1、第四部分遺傳信息的存第十三章 蛋白質的生物合成13.1蛋白質合成體系13.1.1mRNA與遺傳密碼13.1.2tRNA 的結構及功能13.1.3核糖體13.1.4翻譯輔助因子13.2蛋白質的合成13.2.1氨基酸的活化13.2.2肽鏈合成的起始13.2.3肽鏈的延伸13.2.4肽鏈合成的終止與釋放13.2.5真核細胞蛋白質生物合成13.2.6蛋白質的翻譯后加工13.2.7抑制翻譯的抗菌素13.3蛋白質定位13.3.113.3.2分泌蛋白線粒體與葉綠體蛋白第十三章 蛋白質的生物合成本章提要：蛋白質生物合成是以 mRNA為模板，按照每3個核苷酸（三聯體密碼）決定一種氨基酸，以tRNA為搬運工具，在

2、核糖體上進行的。遺傳密碼具有方向性，簡并性、通用性、連續性、變偶性和有起始密碼子與終止密碼子等特性。蛋白質合成過程包括氨基酸活化、 起始、延伸和終止 4個階段，真核生物和原核生物的蛋白質合成過程大同小異，但合成過 程所需的蛋白因子不同。肽鏈合成后往往還要經過一系列加工才能成為具有特定空間結構 和生物學活性的功能蛋白質。許多抗菌素對蛋白質合成有明顯抑制作用。蛋白質合成后通 過定向運輸和分揀過程，到達細胞的各個部位。蛋白質生物合成在細胞代謝中占有十分重要的地位。分子遺傳的中心法則指出：遺傳信息 的表達最終就是合成出具有特定氨基酸順序的蛋白質。如果把核酸看作指導生命活動基本 的信息分子，那么蛋白質就

3、是主要的功能分子。以大腸桿菌為例，蛋白質約占細胞干重的 50%包括大約3 000種不同蛋白質分子，每種分子的數目保持在一定范圍，而且以不同的 速率不斷更新。在最佳的培養條件下，大腸桿菌細胞的分裂周期約為20 min，可以設想蛋白質的生物合成是何等快速有效。蛋白質生物合成機理研究的每一個進展幾乎都與核酸代謝研究進展緊密地聯系在一起。1952 1954年，P C Zamecnik等發現了核糖體，并證明它們是蛋白質合成的部位。1955年，M BHoagland建立了無細胞蛋白質生物合成體系。19561957年Zamecnik等和Stephanson分離出tRNA,并對它們的功能提出假設。1961年，

4、F Jacob和JMonod提出了信使 RNA勺概念。1961 1965年M Nirenberg 和Khorana建立了 64個堿基 三聯體遺傳密碼系統。目前已經完全清楚，DNA中貯存的遺傳信息通過轉錄傳遞給mRNA mRNA中的核苷酸序列再翻譯(translation)成多肽鏈中的氨基酸序列，這個特定的氨基酸序列中包含著使其正確地被加工、分揀、細胞內定位以及形成能履行其生物學功能的天然構象所需要的信息。翻譯 過程十分復雜，除了 20種蛋白質氨基酸和為蛋白質合成提供能量的ATP、GTP外，幾乎涉及到細胞內所有種類的 RNA和幾十種蛋白質因子，可以說是細胞內最復雜的生物合成系 統。盡管蛋白質生物

5、合成的早期研究都是用大腸桿菌無細胞體系進行的，但是后來的研究 表明，真核細胞蛋白質合成的機理與大腸桿菌有許多相似之處。13.1蛋白質合成體系131 1mRNA與遺傳密碼13111 信使 RNAF Jacob和JMo nod在1961年就已提出信使 RNA(messe ngerRNA mRNA的概念。他們認為，既然蛋白質是在胞質中合成的，而編碼蛋白質的信息載體DNA卻在細胞核內，所以必定有一種中間物質用來傳遞DNA上的信息。于是他們提出，這樣的信使可能是一種RNA但是當時已經發現的兩種RNA都不具備這種功能，于是提出第三種RNA信使RNA的概念。這一假說隨即在許多以細菌為材料的研究中得到了證實。

