1、a,實驗四 DNA回收純化及重組體的構建,a,實驗目的和要求 學習和掌握從PCR產物中回收DNA片段的方法。并了解從瓊脂糖凝膠中純化DNA片段的有關技術。 本實驗采用粘末端連接法將PCR擴增的DNA片段插入到pBluescript KS質粒載體中，掌握DNA重組方法。通過本實驗了解DNA重組技術在分子生物學研究中的重要意義,a,DNA片段的純化： DNA純化的主要目的是回收得到純的目的DNA片段，去除影響DNA連接酶活性的物質以及其它的DNA片段。純化DNA片段的方法有多種，如：電洗脫法、從低熔點或普通瓊脂糖凝膠中回收、玻璃珠純化、柱層析以及硅膠吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接從 PCR

2、產物中或瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的試劑盒，有效地加快了DNA的純化的速度,相關基礎知識,a,DNA重組本質上是一個酶促生化過程，是指將外源目的基因片段通過DNA連接酶的的作用插入到質粒載體中的過程。DNA片段只有與載體重組并轉入合適的宿主細胞中才能進行復制。通過此方法可以對單個基因的功能進行研究。結合PCR技術還可以應用于疾病診斷、合成具有商業意義的產品，如胰島素、干擾素等,DNA重組,a,因為載體具有能夠在特定宿主細胞中獨立自我復制的復制起始點，保證插入的外源片段的復制；并且具有多個限制性內切酶的單一位點，即多克隆位點，用于插入外源片段，而又不破壞質粒本身的結構；還具有易于篩選和檢測的標記

3、性基因，如抗藥性基因、酶基因或營養缺陷型等。但針對不同的研究目，選擇的擇載體也是不同的，不僅要考慮上述特性，而且還要考慮所選載體是表達載體還是非表達載體、是真核生物表達載體還是原核生物表達載體以及酶切位點等方面的問題,載體的選擇,a,主要有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。E. coli DNA 連接酶催化DNA分子連接的機理與T4噬菌體DNA連接酶基本相同，只是輔助因子不是ATP而是NAD+。T4噬茵體DNA連接酶催化DNA連接反應分為三步,DNA連接酶,a,a,T4噬菌體DNA連接酶還有一種E. coli DNA連接酶沒有的特性即將兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來的功能

4、。對于這種連接反應的機理目前還不清楚，總的來說這種連接的效率比粘性末端的連接效率要低得多，可能是因為平末端DNA分子無法形成類似粘性末端分子那樣的相對穩定的結構,a,Weiss單位（Weiss等,1968），是指在37oC下20分鐘內催化1nM 32P從焦磷酸根置換到,-32P ATP所需酶量； （NEB公司，粘性末端）將1g由HindIII酶解的DNA的12堿基對粘性末端在160C條件下、30分鐘、20l反應體系中連接50時所需酶量。 (Takara公司)在20l的反應體系中，6g的DNA-HindIII的分解物在160C反應30分鐘時，有90以上的DNA片段進行連接的酶的活性為1U。 相當

5、于 ATP-Ppi交換反應中0.008 Weiss U,對于T4-噬菌體DNA連接酶的活性測定至少有三種以上的方法,a,連接反應的一項重要參數是溫度。理論上講連接反應的最佳溫度是37，此時連接酶的活性最高。但37時粘性末端分子形成的配對結構極不穩定，因此人們找到了一個既可最大限度地發揮連接酶的活性，又有助于短暫配對結構穩定的最適溫度即1216。 DNA的連接主要有粘性末端和平端連接法，這些主要根據外源片段的末端性質、質粒性質以及兩者的酶切位點來確定,連接,a,粘末端連接法 若DNA插入片段與適當的載體存在同源粘性末端，這將是最方便的克隆途徑。同源粘性末端包括相同內切酶產生的粘性末端和不同的內切

6、酶產生的互補粘性末端。相同內切酶產生的粘末端連接得到的重組質粒能夠保留接合處的限制酶切位點，因此可以使用原來酶將插入片段從重組體上完整地重新切割下來。而不同酶產生的粘性末端連接得到的重組質粒不能夠保留接合處的限制酶切位點，因此不可以使用原來酶將插入片段從重組體上完整地重新切割下來。以上兩類粘性末端的連接方法都很重要,a,另外，當用單酶切時，雖然產生了互補的粘性末端，但由于載體存在自連現象，也會降低正確插入的頻率。通過一些處理可以減少自連現象的發生。常用的方法是用小腸堿性磷酸酶(CIP)去掉載體5-磷酸來達到抑制DNA片段的自身環化的目的。 綜上所述，在進行基因重組時，一般采用插入片段及載體兩端

7、具有兩個相應的能夠產生粘性末端的酶進行酶切后重組，如插入片段和載體的一端為EcoR I ，另一端為BamH I，它們都能產生粘性末端，不僅易于連接，而且又不能互補，所以能夠得到較好的重組結果,a,a,平端連接法： 待插入片段的平末端主要由兩方面來源，即由酶切后產生的平端和補平后產生的平端。一般由酶切產生的平端較易連接。但在試驗過程中，往往會遇到插入片段和載體之間沒有互補的末端，這時，就需要將末端進行“補平”或去除3突出端，然后再用T4噬菌體DNA連接酶連接兩個平端。不過，平端連接的效率是比較低的，一般通過提高DNA的濃度或增加連接酶的用量可提高平端的連接效率，有時也可采取在平端加上合成的接頭的

