1、課題6血紅蛋白的提取和分離知識點總結、實驗原理蛋白質的物化理性質：形專差萬別，由此提取和分離各種1凝膠色譜法(分配色譜法)：(1) 原理：分子量 大的分子通過 多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過 多孔凝膠顆粒內部，路程長，流動慢。(2) 凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。(3)分離過程:混合物上柱t洗脫t大分子流動快、小分子流動慢t收集大分子t收集小分子*洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質分子的差速流動。(4)作用： 分離蛋白質，測定生物大分子分子量，蛋白質的脫鹽等。2 緩沖溶液(1) 原理：由弱酸和相應的強堿弱酸鹽組成(如H2CO3 NaHC03

2、, NaH2PO4/Na2HPO4等)，調節酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。(2) 緩沖液作用： 抵制外界酸、堿對溶液 pH的干擾而保持pH穩定。3. 凝膠電泳法：(1) 原理：不同蛋白質的 帶電性質、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力 大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質在電場中的運動方向和運動速度不同。(2) 分離方法： 瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。(3) 分離過程：在一定pH下，使蛋白質基團帶上正電或負電；加入帶負電荷多的 SDS 形成“蛋白質-SDS復合物”，使蛋白質遷移速率僅取決于分子大小。二、實驗步驟1 樣品處理 紅細胞的洗滌洗滌紅細胞的目的是 去除雜蛋白，

3、采集的血樣要及時采用 低速短時間 離心分離紅細胞， 然后用膠頭吸管吸出上層透明的 黃色血漿，將下層暗紅色的紅細胞液體倒入燒杯,再加入五 倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時間離心，如此重復洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。 血紅蛋白的釋放在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。注：加入蒸餾水后紅細胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細胞膜， 有利于血紅蛋白的釋放和分離。2 粗分離分離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為 4層。第一層為無色透明的 甲苯層，第 2層為白色薄層固體，是 脂溶性物質的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是

4、 血紅蛋白的水 溶液,第4層是其他雜質的暗紅色沉淀物。 將試管中的液體用濾紙過濾， 除去之溶性沉淀層， 于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。透析取1mL的血紅蛋白溶液裝入 透析袋中,將透析袋放入盛有 300mL的物質的量的濃度為 20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中 分子量較小 的雜質，或用于更 換樣品的緩沖液。3. 純化調節緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝J膠面平齊，關閉出口。加入蛋白質樣品：用吸管將透析后的樣品沿管壁環繞移動 加到色譜柱的頂端。加樣后，I打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全滲入凝膠層后，J關

5、閉出口。調節緩沖液面：加入 20mmol/L的磷酸緩沖液到適當高度洗脫：連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進行洗脫。收集分裝蛋白質：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集。4. 純度鑒定-SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）三、注意事項1. 電泳技術電泳技術就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的。2. 紅細胞的洗滌如果分層不明顯，可能是洗滌次數少、 未能除去血漿蛋白的原因。 此外，離心速度過高 和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀， 也得不到純凈的紅細胞， 影響后續血紅蛋白

6、 的提取純度。3如何檢測凝膠色譜柱的裝填是否成功由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整,說明凝膠色譜柱的性能良好。 如果色譜柱出現紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。4. 為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內形成無效的空隙，使本該進入凝膠內部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。5沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的不但節約時間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物 和排除凝膠

7、內的空氣。6. G-75“ G代表凝膠的交聯程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5g。7裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密8加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要緩慢攪拌？ 防止血液凝固；防止白細胞沉淀；防止紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。9與其他真核細胞相比，紅細胞的特點及這一特點對進行蛋白質的分離的意義 哺乳動物及人的成熟的紅細胞是雙面凹圓餅狀， 沒有細胞核和細胞器 。其含有的 血紅蛋 白是有色蛋白 ，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集脫液。 這 使血紅蛋白的分離過程非常 直觀，大大 簡化 了實驗操作。10如何檢測