6、mRNA是遺傳信息的傳遞者，是蛋白質生物合成過程中直接指令氨基酸摻入的模板，因此得名信使RNA它們大約只占細胞中RNA的 5%種類多，壽命短，更新快。例如，大腸桿菌中mRNA勺平均壽命只有1518 min(37 C );而真核細胞內 mRNA匕較穩定，哺乳動物有些mRNA勺半壽期可達數小時至24 h。13112遺傳密碼的破譯據估計生物界擁有10101011種不同的蛋白質，這么多的蛋白質都是由20種氨基酸構成的，而指令氨基酸摻入的模板mRNA卻只有4種堿基。若由一個堿基編碼一種氨基酸，那么，四種堿基只能決定四種氨基酸；若由兩個堿基編碼一種氨基酸，也只能編碼42=16種氨基酸。以上都不能滿足編碼2

7、0種氨基酸的需求。若由三個堿基作為一組，可以有 43=64種排列，就滿足了編碼20種氨基酸的需要，所以這種編碼方式的可能性最大。用生物化學和遺傳學研究技術證明，是三個堿基編碼一種氨基酸，因而稱它為堿基三聯體密碼(triplet code)或密碼子(codon)。破譯遺傳密碼的突破性工作主要包括三個方面：一是體外翻譯系統的建立；二是核酸的人工合成；三是核糖體結合技術。1961年，Nirenberg和Mathaei用大腸桿菌無細胞體系，外加20種標記的氨基酸混合物和人工合成的模板polyU，經保溫后，發現生成多聚苯丙氨酸，從而證明UUU是編碼苯丙氨酸的密碼子。以此為突破口，用同樣的方法很快又證明C

8、CC是編碼脯氨酸的密碼子、AAA是賴氨酸的密碼子。接著，Nirenberg和Ochoa等用poly UG、poly AC 等重復上述實驗，發現標記氨基酸摻入新合成多肽的頻率與按統計學方法推算出的堿基三聯體密碼的出 現頻率相符合(表13-1)。但是由于所用模板無一定的堿基順序，因而這些實驗只解決了密 碼的組成，無法確定密碼子的堿基順序，因此未能徹底揭開密碼之謎。表13-1隨機共聚poly UG對氨基酸的編碼(U : G=5： 1)可能的密碼子按計算可能出現的頻率氨基酸及其相對摻入量UUU100%Phe(100%)UUGUGU GUU20%Cys(20%) Val(20%) UGG，GUG GGU

9、4%Gly(4%) Trp(5%)GGG0 8%以 UUU的出現頻率為100%十。為了進一步解決密碼子中三個堿基的排列順序問題，Nirenberg等于1964年建立了核糖體結合技術。他們將大腸桿菌核糖體與人工合成的三核苷酸、Mg2+及14C-氨酰-tRNA(只缺GTP)一起保溫，無需酶促則特定的氨酰-tRNA就可與有特定的三核苷酸的核糖體結合。并說明密碼子的解讀有方向性，如pGpUpU寸Val專一，而pUpUpG卻對Leu專一。在無 GTP存在時，三核苷酸可促進與其對應的氨酰-tRNA結合到核糖體上而不形成肽鍵。這樣，利用結合的氨酰-tRNA-三核苷酸-核糖體復合物可被硝酸纖維濾膜吸附，而未被

10、核糖體結合的 tRNA則不 被吸附的性質，將其與未結合的tRNA分開。由于三核苷酸模板只能與一定的tRNA對應，而一定的tRNA又只與特定的氨基酸結合，所以只要帶標記的氨基酸被濾膜吸 附，即可確定所加三聯體是什么氨基酸的密碼子。例如，加入AUG時，只有被標記的 Met留在濾膜上，因此可確定AUG是 Met的密碼子。利用這種簡便的技術，Nirenberg等很快破譯了 64個中的50個。表13-2遺傳密碼字典 密碼子的閱讀方向為 5宀3fMet為甲酰蛋氨酸；AUG兼作起始密碼子。因上述實驗應用的體外翻譯系統Mg2+離子濃度較高，多肽鏈合成無需特定的起始密碼子。這樣，用上述這些方法，僅用了4年時間，

11、于1966年完全確定了編碼 20種天然氨基酸的遺傳密碼，編排出了遺傳密碼字典(表13-2)。上述用無細胞體系獲取的結果隨即在活體內和遺傳實驗中得到完全的證實。遺傳密碼的破譯是生命科學史上又一重大突破，不僅成為闡明蛋白質生物合成過程的基礎，而且為確立分子遺傳的中心法則提供了有力的證據。由于Nirenberg和Khorana二人在破譯遺傳密碼研究工作中的重大貢獻，他們二人共同獲得1968年的諾貝爾獎。13113遺傳密碼的基本性質 方向性密碼子的閱讀方向和它們在mRNAh從起始信號到終止信號的排列方向均為5t3 ，與mRNA生物合成時鏈延伸方向一致。 簡并性密碼表的64組密碼子中，除 UAA UAG

