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2、素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星、泰樂菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉它霉素、交沙霉素）殘留量的高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)測定方法。樣品均質后, 羅紅霉素為內標、乙腈萃取、氯化鈉去除蛋白質、正己烷脫脂，采用HPLC-MS/MS選擇反應監測(SRM)正離子模式測定,基質匹配標準曲線，同時對畜禽肉中9種大環內酯類抗生素進行定性和定量。實驗結果表明, 9種大環內酯類抗生素在0.05 ng2.5 ng之間呈線性關系，相關系數0.9970，平均回收率為75.0%119.9%，方法檢出限(LOD)為0.5g/kg，方法定量限（LOQ）為1.0g/kg，相對標準偏差（RSD）在4.7%9.7%

3、。各項技術指標均滿足國內外相關法規要求,實現了畜禽肉中9種抗生素殘留的同時檢測。關鍵詞 畜禽肉；大環內酯；殘留；固相萃取；液相色譜-串聯質譜； 中圖分類號：O 657.7 文獻標識碼：A 文章編號：大環內酯類（macrolide antibiotics）抗生素以一個大環內酯通過羥基以苷鍵與13 個去氧氨基糖或二甲氨基糖縮合成堿性苷1，有較強的抗菌活性2。抗菌譜主要為革蘭氏陽性菌及某些革蘭氏陰性球菌。該類抗生素曾廣泛地應用于食用動物作為預防和治療用藥，通常采用飼喂或注射方式，容易造成畜禽肉中存在殘留，通過食用途徑進入人體。該類藥物對人體的不良反應主要是導致茶堿血濃度升高而致中毒、對前庭和耳蝸神經

4、的損害，嚴重者造成肝腎的嚴重損害，甚至死亡3，因此，世界各國對大環內酯類抗生素藥物殘留均有嚴格的限量要求，歐盟已禁止在供食用動物中的飼料中使用，中國也有相應的要求4，5。因此，建立一種高靈敏度的測定畜禽肉中大環內酯類抗生素的多殘留方法是十分必要的。測定動物源大環內酯類抗生素已見報道的主要分析方法有微生物法6、熒光光度法7、紫外分光光度法8、薄層色譜法9、高效液相色譜法10，11、毛細管電泳法(CE)12和液質聯用技術LC-MSn法1320等方法。本研究以文獻4，10，1321為主要參考，重點研究了畜禽肉中有代表性的牛肉、羊肉、豬肉、雞肉中9種大環內酯類抗生素的提取和凈化條件，確定了提取條件，成

5、功建立了液相-串聯質譜測定的方法。4年的實踐應用證明，操作簡單、回收率穩定、靈敏度高、選擇性好，最小檢出限均達到0.5 g/kg，可以滿足對該類藥物殘留限量的檢測要求。1 實驗1.1 試劑與標準溶液甲醇、乙腈、正己烷為色譜純；甲酸銨、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、氯化鈉為優級純；水為GB/T 6682規定的一級水；2%氯化鈉溶液，0.1 mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH=8），甲醇-水溶液（2+3），0.1 mmol/L甲酸銨溶液；標準物質：林可霉素（lincomycin，LIN）、竹桃霉素（oleandomycin，OLE）、紅霉素（erythromycin，ERY）、替米考星（tilmicosi

6、n，TIM）、泰樂菌素（tylosin，TYL）、克林霉素（clindamycin，CLI）、螺旋霉素（spiramycin，SPI）、吉它霉素（kitasamycin，KIT）、交沙霉素（josamycin，JOS）和內標物羅紅霉素（luohongmeisu，LH）的純度95%。吉它霉素購置于Sigma-AL deich Laborchemikalien GmbH，其它購置于Dr.Ehrenstorfer GmbH。5個系列基質標準工作溶液:用樣品空白提取液配成內標濃度10.0 ng/mL、9種標準物質含量分別為1.0 ng/mL、2.0 ng/mL 、5.0 ng/mL、10.0 ng/m

