NOTCH信號通路在糖尿病腎病足細胞損傷中的研究論文河北醫科大學學位論文使用授權及知識產權歸屬承諾本學位論文在導師或指導小組的指導下,由本人獨立完成。本學位論文研究所獲得的研究成果,其知識產權歸河北醫科大學所有。河北醫科大學有權對本學位論文進行交流、公開和使用。凡發表與學位論文主要內容相關的論文,第一署名單位為河北醫科大學,試驗材料、原始數據、申報的專利等知識產權均歸河北醫科大學所有。否則,承擔相應的法律責任。二級學院領導蓋章,、研究生簽名勻戔導師簽年月日河北醫科大學研究生學位論文獨創性聲明本論文是在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果,除了文中特別加以標注等內容外,文中不包含其他人已發表或撰寫的研究成果,指導教師對此進行了審定。本論文由本人獨立撰寫,文責自負。、導師簽章研究生簽名勻乞車目錄中文摘要英文摘要英文縮寫研究論文信號通路在糖尿病腎病足細胞損傷中的研究引言第一部分信號通路在糖尿病腎病患者腎組織中的表達及意義前言剛舌材料與方法結果附圖附表討論小結參考文獻第二部分信號通路在糖尿病小鼠腎組織中的表達及意義前言月舌材料與方法結果附圖附表討論小結參考文獻第三部分信號通路在體外高糖培養足細胞中的表達及意義前言日吾材料與方法結果附圖討論小結參考文獻結論綜述信號通路的研究進展致謝個人簡歷中文摘要信號通路在糖尿病腎病足細胞損傷中的研究摘要目的糖尿病腎病,是糖尿病的常見并發癥,是引起終末期慢性腎功能衰竭的主要原因之一。的發病機制非常復雜,糖脂代謝紊亂、血流動力學改變、氧化應激反應及多種細胞因子等是其主要起始因素。在這些起始因素的下游,又有多條信號傳導通路在其中發揮著重要作用。近年來發現信號通路在的發生、發展過程中起著重要作用。已有研究表明,通路決定胚胎發育、細胞增殖和分化,在胚胎后腎形成過程中對足細胞和腎小管的分化中起著重要的作用。近年來在腎臟疾病領域的研究證實,信號通路與糖尿病腎病、局灶節段性腎小球硬化、腎病綜合癥等多種腎小球疾病有關,參與腎小球硬化的發生。在哺乳動物體內信號通路有四種受體和五種配體,其中受體為,配體分別為、樣配體、和。配體與受體的結合導致受體構象發生改變,隨后在丫分泌酶的介導下發生蛋白水解作用,釋放出胞內域,轉移至細胞核內,活化和等分化拮抗基因的轉錄,阻礙分化效應基因的表達,影響細胞的分化、增殖和凋亡。既往研究認為,的主要病理特征是腎小球基底膜。增厚、細胞外基質,堆積、腎小球硬化、腎小管萎縮及腎間質纖維化。近年研究發現,足細胞損傷在發生、發展過程中起重要作用。足細胞是終末分化的腎小球上皮細胞,它附著在外側,是腎小球濾過膜的重要組成部分。由于足細胞是高度分化細胞,增殖能力較差,當足細胞受到損傷時,和等足細胞相關蛋白在足細胞裂孔膜,丟失,使腎小球濾過電荷屏障減弱,促進蛋白尿的發生。足盂蛋白,是足突項膜區主要的帶負電荷跨膜蛋白,當足細胞損傷后表達減少,破壞了足突間的排斥作用使之發生粘附、融合,導致足細胞易于中文摘要脫落。現已知主要的凋亡通路有、心等,在發生時,足細胞內的這些凋亡通路可被激活,誘導足細胞凋亡。同時受損的足細胞對生成的調節作用發生紊亂,轉化生長因子,等促進基質生成的因素增加,造成型膠原等基膜樣基質增加,導致腎小球硬化,加速的進展。許多學者通過不同方法證實了信號通路在足細胞分化中的作,抑制小鼠用,等使用,分泌酶抑制劑丫后腎形成過程中通路的活化,發現近端小管細胞和腎小球中足細胞的形成明顯減少,而伴隨非上皮細胞的增多。