12、和UGA三組為終止密碼子外，有 61組密碼子分別代表20種氨基酸，除蛋氨酸和色氨酸只有一個密碼子，其它氨基酸都有好幾組密 碼子。例如亮氨酸的密碼子可以是UUA UUG CUU CUC CUA和CUG編碼同一種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子，這種現象稱為密碼的簡并性，簡并性的存在減少了由于堿基取代造成的有害突變。此外，不同生物對同義密碼子的使用頻率可能有不同的選擇，這大概 與生物的進化、分化有關。在進行基因工程操作時應考慮選擇最有效的密碼子(也稱偏愛密碼)。 通用性與例外實驗證明，無論是病毒、原核生物還是真核生物，都共同使用同一套密碼字典，這叫做密碼的通用性，例如大腸桿菌的蛋白質合成系統可以正確閱

13、讀人珠蛋白mRNA的密碼系統，合成出人珠蛋白。1980年以來，陸續在動物和酵母的線粒體以及草履蟲、腺病毒等生物中發現一些例外。如 在人線粒體中AUA AUU不再編碼lie，而是翻譯起始信號；AGA AGG不再編碼Arg，而成 為終止信號；UGA不再是終止信號，卻編碼 Trp。 讀碼的連續性在 mRNA鏈上，從起始信號到終止信號，密碼子的排列是連續的，密碼子之間既沒有重疊也不存在間隔，即無標點性，翻譯時必須正確選擇閱讀起點，一旦確定之 后就依次譯讀，這就是所謂解讀框架(readi ng frame)。 有起始密碼子和終止密碼子在64組密碼子中，AUG除編碼蛋氨酸外，還是肽鏈合成的起始密碼子，在原

14、核生物中它編碼新生多肽鏈第一位的甲酰蛋氨酸，少數情況下以GUG為起始密碼子，也給肽鏈第一位編碼一個甲酰蛋氨酸。與這種“兼職”形成對照，UAA UAG和UGA這三組密碼子不編碼任何氨基酸，是多肽鏈合成的終止信號，稱為終止或無意義密碼子。 變偶性密碼的簡并性通常只涉及第三位 (3 -)堿基。例如纈氨酸有 4組密碼子：UGUUGC UGA和UGG前兩個堿基完全相同，只有第三位堿基不表13-3密碼子識別中的變偶性tRNA反密碼子5-堿基mRN/密碼子第三位堿基AUCGGCUUA GIU, C, A同，說明密碼子的專一性主要取決于前兩位堿基，第 三位堿基的重要性較低，可以有一定程度的擺動，稱為擺動性或變

15、偶性（Wobble）。在蛋白質合成過程中，氨酰-tRNA的反密碼子通過反向堿基配對與mRNAk的密碼子相互作用，反密碼子3-堿基和中間堿基分別與密碼子前兩位堿基匹配，必須嚴格遵循A-U、G-C間配對的原則，反密碼子 5-堿基與密碼子第三位堿基間的配對則允許有一定的擺動（表13-3）。1312tRNA的結構及功能蛋白質的生物合成需要一整套tRNA作為氨基酸的轉運工具，將各種氨基酸按照mRNAk密碼所決定的順序轉運到核糖體上。tRNA分子的二級結構呈三葉草形，三級結構呈倒L形（見12 2 1）。作為蛋白質合成中的接頭分子，tRNA上與多肽合成有關的位點至少有4個，即3-端CCA上的氨基酸接受位點；

16、識別氨酰-tRNA合成酶的位點。倒 L中部的DHU臂和反密碼子環，氨基酸臂參與這一作用；核糖體識別位點。倒L中部的T C環與此有關；反密碼子位點。由于密碼的簡并性，絕大多數氨基酸需要一種以上的tRNA作為轉運工具。通常將 tRNA所轉運的氨基酸標在右上角以示區別，如 tRNACys表示轉運半胱氨酸的tRNA。原核細胞內約 有60種不同的tRNA,真核細胞內則多達 100120種。運輸同一種氨基酸的不同 tRNA稱 為同工受體tRNA。蛋氨酸雖然只有一組密碼子 （AUG）,卻至少有兩種tRNA, 一種負責把蛋氨酸運到肽鏈中 間，用tRNAMetm表示；另一種攜帶甲酰蛋氨酰參與蛋白質合成的起始，用