7、L、50.0 ng/mL濃度的系列基質標準工作溶液，用前配制。1.2儀器液相色譜-串聯質譜儀：AB 3200 Q TRAP配有電噴霧離子源（美國應用生物系統公司）；固相萃取裝置；氮氣濃縮儀；Oasis HLB固相萃取柱（500 mg,6 ml）。使用前，依次用10 mL甲醇、10 mL水、5 mL濃度2%氯化鈉溶液和5 mL濃度0.1 mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液活化，保持柱體濕潤。1.3 實驗條件1.3.1 液相色譜條件色譜柱：Intersil C18，150 mm2.1 mm，3 m；流動相：A：0.01 mol/L甲酸銨溶液，B：乙腈；流速：0.5 mL/min；進樣量：20 L；柱溫：

8、40。1.3.2 質譜掃描條件離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應檢測；電噴霧電壓：5 500 V；霧化氣壓力：0.069 MPa；氣簾氣壓力：0.69 MPa；輔助氣流速：0.414 MPa；離子源溫度：350；碰撞室出口電壓：2.0 V；流速：20 L/min；定性離子對、定量離子對、碰撞氣能量和去簇電壓見表1。表1 九種大環內酯的定性離子對、定量離子對、碰撞能量和去簇電壓Analyte Parent ion Fragment ion Collision energy/V Cone voLtage/V (m/z) (m/z)LIN 407/126 407/126 3

9、7 50407/359 24 50OLE 688/158 688/158 70 30688/544 42 30ERY 734/158 734/158 42 50734/576 28 50TIM 869/174 869/174 62 90869/132 70 90TYL 916/174 916/174 54 80916/145 55 80CLI 425/126 425/126 45 53425/377 28 53SPI 843/142 843/142 48 60843/174 50 60KIT 772/215 772/215 43 70772/109 42 70JOS 828/174 828/1

10、74 45 80828/109 45 801.4樣品處理精稱5.00 g左右的試樣，于50 mL離心管中，加入10.0 L 內標工作溶液和15.0 mL乙腈，靜止片刻后于振蕩器上劇烈振蕩10 min；以4 200 r/min的轉速離心5 min；取上清液于另一離心管中，加入2 g氯化鈉和10 mL正己烷，劇烈振蕩10 min；4 200 r/min的轉速離心10 min，小心吸取中間乙腈層12.0 mL于另一離心管中，55水浴中吹至近干。用7 mL磷酸鹽緩沖溶液分二次溶解殘液，使樣液以小于1 mL/min的流速通過Oasis HLB固相萃取柱。樣液全部流出后，依次用10 mL水和5 mL甲醇-

11、水溶液（2+3）洗柱，棄去全部流出液，用真空泵抽干固相萃取柱。再用10 mL甲醇洗脫于15 mL錐形試管中，用氮氣濃縮儀于55水浴中吹至近干，準確加入1.0 mL甲酸銨溶液溶解殘渣。過0.2 m濾膜后，供液相色譜-串聯質譜儀測定。2 結果與討論2.1方法的選擇根據前人研究資料，重點研究了提取液、樣液濃縮、緩沖溶液、固相萃取柱、洗脫劑用量對結果的影響。2.1.1提取溶液、不同固相萃取柱對回收率的影響我們對4種提取溶液和3種固相萃取柱的萃取效率進行了實驗，結果見表2。表2 不同提取溶液、不同固相萃取柱對回收率的影響（%）Analyte Varian C18 Bakerbond spe C18 Oa

12、sis HLB Extraction buffer Solution1 Solution2 Methyl alcohol Methyl cyanide LIN 133.8 68.4 10.4 8.7 36.0 89.9OLE 61.0 39.2 40.8 39.3 63.7 74.0ERY 6.3 54.0 95.4 36.9 94.9 93.9TIM 54.6 124.0 91.2 41.1 110.0 103.0TYL 56.6 106.0 61.6 24.1 131.0 84.5CLI 49.4 69.4 66.9 138.0 50.0 126.0SPI 82.4 99.8 88.9 2

13、6.0 147.0 123.4KIT 7.4 22.6 45.3 22.7 49.0 73.6 JOS 1.5 9.3 61.0 26.4 73.3 97.6注：Solution1：0.1mol/L Sodium hydrogen phosphate; Solution2：0.3% Phosphoric acid - Methyl alcohol(7+3).根據表6實驗數據，乙腈提取效率最高，Oasis HLB固相萃取柱的效果最理想。2.1.2緩沖溶液、不同固相萃取柱對回收率的影響考察了固相萃取柱的0.1 mol/L磷酸氫二鈉緩沖液、0.1 mol/L碳酸鈉緩沖液、0.2 mol/L乙酸鈉緩沖