如果在足細胞發育過程中出現異常通路的活化,可抑制足細胞的終末分化,引起小鼠腎小球硬化。我們通過收集臨床糖尿病腎病標本、建立糖尿病小鼠模型及足細胞高糖,培養,檢測信號通路家族成員、及的表達情況,并通過應用血管緊張素受體阻斷劑,、基因干擾技術及信號通路抑制劑抑制通路,來觀察是否信號通路參與時的足細胞損傷,促進足細胞凋亡和細胞外基質沉積,為糖尿病腎病的治療提供一條新的思路。方法糖尿病腎病患者腎組織中信號通路檢測收集年月年月在河北醫科大學第三醫院經病史、臨床檢查及腎穿刺活檢病理診斷為糖尿病腎病患者例,既往無其它腎臟病史,以例腎腫瘤患者遠離腫瘤的瘤旁組織做為對照組。留取血和尿標本檢測血糖、糖化血紅蛋白、小時尿蛋白定量切、肌酐、估算腎小球濾過率采用免疫組織化學檢測、及蛋白表達。信號通路在糖尿病小鼠腎組織中的作用雄性小鼠隨機分為組對照組、糖尿病組、糖尿病纈沙坦組。糖尿病模型小鼠腹腔單次注射鏈脲佐菌素,/,對照組只注射相同體積的枸櫞酸鹽緩沖液,小時后測定血糖和尿糖,中文摘要血糖值/,尿糖值卅卅者確定為糖尿病模型成功。糖尿病纈沙坦組小鼠在糖尿病模型建立后,以纈沙坦/灌胃,對照組和糖尿病組以等體積蒸餾水灌胃。分別于成模后、周每組取只小鼠,收集血液及小時尿液,用于生化指標檢測,方法檢測尿液的含量切取腎臟中性甲醛固定用于組織化學、及免疫組織化學染色取部分腎皮質組織置于戊二醛用于電鏡觀察部分腎皮質組織用于提取蛋白及,檢測、及蛋白表達,表達檢測、及另取部分腎皮質組織于酒精固定,用于流式細胞術檢測細胞凋亡率。高糖對小鼠足細胞信號通路的作用小鼠足細胞在,培養箱中,以含有胎牛血清及/的培養液培養細胞使其增殖,傳代后更干擾素培養箱換為不含干擾素的沖培養液,置入,中培養天,促進細胞分化成熟。將實驗細胞分成組正常糖對照/組/,、正常糖高滲對照組/,、高糖組,、/高糖陰性質粒組,、高糖/、高糖質粒組,/質粒組,、高糖組/,。分別經細胞同步化、/分組干預刺激、小時后收集細胞,免疫細胞化學檢測檢測、和蛋白表達、一、檢測、及及蛋白表達表達和/染色檢測足細胞凋亡率。結果糖尿病腎病患者臨床病理表現及信號通路檢測光鏡下觀察,對照組腎小球、腎小管及腎間質未見明顯異常糖尿病腎病組腎小球體積增大,基底膜彌漫或不規則增厚,細胞外基質增多,結節形成,部分腎小管上皮細胞出現空泡變性,間質纖維化。糖中文摘要尿病腎病組空腹血糖、糖化血紅蛋白、尿蛋白量、肌酐較對照組均明顯增多,而腎小球濾過率糖尿病腎病組患者比對照組下降。免疫組化顯示、及在腎小球及腎小管均有表達,糖尿病腎病組較對照組表達增多。糖尿病小鼠腎組織信號通路的表達及纈沙坦對信號通路和足細胞損傷的影響光鏡及電鏡下觀察,糖尿病組小鼠輕微腎小球體積增大,系膜基質增多,基底膜不規則增厚,足細胞數量減少,足突融合,部分腎小管上皮細胞出現空泡變性。與對照組相比,糖尿病組小鼠尿蛋白從周開始明顯升高,隨病程延長呈逐漸升高的趨勢糖尿病小鼠血糖、尿素氮、肌酐比對照組小鼠增加,隨病程延長呈逐漸升高的趨勢與對照組相比,糖尿病組小鼠尿蛋白和尿含量明顯升高,給予纈沙坦治療后尿蛋白和含量降低。免疫組化結果顯示、和在對照組腎小球及腎小管有少量表達,在糖尿病組表達明顯增加檢測顯示,與對照組比較,糖尿病組小鼠。腎組織中、及從周時開始升高,表達最高點在周,周時略有下降蛋白在糖尿病組比對照組表達增加,在糖尿病組各周次間表達無明顯差異糖尿病組水平與對照組相比表達增加,最、和高點在周,隨后下降。