17、tRNAfmetf表示；真核細胞的起始tRNA表示為tRNAMeti，攜帶蛋氨酰參與起始作用，用于肽鏈延伸的 則表示為tRNAMet。1313核糖體早在1950年就有人將放射性同位素標記的氨基酸注入小鼠體內，經短時間后，分離各亞細 胞組分，再分別測定放射性強度，結果表明放射性主要集中于核糖體，從而證明核糖體是 蛋白質生物合成的場所。在其它蛋白質因子和酶的參與下，在核糖體上按mRNA勺指令將tRNA轉運的氨基酸合成為蛋白質。13131核糖體的組成與結構每個細菌細胞中平均約有2 000個核糖體，它們或以游離狀態存在，或與mRNA吉合成串珠狀的多核糖體。每個真核細胞內大約含106107個核糖體，其中

18、一部分與內質網結合，形成粗糙內質網，其余的核糖體像原核細胞中的一樣，分布在細胞質中。此外，線粒體和葉 綠體內也有它們自己的核糖體。核糖體都是由幾十種蛋白質和rRNA組成的巨大的核蛋白顆粒，這些組分構成一個大亞基和一個小亞基。原核細胞、真核細胞和不同細胞器來源的核糖體復雜程度有所不同，表13-4總結了這些核糖體的一些特性，通常用沉降系數（S）表示核糖體、亞基及 rRNA的大小。表13-4核糖體的某些特性核糖體來源完整核糖體沉降系數（相對分子質量/103）亞基（相對分子質量/103）rRNA（核苷酸殘基數）蛋白質分子數目原核細胞（大腸桿菌）70 S（2 800）30 S（1 000）50 S（1

19、800）16 S（1 543）23 S (2 904), 5 S(120)2131真核細胞(脊椎動物)80 S(4 500)40 S(1 500)18 S(2 000)3360 S(3 000)28 S(5 000), 58 S(160) , 5S(120)49線粒體 6070 S3240 S1116 S30444358 S1423 S3150葉綠體 6870 S28 30 S33 55 S16 S23 S , 5 S , 45 S非脊椎動物和植物的核糖體40 S小亞基含一分子1618 S的rRNA, 60 S大亞基含 25 S , 58 S和5 S的rRNA各一分子。核糖體是一個高度復雜的超

20、分子復合物，它的任何個別組分或局部組分都起不到整體的作 用。核糖體各種組分基本上都是單拷貝，它們的生物活性只有在組裝成亞基和核糖體之后 才能表現出來，并通過協調活性共同完成翻譯過程。通過大量的研究，已提出了大腸桿菌 核糖體三維結構模型(圖13-1)。小亞基貌似一個動物胚胎，由頭部、基部和平臺組成，平 臺與頭部之間有一個裂隙；大亞基很像一個沙發，有一個柄、一個中央凸出部和一個脊； 二者組裝成核糖體時，小亞基頭部與大亞基凸出部之間形成一個隧道，在蛋白質合成中 mRNA可能從這里通過。13132核糖體的功能mRNA吉合，并按核糖體是蛋白質生物合成的工廠。在蛋白質合成過程中，核糖體必須先與 5宀3 的

21、方向沿 mRNA移動，每次移動的距離相當于一個密碼子。核糖體上至少有兩個與tRNA結合的不同位點；一個專門結合新摻入的氨酰-tRNA，簡稱A位(accepter site) ;另一個則與延伸中的肽酰-tRNA結合，簡稱P位(peptine site)。這兩個位點在核糖體上緊挨在一起，各占據一個密碼子的空間(圖13-2)。核糖體除具有肽酰轉移酶活性外，還有起始因子、延伸因子和釋放因子的結合位點。圖13-2核糖體上的兩個tRNA結合位點13133多核糖體34個成串的甚至上百個成串的核糖體，mRNA分子與一定數目的單個核糖體結合而mRNA每個核糖體獨立完成一條多肽鏈的在溫和的條件下小心地分離核糖體時

22、，可以得到稱為多核糖體(polyribosome)。多核糖體由一個成，形成念珠狀。各核糖體之間相隔一段裸露的合成，所以多核糖體可同時在一個mRN坊子上進行多條肽鏈的合成，極大地提高了翻譯的 效率(圖13-3)。此外還可同時分離出許多以單體形式存在的非功能性核糖體和少數核糖體亞基。多核糖體顯然正處于工作狀態，游離的單個核糖體則是貯備狀態，核糖體亞基無疑是剛從mRNAh釋放的，它們通常很快結合成非活性狀態單體或很快參與下一輪蛋白質合 成。核糖體在這三種狀態之間的轉換稱為核糖體循環(圖13-3)。圖13-3多核糖體與核糖體循環表13-5蛋白質生物合成體系主要輔助因子生物階段名稱符號功能原核細胞起始起