8、方法，產生粘性末端，也可以提高連接的效率,a,適當的插入片段與載體分子比率能減少多拷貝插入片段的形成，一般采用載體：插入片段摩爾數為1：2-3的比例,載體及插入片段的量,a,實驗材料與儀器： PCR產物(0.8kb，帶有BamHI、 HindIII酶切位點) pBluescript KS 質粒(3.0kb) NEB 1kb 標準分子量片段 BamHI、 HindIII限制酶及 10K buffer 瓊脂糖 T4 DNA ligase 及其緩沖液(Takara) TBE緩沖液(10) 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 上樣液(3,a,a,電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，凝膠成像儀，一次性塑料手套等,

9、a,實驗方法和步驟,PCR產物的純化-PCR產物以及空載體的酶切-乙醇沉淀-電泳檢測-連接-160C過夜,a,A 從PCR產物中直接回收純化DNA (Promega 公司) 直接加100l純化緩沖液于1.5ml離心管，再加入30300l PCR反應物，Vortex混合； 加入1ml樹脂輕輕Vortex 3次，每次間隔1分鐘； 進入C步驟,DNA回收純化步驟： 回收PCR產物常采用兩中方法，即直接回收和從凝膠中回收，目前有許多公司出售相關的試劑盒,a,B 從瓊脂糖凝膠回收純化DNA 用瓊脂糖凝膠分離PCR片段，用UV觀察EB染色條帶； 用干凈的刀片切出所需DNA條帶，注意要在長波長（300nm）

10、UV燈下操作，并快速操作，以免損傷DNA。應盡可能多地去除瓊脂糖凝膠，一次操作可切取多至300mg的條帶,a,將300l (300mg) 瓊脂糖條片轉移至1.5ml離心管。直接在70溫育直至凝膠全部溶化（一般可按公司提供的說明書進行）； 加1ml樹脂，徹底混合20秒，但不用Vortex； 下接C步驟,a,C 純化步驟 將取出拉桿的注射器筒（3ml）裝在純化柱上，加入上述DNA與樹脂混合液，然后裝上拉桿，慢慢將混合液推進純化柱內； 卸下注射器筒，拔出拉桿，再將注射器筒裝上純化柱，加2ml 80%的Isopropanol, 然后裝上拉桿，慢慢推出液體以清洗柱子,a,再次卸下注射器筒，將純化柱裝在1

11、.5ml離心管上，10000g離心2 min，以干燥樹脂； 再將純化柱裝在一個新的1.5ml離心管上，加50l水或TE緩沖液，1分鐘后，10000g離心20秒，溶出DNA片段； 移去純化柱，將純化出的DNA溶液在-20下保存備用,a,D 說明 若向1ml樹脂中加入500bp PCR產物50ng至16g，其回收率可在95以上。同樣500bp，若從低溶點瓊脂糖凝膠中回收其回收率在7090之間,a,學生PCR實驗結果(4l,PCR 產物純化后(相當于0.8 l原PCR產物,pBluescript 酶切后,PCR 純化并酶切后 (2l,a,DNA重組,本實驗是將具有BamHI和HindIII粘性末端的

12、基因片段以及載體通過DNA連接酶連接起來,a,方法1（酶切后乙醇沉淀，適于PCR產物的重組）： 在滅菌的 Eppendorf 管中加入制備pBluescript KS空載體0.2-1g(針對本實驗，取4l約800ng)，2 l 10酶切緩沖液， BamHI & HindIII酶各1l（各5單位），用無菌雙蒸水加至20l 反應體系，于37保溫1-3h； 在另一管中加入待插入的DNA片段（純化的PCR產物）0.2-1g(本實驗約為4-10l)，2l 10酶切緩沖液，HindIII 和 BamHI酶各1l（各5單位），用無菌雙蒸水加至20l 反應體系，于3 7保溫 1-3 h,操作步驟,a,根據實驗

13、情況而定，完畢后各取3l酶解液做電泳分析，觀察酶解是否完全）將酶解液加入2倍體積的100乙醇以及1/10體積的3M NaAC(pH=5.2)，置-20冰箱 30min。4oC，12,000rmin離心 10 min，棄上清，加入100l 70乙醇(洗滌沉淀物)，離心去上清，室溫干燥DNA 沉淀15分鐘左右，加入 10 l 水或TE緩沖液溶解DNA； 完畢后各取2l DNA做電泳分析，0.8%瓊脂糖凝膠，進行初步定量（同時還可以觀察載體的酶切結果,a,將酶切后的 2個DNA片段（有時需要在70oC加熱15分鐘使酶失活及酚氯仿抽提），然后按載體：待插入DNA片段1：2（摩爾）混合于一管中（載體可用50-100ng，對于本實驗約1 l載體，2 l DNA片段，根據電泳結果來判斷 ） ，加入T4 DNA連接酶緩沖液1l，最后加T4噬菌體DNA連接酶1l(5單位)，一