和顯示,糖尿病組小鼠腎小球組織、和蛋白及、水平與對照組相比增加,給予纈沙坦治療后、和降低。染色顯示在糖尿病組小鼠腎組織中觀察到凋亡細胞、及蛋白在糖尿病組小鼠腎小球組織中表達比對照組增加,給予纈沙坦治療后降低蛋白表達水平糖尿病組較對照組降低,給予纈沙坦后表達升高蛋白在各組間表達無明顯差異流式細胞術顯示糖尿病組小鼠腎小球內細胞凋亡增加,糖尿病纈沙坦組降低,但仍高于對照組。足細胞體外高糖培養對信號通路表達及足細胞損傷的影響免疫細胞化學顯示,、和在正常糖對照組足細胞中有少量表達,給予高糖刺激后表達量明顯增加中文摘要檢測顯示,和蛋白在高糖刺激足細胞小時升高,小時表達最高,小時略有下降蛋白在高糖刺激后其它時間點的表達量是高糖刺激小時表達量的倍,高糖刺激小時足細胞中蛋白水平表達無明顯差異蛋白在高糖刺激小時升高,小時達到項點,小時有所降低表達在高糖刺激和小時升高,然后隨著刺激時間延長表達下降高糖刺激呈時間依賴性引起、和升高,最高峰在小時最高點在高糖刺激小時,隨后隨著刺激時間延長而下降。和檢測發現,高糖刺激引起、表達、蛋白及、增加,和轉染足細胞后表達下降,可抑制足細在高糖刺激后的過表胞、蛋白及、達現象,但、蛋白及在高糖組和高糖組之間無明顯差異。檢測發現高糖呈時間依賴性刺激蛋白表達,小時開始增加,小時達到最高點,而蛋白在高糖刺激后表達逐漸下降,最低點在小時在高糖刺激小時開始增加,小時為最高點,之后逐漸減少蛋白在高糖刺激下表達逐漸增加,最高點在小時蛋白在高糖刺激各時間點之間表達無明顯差異。足細胞高糖培養并應用或、質粒轉染后發現、及蛋白較高糖組表達下降,但較正常糖對照組表達仍高,而蛋白較高糖組表達增強,但較正常糖對照組表達仍低,蛋自在各組間表達無明顯差異。熒光染色及/染色顯示高糖組較正常糖對照組細胞凋亡率升高,轉染組及高糖組細胞凋亡率比高糖組降低。結論在糖尿病腎病患者腎組織、糖尿病小鼠腎組織、高糖培養足細胞中發現信號通路成員有過表達現象,提示通路在糖尿病腎病足細胞中激活并可能參與足細胞損傷過程。纈沙坦抑制糖尿病小鼠腎組織中信號通路的活化,同時抑制蛋白尿和足細胞脫落,抑制凋亡相關蛋白表達,減少細胞凋亡,抑制腎小球內細胞外基質沉積。提示纈沙坦可通過抑制信號通路來產生對糖中文摘要尿病腎病的治療效果。在高糖培養的足細胞中,應用信號通路干擾質粒及抑制劑抑制信號通路的活化后,可抑制凋亡相關蛋白表達,減少足細胞凋亡。提示信號通路參與高糖誘導的足細胞損傷。關鍵詞糖尿病腎病信號通路足細胞損傷細胞外基質沉積凋亡英文摘要,一/,英文摘要一一,一,一,蜘英文摘要,。一,/十,/,一,。英文摘要,/,/,/,田,曲/,曲/,/,/,/,。,一,一,/,英文摘要,。,英文摘要,一,一,一,英文摘要,。,曲曲一,一曲,一,一,/,英文摘要,曲,了英文縮寫一英文縮寫中文譯名英文縮寫英文全稱血管緊張索脫嘌呤/脫嘧啶核苷內/切核酸酶型受體血管緊張素血管緊張素受體阻斷劑糖尿病腎病細胞外基質局灶性節段性腎小球硬化癥腎小球基底膜分泌酶抑制劑高糖正常糖胞內域嘌呤霉素氨基核苷足盂蛋白腎素一血管緊張素系統裂孔膜鏈脲佐菌素轉化生長因子血管內皮生長因子研究論文信號通路在糖尿病腎病足細胞損傷中的研究引言信號通路是一種在進化過程中相對保守的廣泛存在于細胞間的信號傳導通路,在細胞的增生和分化中起到了關鍵性的作用。信號通路最早是在對果蠅的研究中發現的,部分通路功能缺陷后,果蠅翅膀邊緣會出現刻痕,因而得名。