23、始因子1起始因子2起始因子3IF1IF2IF3促進IF2和IF3的活性使fMet-tRNAf選擇性地與30 S亞基結合，需 GTP促使30 S亞基與mRNA起始部位連接；促進核糖體解離成亞基延 伸延伸因子Tu延伸因子Ts延伸因子GEF-TuEF-TsEF-G促進氨基酰-tRNA進入A位與mRNA吉合促使 EF-Tu GDP再生為 EF-Tu GTP水解GTP使核糖體按5宀3方向沿mRNA移動一個密碼子的距離終止與釋放終止因子終止因子2終止因子3RF-1RF-2RF-3識別終止密碼子UAA UAG使肽酰轉移酶活性變為水解酶活性識別終止密碼子UAA UGA促使肽鏈從核糖體和 tRNA上釋放促進RF

24、-1和RF-2的活性真核細胞起始起始因子（已分離出12 種）elF-（1，1A，2，2B, 3，3A，4A, 4B, 4E, 4F, 5，5A）參與真核細胞蛋白質合成起始復合物的組裝，各起始因子的具體功能見有關參考文獻延伸延伸因子1延伸因子2EF-1EF-2相當于EF-Tu+EF-Ts的功能相當于EF-G的功能終止終止因子 RF識別終止密碼子 UAA UAG UGA作用與原核細胞終止因子1，2相同13 14翻譯輔助因子除上述幾類RNA之外，蛋白質合成體系還需要一系列蛋白質輔助因子（表13-5）以及GTPATP Mg2+等的參與。13.2蛋白質的合成132蛋白質的合成蛋白質的生物合成大致可分為五

25、個階段：氨基酸的活化；肽鏈合成的起始；肽鏈的延伸；肽鏈合成的終止與釋放；翻譯后加工。1321氨基酸的活化像其他大分子的合成一樣，作為蛋白質的構件分子氨基酸在摻入多肽鏈之前必須先活化，并與相應的tRNA結合成氨基酰-tRNA，才能參加合成反應。氨基酸活化反應是在胞質溶膠中由氨酰-tRNA合成酶催化完成的。迄今已有150多種不同來源的氨酰-tRNA合成酶被分離純化。原核細胞中該酶的相對分子質量一般小于250 000 ,真核細胞的這類酶常與 tRNA等以復合物形式存在，相對分子質量大于1000 000。不同來源的氨酰-tRNA合成酶亞基組成不同，有的只有一條多肽鏈，真核有的是由11條多肽鏈組成的寡聚

26、體；有的由相同的亞基組成，有的含有不同亞基。氨酰-tRNA合成酶具有很高的專一性，每種氨基酸至少有一種對其專一的酶，這種酶既識別特異的氨基酸，還能識別攜帶該氨基酸的特異tRNA氨酰-tRNA合成酶催化的反應包括三步： 酶-氨基酸-ATP絡合物的形成：氨基酸+ATP-H：氨基酸 ATP 酶 酶-氨基酸-AMP絡合物的形成：氨基酸ATP酶 Mg2+或Mn2+ 氨基酰-AMP 酶+PPi以上兩步反應專一性不高，例如異亮氨酰-tRNA合成酶對異亮氨酸和纈氨酸的親和力相差100倍，但在沒有異亮氨酸存在時，也能催化形成纈氨酸-AMP 酶，不過這種錯誤在第三步可得到糾正。 氨酰-tRNA的形成：氨基酰-AM

27、P 酶+tRNA氨酰-tRNA+AMP酶通過上述反應，氨基酸被活化：在氨酰-tRNA中氨基酸的羧基通過高能酯鍵連接在tRNA3端CCA泉苷酸殘基3-或2-羥基上；一旦酰基化后，便可在2 或3位間轉移，在轉肽時，可能只有在 3羥基上時才有活力。PCPCPAOHOCOCHNH2R第三步反應的專一性很高，如果在前面的反應中形成了不正確的中間絡合物，此時很容易被合成酶所識別并很快被催化水解。氨酰tRNA合成酶這種高度的專一性保證了氨基酸與其特定的tRNA準確匹配，從而為蛋白質生物合成的保真度作出貢獻。應當指出的是，合成酶 在上述活化反應中對氨基酸和tRNA進行了嚴格的篩選，而在后來的蛋白質合成中tRN

