1、新城疫的抗體檢測 某些病毒具有凝集某種（些）動物紅細胞的能力，稱為病毒的血凝，利用這種特性設計 的實驗稱 血球凝集試驗 ，以此來推斷被檢材料中有無病毒存在， 是非特異性的 ，但病毒的血 凝可為相應的抗體所抑制，即 血球凝集抑制實驗（ HI ），通過血凝與血凝抑制試驗，可用已 知血清來鑒定未知病毒，也可用已知病毒來檢查被檢血清中的相應抗體和滴定抗體的含量。 一 目的意義 1 免疫監測 （1）免疫效果評價 （ 2）免疫時機確定 2 診斷疾病（根據有無抗體或抗體的高低） 3 流行病學調查 二 試驗儀器與試劑 1 試驗儀器 離心機、離心管兩支、 50ml 量筒一個、 V 型微量反應板、微量加樣器（移

2、液器）、塑料吸頭 （黃色） 若干、 1ml 吸管 1 支、 膠頭滴管兩支、微量振蕩器、 電熱恒溫培養箱、托盤天平。 2試驗試劑雞新城疫抗原、流感 H5 H9抗原、1%雞紅細胞、生理鹽水、3.8%檸檬酸 鈉抗凝劑、待檢血清。 三 方法 1 病毒的血凝試驗 1.1 3.8% 檸檬酸鈉抗凝劑的配制： 用托盤天平稱取檸檬酸鈉 3.8 克溶于 100ml 蒸餾水 或純凈水中，搖勻使其充分溶解即可，有條件的可121 C高壓蒸汽滅菌20分鐘，冷卻至室 溫后置4C冰箱中保存備用。 1.2 1%雞紅細胞制備過程：事先用5ml （或10ml）的注射器吸入抗凝劑若干（其量為 所需血量的 1/5）, 從健康公雞（未經

3、新城疫疫苗注射）的心臟或翅下靜脈采取2-4 毫升血 液, 以 2000 轉每分鐘， 離心 5 分鐘， 吸去上清液 （注意要將血細胞泥表面的一種薄膜吸凈） 。 然后用生理鹽水（用量為血細胞泥的 5-10 倍）洗紅細胞，離心 5分鐘，棄去上清液，如此 反復洗 3-5 次，直至上清液透明清亮為止，最后一次要用生理鹽水將血細胞泥稀釋成1%濃 度，然后置4 C冰箱備用（一般可保存 3天）。 1.3 紅細胞凝集試驗（血凝試驗）操作方法 （見表 1）： （1）取一塊潔凈的96孔V型微量血凝反應板，用微量移液器從第一列第一孔開始依次加 入生理鹽水，每孔 25 微升，直至加到第十五孔（第一列 12 孔，第二列

4、3 孔）。 （2）取新城疫抗原液 25微升加入第一孔中，充分混合后吸取 25微升加入第二孔中，如 此直至第 14孔，混合后吸取 25微升丟棄，第 15孔不加病毒為對照。 （ 3）更換移液器前端的塑料吸頭，每孔加已備的1%雞紅細胞液各 25 微升（注意從后往 前加）。 （4）將反應板置微型震蕩器上，振動混合1分鐘，取下置37C恒溫箱中作用 30分鐘后 開始觀察結果，注意每五分鐘觀察一次，直至 30 分鐘，判定并記錄結果。 判定結果如下： +紅細胞全部凝集，均勻分布于孔底。 + 紅細胞部分凝集，沉積于孔底呈小圓點狀。 - 紅細胞全部不凝集，沉積于孔底呈圓點狀。 以使紅細胞全部凝集的病毒最高稀釋倍數

5、為該病毒的凝集效價。4單位病毒的確定，以 上述血凝價除以4即為4單位病毒，如血凝價為 1:128，則1:128的0.1ml中有一個凝集單 位， 4 單位病毒為 128/4=32 ，即 1:32 為 4 個凝集單位。 孔號12345 稀釋 亠2481632 倍數 生理 鹽水 抗原 棄 ) 25 1%雞 紅細 2525252525 胞 2525 2525 25 25 252525 25 6789101112131415 64128256512102420484096819216384 對照組 振蕩混勻置30C恒溫箱30分鐘 2血凝抑制試驗(HI)血凝試驗可以被病毒血清所抑制，因此可以通過血凝抑制試

6、驗檢 測抗病毒抗體。根據抗體效價的高低，可制訂預防疾病的合理的免疫程序，也可間接得知雞 群是否存在病毒， 對科學地防治具有重要意義。具體方法如下(見表2): (1) 清潔的96孔V型微量血清反應板一塊，在每孔中加生理鹽水25微升(每一份血 清加一列)。 (2) 將被檢血清25微升加入第1孔中，充分混合后，取 25微升加入第2孔中，如此 稀釋直至第10孔，第11孔不加血清為抗原對照孔，第12不加血清和抗原為紅細胞對照。 (3) 根據血凝試驗測定的病毒效價，配制4個血凝單位病毒稀釋液。 (4) 將反應板置混合器上振蕩 3分鐘，取下放室溫10分鐘。 (5) 每孔中加入1 %雞紅細胞各25微升。 (6) 置微型混合器上振蕩3分鐘，取下放室溫15分鐘開始觀察，至 60分鐘判定記錄 結果. 單位：微升 表2 :血凝抑制試驗(HI) 孔號123456789101112 稀釋倍數 248163264 128 256 512 1024抗原對照紅細胞對照 生理鹽水 待檢血清 4單位病毒 1%雞紅細胞 2 25-. 25 25-5 25 25 2525 振蕩混勻 2525 振蕩混勻 2525 1分鐘后置 2525 1分鐘后置 252