通路可影響果蠅翅膀、剛毛、眼、神經系統的形成。在哺乳動物體為信號通路有四種受體和五種配體,其中受體為,配體分別為、樣配體、和。信號由受體與配體相互作用而激活。配體誘導受體發生構象改變,先在細胞外金屬蛋白酶的作用下發生水解,隨后又在分泌酶的介導下釋放出胞內域,。是信號的活化形式,其進入細胞核后激活通路下游基因和,影響細胞分化、增殖和凋亡。已有研究表明信號通路在腎臟發育、形成過程中起到了關鍵性作用。和出現在“”形小體中,也可出現在集合管。表達在“”形小體的遠側部分。、和主要被檢測在內皮細胞中表達。和在腎小囊的發生過程中出現在血管內皮細胞和“”形小體的近側部分。在腎臟發育過程中沒有表達。,抑制小鼠后腎形成過等使用丫分泌酶抑制劑丫程中的活化,發現上皮細胞形成明顯缺陷,近端小管細胞和腎小球在足細胞發育過程中中足細胞的形成明顯減少,伴隨非上皮細胞增多。出現異常通路的活化,可引起小鼠腎小球硬化,抑制足細胞的終末分化。這些研究提示信號通路在足細胞和近端小管的分化中起著重要的作用。最近信號通路在腎臟中的研究,已經從腎臟的發育轉到腎小球疾病中。信號通路可能在足細胞凋亡過程中起到了關鍵性作用。臨床與實驗研究發現足細胞損傷是腎小球疾病發展的重要因素,可引起嚴重的蛋白尿。最近根據足細胞損傷原因及數量進行腎小球疾病的組織病理學研究論文分類。信號通路的激活可能是足細胞病理損傷的一個常見機制,受影響足細胞的最終結局依賴于信號通路的水平。最近研究發現信號通路與局灶性節段性腎小球硬化癥,、嘌呤霉素氨基核苷腎病和綜合癥的足細胞損傷有關。信號通路在糖尿病腎病,中的研究少見。在糖尿病腎病中信號通路水平可能與足細胞的損傷程度有關。信號通路被激活后,可能通過其靶基因、和,進一步導致足細胞損傷和腎小球硬化。足細胞發生損傷時可引起足細胞相關蛋白,女、整合素、等,在足細胞內的重新分布和表達量減少,足細胞與基底膜之間粘附性減低,導致足細胞脫落。另外,在腎小球疾病中足細胞數量減少,還由于可發生足細胞的凋亡。足細胞損傷后可激活足細胞內凋亡相關蛋白如、心,誘導足細胞凋亡。足細胞數目減少會造成濾過膜對蛋白選擇通透性的喪失,發生蛋白尿,而尿蛋白的增加將誘導腎小球纖維化和腎小管萎縮,以上不可逆的間質改變和腎小球硬化最終將導致慢性腎功能衰竭。已有研究證實,腎素一血管緊張素系統,在的發生時在腎內激活,參與腎組織高灌注、高濾過的病變過程。我們通過檢測糖尿病腎病患者和糖尿病小鼠腎組織及高糖培養足細胞中信號通路的表達情況,在糖尿病小鼠給予血管緊張素受體阻斷劑,在體外培養足細胞中應用基因干擾技術及化學抑制劑抑錯通路的活化,進一步探討信號通路在糖尿病腎病中是否參與足細胞損傷,為糖尿病腎病的臨床治療提供新的靶點。研究論文第一部分信號通路在糖尿病腎病患者腎組織中的表達及意義上刖置糖尿病腎病,是一種常見的糖尿病并發癥,現在已成為晚期腎病的常見原因。不僅嚴重影響患者的生活質量,還常常危及患者生命,因此探討發病、發展機制,找到針對的有效治療是非常有意義的。糖尿病腎病的發病機制非常復雜,糖脂代謝紊亂、血流動力學改變、氧化應激、炎性因子等是其主要起始因素。這些起始因素不僅參與的發展過程,還激活多條信號傳導通路,各種信號通路相互作用,共同參與進程。近年來,信號通路在腎小球疾病中的作用得到了大家的重視,但其在中的作用機制還不清楚【。信號通路最早是在研究果蠅的發育過程中被發現的,基因的部分功能缺失可造成果蠅翅膀邊緣刻痕,因而得名【。