1、1,病毒感染的實驗診斷,王 躍臨床微免教研室,2,什么是病毒,病毒（virus）是一類體積微小、結構簡單、有嚴格的細胞內寄生性的非細胞型微生物,3,特點： 體積微小，只能在電鏡下觀察，能通過濾菌器 無完整的細胞結構：蛋白質衣殼核酸核心 只有一種類型核酸：RNA或DNA 有嚴格的細胞內寄生性，只能在活細胞內生長 以核酸復制的方式增殖，不能進行二分裂繁殖 抵抗力特殊：耐冷不耐熱，對化學因素的抵抗力較一般比細菌強，耐甘油，對抗生素及磺胺類藥物不敏感，干擾素可抑制病毒復制,4,病毒感染的實驗診斷方法,病原學診斷 病毒分離培養 顯微鏡檢查 抗原檢測 核酸檢測 血清學診斷 抗體檢測 IgM、IgG,5,一

2、、標本采集、運送和處理,一）標本采集 采集時間：盡早采集（越早越好） 標本種類：根據感染的部位、可能感染的病毒類型選擇標本種類 無菌采集標本：必要時用抗生素或抗真菌藥處理 抑制細菌生長 100U/ml青霉素100g/ml鏈霉素 抑制真菌生長 2.5g/ml二性霉素B 或40 g/ml制霉菌素 血清學檢查標本：雙份血清,6,二）標本的運送與保存,1.低溫送檢 4可保存數小時，-70可長期保存 -10 -20下病毒易滅活，不可用于保存病毒標本 對冷凍標本應避免反復凍融 2.保濕送檢 50%甘油鹽水保存送檢 病毒轉運培養基（virus transport medium ，VTM）含0.5%明膠或牛血

3、清白蛋白的Hanks液 3.無菌送檢 抑制細菌生長 100U/ml青霉素100g/ml鏈霉素 抑制真菌生長 2.5g/ml二性霉素B 或40 g/ml制霉菌素,7,二、病毒的形態學檢查,1. 光學顯微鏡檢查 主要觀察病變組織中的包涵體，某些大病毒也通過光學顯微鏡觀察。 簡便、快速，但敏感性低，有些病毒感染細胞后不形成包涵體,8,2. 電鏡及免疫電鏡檢查,直接檢查標本中的病毒顆粒，快速，可確診。但敏感性低（106/ml） 免疫電鏡敏感性高，但只能用于已知病毒的檢測,乙型肝炎病毒電鏡圖,輪狀病毒電鏡圖,9,三、病毒的分離與鑒定,10,一）病毒的分離,組織培養 雞胚培養 動物接種,11,1. 組織培

4、養,將人或動物離體的活組織或分散的活細胞在體外人工控制的條件下使其生長繁殖的一種技術。 組織培養的類型: （1）組織塊培養 （2）器官培養 人胚氣管呼吸道病毒； 人胚腸 腸道病毒 （3）細胞培養 最常用 原代和次代細胞培養 二倍體細胞培養 傳代細胞培養,12,動物新鮮組織（人胚腎等）胰酶消化營養液培養單層細胞（原代細胞） 原代細胞胰酶消化轉種培養（次代培養細胞） 對病毒敏感，但制備費時費力，只能傳23代,原代和次代培養細胞,13,二倍體細胞株 原代細胞反復傳代（5070代）仍保持二倍體染色體特性。病毒分離和疫苗制備的首選細胞株。 傳代細胞株 來源于腫瘤細胞或突變的二倍體細胞，能在體外無限增殖。

5、增殖快，不易衰老，易于傳代保存。常用于病毒的分離鑒定，但不能用于制備疫苗,14,優點 細胞來源廣、敏感細胞株多 不受機體免疫因素的影響，個體差異小 病變結果易于觀察 可用于病毒的分離鑒定和制備疫苗及抗原 缺點 條件要求相對較高，有細胞培養條件的實驗室才能做,15,2. 雞胚培養,新鮮受精卵 接種病毒,3839 713d,卵黃囊接種（流行性腦炎病毒） 羊膜腔接種（流感病毒） 尿囊腔接種（傳代培養） 絨毛尿囊膜接種（痘類病毒,16,絨毛尿囊膜表現有痘病毒的特異性損傷,17,優點 雞胚來源充足，操作簡便，有多種接種途徑 病毒增殖快，可收獲大量病毒 雞胚本身是無菌的，對接種的病毒不產生抗體 缺點 易感