14、液對回收率的影響，對比結果見表4。為確定過Oasis HLB固相萃取柱時，緩沖溶液對回收率的影響，將0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液調整pH值為3、4、5、6、7、8、8、10進行過柱回收率實驗。實驗結果見表3。表3 三種緩沖溶液對回收率的影響（%）Analyte Sodium acetate Sodium carbonate 磷酸鹽緩沖溶液（Sodium hydrogen phosphate） 0.2 mol/L 0.1 mol/L 0. 1 mol/LpH值 3 4 5 6 7 8 9 10LIN 1.7 20.9 66.9 96.0 77.7 116.0 102.0 92.0 111.0

15、 33.8OLE - 76.2 66.6 79.4 62.3 66.8 77.2 78.4 72.8 80.2ERY 27.7 37.5 6.3 30.4 41.6 55.2 40.4 78.0 113.0 74.4TIM 71.1 24.1 8.3 4.3 3.4 45.0 42.3 72.0 94.2 103.2TYL 7.4 15.2 56.6 81.8 58.6 83.0 58.0 85.6 72.6 66.0CLI 22.6 2.6 49.4 58.0 43.6 47.0 50.4 70.0 63.4 41.8SPI 3.4 1.1 3.3 5.7 5.1 15.6 3.0 83.2

16、 83.0 15.5KIT 1.1 1.5 7.4 18.6 8.2 11.8 13.4 68.8 73.6 8.3JOS 1.1 1.1 14.7 52.4 21.2 42.8 32.4 67.6 61.6 21.4從表4中數據表明，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液優于其它兩種緩沖溶液，緩沖溶液pH值=8時，回收率均在67.5%以上。因此，選擇緩沖溶液pH值為8的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液作為固相萃取柱的緩沖溶液。第 12 頁 共 12 頁2.2 液相色譜條件對色譜柱進行了優化，選擇Intersil C18，150 mm2.1 mm，3 m，使分離效果達到最佳；確定進樣量為20 L，流

17、速為0.5 mL/min，柱溫：20 C，再對流動相梯度洗脫條件優化（A：0.01 mol/L甲酸銨溶液，B：乙腈），使樣液中九種大環內酯類抗生素分離效率達到最佳。梯度洗脫條件見表4。表4 梯度洗脫條件Table 8 Gradient conditionsTime（min） Flow rate（mL/min） A B0.0 0.50 95 51.0 0.50 95 56.0 0.50 40 606.1 0.50 5 9510.0 0.50 5 9510.1 0.50 95 520.0 0.50 95 52.3 質譜條件用注射泵將含有羅紅霉素內標的9大環內酯類抗生素混合標準溶液以20 L/min

18、的速度直接注入離子源，用正離子檢測方式一級質譜分析（Q1掃描）和二級質譜分析（子離子掃描），然后再對去簇電壓（DP）、碰撞氣能量（CE）、電噴霧電壓、霧化氣和氣簾氣壓力進行優化，使每種抗生素的分子離子與特征碎片離子產生的離子對強度達到最大，從中選擇每種抗生素的監測離子對；將液相色譜和串聯四極桿質譜儀聯機，對離子源溫度、輔助氣流速進行優化，使每種抗生素的離子化效率達到最佳。九種大環內酯類抗生素參考保留時間分別為LIN 6.96、OLE 7.36、ERY 8.06、TIM 8.36、TYL 8.48、CLI 8.51、SPI 8.67、KIT 8.83和JOS 9.14 min。九種大環內酯類抗生

19、素標準物質檢測離子圖，見圖1。2.4線性范圍和測定低限用空白樣品提取液配制基質標準工作溶液，進樣量20 L，用峰面積對基質標準工作溶液中被測組分的濃度作圖，其線性范圍、線性方程和線性相關系數見表5。表5 九種大環內酯類抗生素線性方程和相關系數9種抗生素在0.05 ng2.5 ng范圍時，響應值均在儀器線性范圍之內。在信噪比S/N5的條件下，每種大環內酯類抗生素的檢出限（LOD）均為0.5 g/kg，其定量限（LOQ）1.0 g/kg，滿足檢測要求。線性方程和相關系數見表5。2.5方法的回收率和精密度用不含九種大環內酯類抗生素的牛肉樣品進行添加不同濃度標準后，搖勻，放置一段時間使標準樣品充分吸收

