素、熒光素等對引物5 5端進行標記端進行標記, , 用以用以 直觀地檢測目的基因。直觀地檢測目的基因。 與常規與常規PCRPCR相比更為直觀，省去了限制性內切酶酶切及分子雜交相比更為直觀，省

29、去了限制性內切酶酶切及分子雜交 等繁瑣步驟，而且可同時檢測多種基因成分等繁瑣步驟，而且可同時檢測多種基因成分 特別適合大量臨床標本的基因診斷特別適合大量臨床標本的基因診斷 目前該方法只對目前該方法只對PCRPCR產物進行定性鑒定。產物進行定性鑒定。 主要用于分析具有可變末端的主要用于分析具有可變末端的DNADNA序列序列 錨定錨定PCRPCR首先合成第一鏈首先合成第一鏈cDNA,cDNA,然后再添加一同聚物尾（然后再添加一同聚物尾（ polydG),polydG),與同聚物尾配對的與同聚物尾配對的3 3錨定引物（帶有限制性內切位點錨定引物（帶有限制性內切位點 polydC)polydC)一起作

30、一起作PCRPCR擴增擴增 帶有PolyG尾巴的引物是一個固定點，它可以并與PolyG尾巴結合，無 論其余部分序列如何，只識別片段末端，利用此法可從前述mRNA中檢 出至少20種不同序列，每一種都是獨特的，表明A-PCR不對任何特殊 序列有傾向性結果，可用于T細胞、腫瘤及其它部位抗體基因的研究。 原位聚合酶鏈式反應（原位聚合酶鏈式反應（In Still PCR,IsIn Still PCR,IsPCRPCR）是由）是由HaaseHaase 等于等于19901990年首創。它是利用完整的細胞作為一個微小的反應體年首創。它是利用完整的細胞作為一個微小的反應體 系來擴增細胞內的目的片段系來擴增細胞內

31、的目的片段, ,在不破壞細胞的前提下在不破壞細胞的前提下, ,利用一些利用一些 特定的檢測手段來檢測細胞內的擴增產物。特定的檢測手段來檢測細胞內的擴增產物。 直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行 擴增。可進行細胞內定位和檢測病理切片中含量較少的靶序擴增。可進行細胞內定位和檢測病理切片中含量較少的靶序 列。列。 操作步驟操作步驟 1. 1. 細胞或組織固定：細胞經固定和乙醇通透化處理后便適于一般細胞或組織固定：細胞經固定和乙醇通透化處理后便適于一般 PCRPCR試劑（包括引物和試劑（包括引物和TaqTaq酶）進入酶）進入 2. PCR2

32、. PCR擴增細胞內目的片段擴增細胞內目的片段 3. 3. 原位雜交檢測擴增產物原位雜交檢測擴增產物 A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達 8.8.溫度梯度溫度梯度PCRPCR 1 1、概念：、概念： 通過對復性溫度比引物的通過對復性溫度比引物的TmTm值低值低2-102-10 的范圍內進行系列的范圍內進行系列PCRPCR預實驗來對復性條件預實驗來對復性條件 進行優化進行優化. . 溫度梯度曲線溫度梯度曲線 Thermal Image of 45-65C Gradient across a PTC-200 with a 96-well Alpha 溫度梯度PCR優化復性溫度 48C

33、68C Unoptimized Annealing temperature 50C Optimized Annealing Temperature 62.6C Gradient optimization of 12 different temperatures across the block, tested between 48C and 68C 9. 9. 熱啟動熱啟動PCRPCR 在聚合酶鏈反應（在聚合酶鏈反應（PCRPCR）中先將模板同引物在高于兩者變性溫度的）中先將模板同引物在高于兩者變性溫度的 條件下處理一段時間，然后再加入酶和其他成分進行擴增反應，用條件下處理一段時間，然后再加入

34、酶和其他成分進行擴增反應，用 以消除非特異性擴增產物的方式以消除非特異性擴增產物的方式 熱啟動熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性最重要特異性最重要 的方法之一。盡管的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在聚合酶的最佳延伸溫度在72，聚，聚 合酶在室溫仍然有活性。因此，在合酶在室溫仍然有活性。因此，在PCR反應試劑配制過程中，反應試劑配制過程中， 以及在熱循環剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產生非特異以及在熱循環剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產生非特異 性的產物。這些非特異性產物一旦形成，就會被有效擴增。性的產物。這些非特異性產物一旦形