28、A只起到一個接頭的作用，它只能按照反密碼子與密碼子間的相互識別，將所連接的氨基酸帶 到相應的位置，此時如果氨基酸不正確或發生了改變就難以進行及時的糾正。1322肽鏈合成的起始蛋白質合成的起始涉及核糖體亞基和起始氨酰-tRNA在起始因子的參與下識別mRNAh的起始信號，并組裝成起始復合物。13 2 21起始密碼子的識別如前所述，AUG除編碼肽鏈中的蛋氨酸外，還兼做肽鏈合成的起始信號。作為起始密碼子的AUG少數情況下為 GUG往往位于mRNA模板5-端的第25個核苷酸以后。對起始密碼 子附近的核苷酸序列進行分析之后發現，在距起始密碼子上游（5 -端一側）約10個核苷酸處往往有一段富含嘌呤的序列 （

29、稱為Shine-Dalgarno 序列，簡寫為SD序列），它與16 S rRNA 3 -端的核苷酸序列形成堿基互補 （圖13-4）。正是由于 SD序列與16 S rRNA 3 -端 的這種相互作用，使得核糖體能區別起始信號AUG與編碼肽鏈中蛋氨酸的密碼子AUG正確地定位于 mRNAk起始信號的位置。3 0HUCCUC?CA16SrRNA的 5-末端5GAUUCCUAGGAGGUUUGACCU CGA GCU UUU AGUmRNA多肽fMet- Arg- Ala- Phe- Ser-圖13-4mRNA上起始區的富嘌呤區與 16SrRNA3-末端之間的互補區域13222起始復合物的形成在原核細胞

30、中，起始密碼子AUG編碼甲酰蛋氨酸（fMet），種專一的甲酰化酶催化Met-tRNAfmetf的N-甲酰化反應：Met-tRNAfmetf+N10-甲酰四氫葉酸甲酰化酶 fMet-tRNAfmetf+四氫葉酸這種酶只對 Met-tRNAfmetf起作用，而不能催化游離Met或Met-tRNAm的甲酰化。圖13-5起始復合物的形成原核細胞蛋白質合成的起始復合物按下列步驟進行：首先，非功能性的70S核糖體在IF3的作用下發生解離，生成IF3 30 S復合物和游離的50 S大亞基；IF3 30 S與mRNA吉合成IF3 30 S mRNA復合物，在此過程中 IF3可阻止50 S大亞基過早結合，有幫

31、助mRNA勺SD序列與16 S rRNA3 -端相結合，使 mRNAE確定位的作用，并在翻譯啟動區 形成使起始信號易被 fMet-tRNAf識別的高級結構；在 IF1、IF2 GTP的幫助下，fMet- tRNAf與上述復合物結合，釋放 IF3，形成30 S起始復合物：30S- IF1 IF2 GTP- fMet-tRNAf mRNA 其中 IF2 具有 GTPase活性，IF2 GTP可促進 fMet-tRNAf與30 S的結合；最后，30 S起始復合物與50 S大亞基結合，釋放IF1、 IF2并把GTP水解成 GDP和Pi，組裝成 70 S起始復合物：70 S mRNA fMet-tRNA

32、f。這 時，大小亞基組裝成功能完全的70 S核糖體，同時fMet-tRNAf占據P位，其反密碼子恰好與起始密碼子AUG吉合，空著的A位準備接受另一個氨酰-tRNA，以便進行肽鏈的延伸（圖 13-5）。1323肽鏈的延伸70 S起始復合物組裝完畢，蛋白質合成進入肽鏈延伸階段。延伸循環包括三步反應，每步GTP Mg2+勺參與。其步驟如下（圖都是在相應的蛋白質延伸因子催化下完成的，同時需要13-6）:圖13-6肽鏈的延伸 進位在延伸因子 EF-Tu GTP的幫助下，一個新的氨酰 -tRNA進入核糖體的 A位。這個 氨酰-tRNA的反密碼子必須與處于 A位的mRNAk的密碼子相匹配。 EF-Tu能與G

33、TP和氨酰- tRNA結合，將氨酰-tRNA送入A位，同時GTP水解成GDP和Pi。EF-Tu GTP具有很高的專 一性，不與游離 tRNA fMet-tRNAf以及取代了的氨酰-tRNA結合。EF-Ts催化GDP-GTP交 換，使EF-Tu GDP變成EF-Tu GTP才能重新參與下一輪反應：EF-Tu GDP+EF-TaEF-Tu Ts+GDPEF-Tu Ts+GTi EF-Tu GTP+EF-Ts 轉肽在肽酰轉移酶的作用下，P位上的fMet-tRNAf（或后來的肽酰-tRNA）活化的羧基從相應的tRNA上解離下來，并轉移到A位氨酰-tRNA的氨基酸的氨基上形成肽鍵，在A位產生肽酰-tRN