20、。然后按本方法進行提取、凈化、測定，其回收率和精密度見表6。表6 九種大環內酯類抗生素添加回收率與精密度實驗數據（%）從表6中的回收率及精密度數據可以看出，在1.0 g/kg、2.0 g/kg、5.0 g/kg、10.0 g/kg添加水平上，回收率數據全部在75.0%116.9%之間，室內四個水平相對標準偏差均在9.9%以內，說明該方法重現性很好。2.6 方法的適用性用羊肉、雞肉、牛肉、豬肉采用本方法在1.0 g/kg、2.0 g/kg、5.0 g/kg、10.0 g/kg四個添加水平，對九種大環內酯類抗生素進行添加回收率實驗，其分析結果見表7。表7. 方法的適用性添加回收率（回收率%）品種

21、牛肉Beef（g/kg） 羊肉Mutton（g/kg） 豬肉Pork（g/kg） 雞肉chicken（g/kg） 水平 1 2 5 10 1 2 5 10 1 2 5 10 1 2 5 10CLI 110.3 79.7 88.3 85.0 114.3 76.8 83.6 79.4 76.7 114.4 82.3 88.4 82.2 76.5 80.6 81.8LIN 112.4 79.4 91.8 79.4 76.9 108.4 112.3 81.6 80.0 76.9 76.8 80.2 82.1 76.4 88.3 79.2JOS 114.3 89.7 76.3 82.4 119.8 11

22、7.6 116.3 118.5 76.4 78.2 81.6 79.3 118.3 115.2 119.3 115.4ERY 116.9 106.8 94.3 92.4 119.9 118.4 114.3 117.6 76.3 80.8 75.2 79.2 75.5 83.4 76.9 78.1SPI 77.5 116.2 81.6 92.5 75.3 118.3 76.8 76.7 85.6 119.3 76.4 77.7 75.0 75.2 79.3 78.4TIM 76.4 88.3 79.4 86.9 119.2 76.6 79.4 78.9 75.2 81.3 79.9 77.6 7

23、7.6 91.2 79.6 77.4TYL 114.2 78.6 92.7 90.6 85.9 79.3 76.4 88.1 78.6 79.2 85.4 81.0 75.4 81.8 76.2 79.3OLE 80.5 106.3 79.2 94.3 82.3 95.4 76.5 78.0 77.1 81.7 80.9 76.3 82.4 79.3 88.0 76.9KIT 82.3 110.3 113.6 78.4 75.1 76.2 78.3 81.0 112.3 79.4 82.1 113.6 79.1 108.2 93.4 77.7在九種大環內酯類抗生素出峰區域未見干擾峰，樣品的回收

24、率在75.0119.9之間，所做空白樣品實驗也表明，對于羊肉、雞肉、牛肉、豬肉等樣品，本方法的適用性很好。2.7方法的實驗室間驗證本方法經8個實驗室進行重復性和再現性驗證。用不含九種大環內酯類抗生素的牛肉樣品分別做1.0 g/kg、2.0 g/kg、5.0 g/kg、10.0 g/kg四個水平的添加回收率實驗，驗證結果見表8。表8. 8個實驗室驗證實驗統計表（g/kg，回收率%）表12. 8個實驗室驗證實驗統計表（牛肉，g/kg，回收率%）（續3） 名稱泰樂菌素竹桃霉素吉它霉素單位 水平1.02.05.010.01.02.05.010.01.02.05.010.010.861.504.029.

25、350.851.804.498.210.851.864.417.980.881.553.999.030.861.854.488.480.851.854.287.9120.821.544.009.090.881.594.387.960.821.644.349.040.831.544.038.920.901.634.298.150.801.704.328.9930.871.534.268.840.821.744.098.880.841.784.428.890.861.594.388.940.821.774.248.970.861.824.399.0540.881.554.178.930.821.624.018.970.851.804.349.080.881.574.258.850.841.684.118.880.881.804.268.9650.851.494.328.600.881.634.669.120.821.734.498.390.851.524.298.440.881.624.599.200.851.674.308.2060.871.534.197.930.821.754.098.880.841.784.428.990.861.594.037.840.8201.774.248.970.8651.824.399.0570.911.554