35、成，就會被有效擴增。 限制限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反反 應液，并將其置于預熱的應液，并將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不儀。這種方法簡單便宜，但并不 能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產物的擴能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產物的擴 增。增。 手動熱啟動法手動熱啟動法 管底：管底：DNADNA、預冷、預冷bufferbuffer、dNTPdNTP和和dHdH2 2O O 管壁：引物管壁：引物 預熱：預熱：8080 加加TaqTaq酶，離心，開始酶，離心，開始PCRPCR循環。循環。 專用熱啟

36、動酶法專用熱啟動酶法 抗體介導的抑制抗體介導的抑制DNADNA聚合酶法聚合酶法 化學阻斷化學阻斷DNADNA聚合酶法聚合酶法 其他其他DNADNA聚合酶抑制劑法聚合酶抑制劑法 10. 10. Touch-down PCRTouch-down PCR 1 1、概念：、概念： Touch-down PCRTouch-down PCR又稱降落又稱降落PCRPCR。即選定一個溫度范圍，。即選定一個溫度范圍， 如如50-3550-35，每降，每降1-21-2進行進行1-21-2個循環，然后在個循環，然后在5050度下進度下進 行行1515個循環。個循環。 2 2、原理：、原理： 隨著退火溫度的降低，特異

37、性逐步降低，但特異性隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性 條帶在溫度較高時已經擴增出來，其濃度遠遠超過非特條帶在溫度較高時已經擴增出來，其濃度遠遠超過非特 異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優先被擴異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優先被擴 增。增。 3 3、選擇初始復性溫度的原則：、選擇初始復性溫度的原則： 起始復性溫度應該比引物的起始復性溫度應該比引物的TmTm值高出值高出5-105-10度，度， 然后每個循環遞減然后每個循環遞減1-21-2度。度。 4 4、Touch-down PCRTouch-down PCR的應用范圍的應用范圍 模板模板DNADNA濃度較低濃度較

38、低; ; 引物簡并程度高或特異性低引物簡并程度高或特異性低; ; RT-PCR RT-PCR時使用時使用oligo-dToligo-dT。 通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針, ,對對PCRPCR產物進產物進 行標記跟蹤行標記跟蹤, ,實時在線監控反應過程實時在線監控反應過程, ,結合相應的軟件可以對結合相應的軟件可以對 結果進行分析結果進行分析, ,計算待測樣品的初始模板量。計算待測樣品的初始模板量。 I 實時定量PCR(real-time PCR): 通過特定設計的PCR儀器來實時檢測PCR 擴增過程每一輪循環產物的累積數量， 可以很好的推算模板的起始

39、濃度，這種 工作方式稱為實時定量PCR。 實時熒光定量PCR: 實時定量PCR在檢測過程中通過檢測標 記的熒光信號的累積來實時監測整個 PCR進程，最后通過標準曲線對未知模 板進行定量分析，故稱為實時熒光定量 PCR。 1 病原體測定 由于PCR技術的問世，使得病原體檢測能夠快速而方便的進行。但 由于其高靈敏性，實驗操作很容易受到污染而出現假陽性。只要 有微量病原體存在，PCR擴增即可為陽性結果，但并不能作為診斷 依據，只有當一定數量的病原體存在時才有臨床意義，因此結模 板定量顯得特別重要。常規PCR由于不能定量而限制了其應用，然 而PE公司研制的FQ-PCR技術給解決這一問題提供了可能。目前該 技術已經應用于丙肝病毒、人類乳頭瘤病毒、結核桿菌和食品中 大腸桿菌等許多病原體的檢測研究。 Morris等用FQ-PCR對黑猩猩丙型肝炎動物模型和臨床丙型肝炎患 者血清中丙肝病毒（HCV）進行了研究。FQ-PCR技術在保持巢式 PCR高度敏感性的同時又能提高效率，因此可作為一種檢測HCV的 有效方法。同時，由于FQ-PCR可以測出血清中病原體濃度，故可 給藥物治療及療效觀察提供參考依據。 以前常規檢測大腸桿菌的方法，都因為繁瑣，需要大量 的PCR后處理過程及不能對標本定量而受到限制。美國 Witham等1996年將FQ-PCR技術應用