34、A，把無負荷的tRNA留在P位。肽酰轉移酶活性涉及50 S大亞基數種蛋白質組分和23 S rRNA，要求有較高的 K+濃度。 移位在EF-G（移位酶）的作用下，核糖體沿 mRNA 5宀3 的方向移動，每次移位距離為 3個核苷酸，結果使肽酰-tRNA從A位移到P位，原來在P位的無負荷tRNA隨即離開核糖 體，同時一個新的密碼子進入空著的A位。EF-G對GTP有很強的親和力，它催化的移位過程需要GTP水解提供能量。以上三步反應構成一個延伸循環，肽鏈每摻入一個氨基酸就重復一次延伸循環。肽鏈就這樣從氨基端（N-端）向羧基端（C-端）延伸，總是前面一個氨基酸的羧基與其后的氨基酸的氨 基形成肽鍵。在 37

35、 C下，大腸桿菌合成蛋白質的速度約為每秒17個氨基酸。132 4肽鏈合成的終止與釋放當mRNA勺終止密碼子（UAA、UAG UGA中任何一個）出現在核糖體 A位時，沒有哪一個氨酰 -tRNA能與之匹配，這時終止因子便會結合上去：RF-1識別UAA和UAG RF-2識別UAA和UGA RF-3具有GTPase活性，負責激活 RF-1和RF-2。終止因子的結合使得核糖體的肽酰 轉移酶變為水解酶，不再催化肽酰基轉移到氨酰-tRNA上，而將肽酰基轉移到水分子上，把已合成的多肽鏈從核糖體和tRNA上釋放出來，無負荷的 tRNA隨即從核糖體上脫落，該核糖體立刻離開 mRNA在IF3的存在下解離成 30 S

36、小亞基和50 S大亞基，以便投入另一 條多肽鏈的合成（圖13-7）。圖13-7肽鏈合成的終止與釋放蛋白質的生物合成是個高耗能過程。僅就翻譯過程而言，每個氨基酸在活化成氨酰-tRNA時要消耗兩個高能磷酸鍵 （ATPt AMP+PPi）;氨酰-tRNA進入核糖體A位時要水解一個 GTP 形成肽鍵后核糖體沿 mRNA移位時又要水解一個 GTP所以每摻入一個氨基酸至少需要消耗 四個高能磷酸鍵。1325真核細胞蛋白質生物合成真核細胞蛋白質生物合成過程與原核細胞基本相同，僅在某些方面存在一些差異：真核細胞核糖體比原核細胞核糖體更大、更復雜（見表13-4），而且對抑制劑的敏感性不同，例如放線菌素 D亞胺環己

37、酮只抑制真核細胞80 S核糖體的肽酰轉移酶活性；真核細胞多肽合成以蛋氨酸為起始氨基酸，起始的tRNA為Met-tRNAi，這種tRNA的T環不含CTTC,而代之以GAUC 真核細胞mRNA!常為單順反子，5-端有特殊的“帽子”結構， 它的5-端AUG密碼子所在部位即為多肽合成起始部位，5-上游沒有富含嘌呤的 SD序列，elF-4F具有識別和與“帽子”結構相結合的能力；真核細胞蛋白質生物合成涉及的 起始因子已鑒定出12種，但只有2種延伸因子和1種終止因子（見表13-5）;真核細胞 中線粒體、葉綠體的核糖體從大小、組成到蛋白質合成過程和對抑制劑的敏感性都類似于 原核細胞核糖體。1326蛋白質的翻譯

38、后加工從mRNA羽譯得到的蛋白質多數是沒有生物活性的初級產物，只有經翻譯后加工過程才能成 為有活性的終產物。加工包括修飾和折疊兩部分，肽鏈的折疊可以發生在肽鏈剛由核糖體 合成時，修飾可以發生在肽鏈折疊之前，或折疊期間、或折疊之后。蛋白質成熟過程中修 飾與折疊是相輔相成的。1 蛋白質的修飾新生蛋白質與最終蛋白質產物在一級結構上差異是相當大的，原因就在 于翻譯后進行了廣泛的修飾。如何修飾完全取決于每種蛋白質的個別性質，所以修飾包括 多種方式。(1) N-端修飾新生蛋白質的 N-末端都有一個甲硫氨酸殘基，原核中還是甲酰化的。原核生 物由肽甲酰基酶除去甲酰基，多數情況下甲硫氨酸也被氨肽酶除去，在大腸桿