6、病毒少，目前主要用于流感病毒、腮腺炎病毒、皰疹病毒和痘類病毒的分離培養。 某些病毒在雞胚內傳代后，其毒力下降,18,3. 動物接種,常用動物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。 不同病毒對動物的敏感性不同，根據病毒種類加以選擇。 接種途徑 按病毒侵襲部位選擇相應的接種途徑： 乙型腦炎病毒及狂犬病毒 小鼠腦內接種 柯薩奇病毒 乳鼠腹腔接種 乙肝病毒 黑猩猩靜脈注射 流感病毒 鼻腔滴種 用途 分離鑒定病毒，制備疫苗，制備抗血清,19,優點 方法簡單、結果易于觀察 選擇適當的接種途徑，可出現類似人類的感染癥狀，有利于發病機制的研究 缺點 可自然帶毒或隱性感染，干擾實驗結果 有個體差異 很多病毒無敏感動

7、物，或感染后不出現明顯癥狀,20,二）病毒的鑒定,病毒的初步鑒定 動物感染：敏感動物范圍、潛伏期及發病情況 雞胚接種：病毒對雞胚的敏感性、特殊病灶（如痘皰等） 細胞培養：病毒在細胞培養中的表現 理化性質的測定：主要用于新病毒的鑒定 病毒的最后鑒定 血清學鑒定: 中和試驗、補體結合試驗、血凝抑制試驗等。 分離的新病毒，必須進行系統的全面鑒定,21,病毒在細胞培養中的表現,1. 細胞代謝作用改變（培養液顏色變化） 正常細胞代謝： 培養液由紅變黃 病毒增殖，抑制細胞代謝：培養液顏色不變或更紅,22,病毒在細胞內增殖后，使宿主細胞的形態發生不同程度改變，稱為細胞病變效應（cytopathic effe

8、ct，CPE,2. 細胞形態改變,細胞變圓、融合、腫脹、細胞空泡、核濃縮、形成嗜酸性或嗜堿性包涵體等。 某些病毒感染細胞后不出現CPE,23,24,25,26,3. 干擾現象（interference） 當兩種不同的病毒同時或先后感染同一細胞時，其中一種病毒可抑制另一種病毒的增殖，稱為病毒的干擾現象。 干擾現象也可被相應特異性抗體抑制，稱為干擾抑制現象,27,4. 紅細胞吸附及吸附抑制試驗,受感染的宿主細胞膜含病毒抗原（血凝素），可吸附雞、豚鼠或猴紅細胞。 如果在培養瓶中加入相應的血凝素抗血清，則不出現紅細胞吸附現象，即紅細胞吸附抑制試驗陽性,28,病毒的理化性質測定,主要用于新病毒的鑒定 1

9、. 病毒的大小及形態 ：電鏡直接觀察及測量 2. 核酸類型: 用RNA酶或DNA酶處理病毒。 3. 乙醚敏感試驗: 有包膜病毒對乙醚敏感，經乙醚作用后，失去感染性 4. 耐酸試驗 腸道病毒耐酸，在pH3的環境下穩定，鼻病毒不耐酸，在pH3的環境下被滅活,29,病毒的血清學鑒定,對初步鑒定為陽性的標本均需要用血清學方法做最后鑒定。 方法：血凝抑制試驗、中和試驗、免疫熒光試驗、ELISA等,30,四、病毒的血清學診斷,用已知病毒抗原檢測患者血清中的相應抗體，可協助診斷病毒感染。 雙份血清IgG測定 4倍以上增長，有診斷意義 單份血清IgM測定 可用于早期診斷，但部分病人可能陰性，少數病人產生的特異

10、性IgM抗體也可在體內持續存在12年,31,病毒血清學試驗常用方法,一）中和試驗 原理 抗體與相應病毒結合后，能夠使病毒失去感染性。 V.Ab 失去感染易感細胞的能力 一定量抗體可中和一定量病毒 根據抗體的效價對待測病毒液進行半定量檢測。 中和試驗的必要條件： 1. 活病毒 2. 敏感細胞、雞胚或動物,32,中和試驗的特點： 特異、敏感，既可檢測抗體，也可測定抗原（定屬、定型）。 既可用細胞培養做，也可用動物或雞胚接種，以細胞培養法最常用。 檢測IgG，不能用于早期診斷，常用于流行病學調查,33,二）補體結合試驗,檢測IgM，常用于早期診斷。 不需活細胞，比中和試驗簡單，省時。 （三）IF及ELISA 方法簡單、快速、敏感性高。 檢測特異性IgM，有助于某些病毒感染的早期診斷，如： 孕婦羊水中檢測IgM型特異抗體：胎兒先天性感染 抗HBc IgM：作為急性HBV感染的指標,34,四）血凝及血凝抑制試驗,含有血凝素的病毒能吸附一定種類的哺乳動物或禽類的紅細胞，使紅細胞凝集。該現象可被相應的血凝素抗體抑制，稱為血凝抑制試驗，可用于病毒的分型,35,五、病毒抗原檢查,DFA、IFA、IEA等。 可檢測細胞內、外