39、菌中約只有 30%的蛋白質還保留甲硫氨酸。真核生物中甲硫氨酸則全部被切除。(2) 多肽鏈的水解切除許多新合成的酶和蛋白質是以酶原或其他無活性的“前體”形式存 在。水解時是切除其中多余的肽段，使之折疊成有活性的酶或蛋白質。酶原的激活即是例 子。(3) 氨基酸側鏈的修飾氨基酸側鏈的修飾包括羧化，羥化、甲基化及二硫鍵的形成等。如 肽鏈N-端的乙酰化和C-端的酰胺化，脯氨酸和賴氨酸的羥化，賴氨酸的甲基化以及二硫鏈 的形成等等。(4) 糖基化修飾糖蛋白是細胞蛋白質組成的重要成分，它是在翻譯后的肽鏈上以共價鍵與單糖或寡糖連接而成的。如以N-糖苷鍵連接在天冬酰胺的酰胺氮上，或以O-糖苷鍵連接在絲氨酸或蘇氨酸

40、的羥基氧上。蛋白質的糖基化是一個很復雜的過程，需要一系列專一性很 強的糖基轉移酶和糖苷酶。2蛋白質的折疊折疊是指具有特定一級結構的蛋白質分子形成正確的三維空間結構(三級結構)的過程。蛋白質在體內折疊的環境很復雜，參與的蛋白質和因子比較多。目前證 明，至少有兩類蛋白質參與體內的折疊過程，統稱為助折疊蛋白(foldli ng helper) 。(1) 酶如蛋白質二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase， PDI)及肽酰脯酰順反異構酶(peptidyl prolyl cis/trans isomerase， PPI)，前者通過加速形成蛋白質中正確的二硫鍵，后者催化肽脯氨酰

41、之間肽鍵的旋轉反應，從而加速蛋白質的折疊過程。(2) 分子伴侶(chaperonin)這是細胞內一類能幫助新生肽鏈正確組裝、成熟，自身卻不是 終產物分子的成分的蛋白質，類似酶但又無酶的專一性特征，所以稱為分子伴侶，分子伴 侶所識別的靶蛋白部位是它們部分折疊的非天然狀態，促進折疊的機理尚在研究之中。1327抑制翻譯的抗菌素四環素、氯霉素、鏈霉素、嘌呤霉素等抗菌素對蛋白質合成都有明顯的抑制作用。 四環素族(tetracycline family)抑制氨基酰-tRNA與原核細胞核糖體的結合，從而抑制多種細菌的蛋白質合成 氯霉素(chloromycetin)能與原核細胞核糖體的50 S亞基結合，阻斷肽

42、鍵的形成。高濃度時，對哺乳動物線粒體內核糖體50 S亞基也有作用。 鏈霉素(Streptomycin) 和卡那霉素(Kanamycin)能與原核細胞核糖體 30S亞基結合，改 變其構象，引起讀碼錯誤，以致合成錯誤的蛋白質。 嘌呤霉素(Puromycin)結構與氨酰-tRNA末端相似，帶有游離氨基，可以取代氨基酰-tRNA進入核糖體受位，使正在延長中的肽鏈轉移到嘌呤霉素的氨基上，這種異常肽鏈很容易從核糖體上釋放下來，從而終止肽鏈的延長。對真核及原核細胞都有作用，故不能用于 臨床治療。 亞胺環己酮(Cycloheximide)對真核細胞有作用，能抑制核糖體上的多肽轉移酶。此外，白喉毒素也能抑制蛋白質合成，它是由白喉棒狀桿菌產生的，卻不抑制細菌的蛋白 質合成。此毒素可對延長因子-2進行酶促反應，使其修飾成腺苷二磷酸核糖衍生物，從而使動物延長因子-2失活，抑制肽鏈的移位作用。由于它是一種酶蛋白，極小量即能完全抑 制蛋白質合成，成為一種劇毒物。13.3蛋白質定位133蛋白質定位不論原核生物還是真核生物，新合成的蛋白質只有被運送到各自特定的亞細胞部位或分泌到胞外才具有功能活性，該過程就稱為蛋白質定位。不同類型的蛋白質其定位機制不同，位于胞質溶膠的（如糖酵解中有關酶）在游離核糖體上合成后直接釋放到胞質溶膠中。其他類型蛋白，如分泌蛋白、質