信號通路是一種在進化過程中相對保守的廣泛存在于細胞間的信號傳導通路,在細胞的增生和分化中起到了關鍵性的作用【,。在哺乳動物體內信號通路有四種受體和五種配體,其中受體為,配體分別為、樣配體、和。信號通路配體與受體結合,誘導受體發生構象改變,在丫分泌酶丫的介導下釋放出胞內域。是信號的活化形式,其進入細胞核后激活下游基因和,調節細胞轉歸,誘導細胞分化。近年來發現,信號通路可能在腎小球疾病的發生、發展中起到了重要作用,并與其它信號通路有相互作用。已有研究發現信號通路與局灶性節段性腎小球硬化癥、嘌呤霉素氨基核苷,腎病和綜合癥的足細胞損傷、腎小球硬化有關【,。在這個部分中,我們收集臨床腎穿刺標本,通過檢測糖尿病腎病患者腎組織中信號通路的表達情況,為進一步研究信號通路與糖尿病腎病腎小球硬化之間的關系提供依據。研究論文材料與方法儀器石蠟切片機德國公司石蠟包埋機德國公司全自動顯微照相系統日本公司病理圖像分析系統北京航空航天大學透射電鏡日本日立公司低速離心機上海醫療器械集團公司低溫冰箱日本三洋公司電熱恒溫孵育箱重慶實驗設備廠型醫用微波爐上海中達醫學研究所試劑美國公司兔抗多克隆抗體兔抗多克隆抗體美國公司兔抗多克隆抗體美國公司兔抗多克隆抗體美國公司美國公司兔抗多克隆抗體多聚賴氨酸河北博海生物公司三步法免疫組化試劑北京中杉生物技術有限公司顯色試劑盒北京中杉公司進口分裝試劑配制,溶于蒸餾水中。臨床標本收集收集年月年月在河北醫科大學第三醫院腎內科住院,經病史、臨床檢查及腎穿刺活檢病理診斷為糖尿病腎病患者例,年齡歲,其中男例,女例。所有病人未應用糖皮質激素、細胞毒藥物,除外其它合并膜性腎病、局灶節段性腎小球硬化、腎病等原發性腎臟病及繼發性腎病如乙肝病毒相關性腎炎、狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、淀粉樣變性、骨髓瘤腎病等。研究論文以例腎臟腫瘤患者遠離腫瘤的瘤旁組織做為對照組。腎組織常規石蠟包埋,切片,進行組織化學及免疫組化檢測。收集隘床資料,包括性別、年齡、身高、體重、血壓、家族史、病程、服藥史、血糖、糖化血紅蛋白、小時尿蛋白定量、肌酐、估算腎小球濾過率等。以例無糖尿病病史,腎功能正常體檢者血尿標本進行檢測作為正常對照。染色切片脫蠟至水,過碘酸氧化分鐘,蒸餾水沖洗次,每次分鐘,還原液分鐘,氏液分鐘,自來水洗,蘇木素復染,脫水透明,中性樹膠封片。免疫組織化學檢測、及蛋白表達采用免疫組化法進行檢測。制備腎組織石蠟切片,切片經常規脫蠟至水,甲醇溶液室溫孵育分鐘封閉內源性過氧化物酶,蒸餾水沖洗次,每次分鐘,切片加入抗原修復液/檸檬酸,采用微波修復法進行抗原修復,連續修復兩檸檬酸鈉緩沖液,次,第一次修復功率為檔,修復分鐘,第二次修復功率為檔,修復分鐘,室溫下冷卻分鐘,磷酸鹽緩沖液沖洗次,每次分鐘,加入正常山羊血清,分鐘封閉內源性生物素,甩掉血清滴加兔抗、及多克隆抗體,孵育過夜,次日取出切片,沖洗次,每次分鐘,滴加生物素標記的山羊抗兔,孵育分鐘,沖洗次,每次分鐘,滴加辣根酶標記鏈霉卵白素,孵育分鐘,沖洗次,每次分鐘,二氨基聯苯胺顯色,光鏡下觀察并控制顯色程度,蒸餾水沖洗,蘇木素復染,陽性部位呈棕黃色,脫水透明,中性樹膠封片。以替代一抗作為陰性對照。運用圖像分析系統邶認,同濟醫科大學清屏影像公司對各組切片隨機選取個高倍視野,分析腎小球免疫組化陽性信號的積分光密度值,細胞核表達的計數腎小球陽性細胞核占所在腎小球總細胞核百分比。以各組陽性表達的均值作為最終結果。統計學處理應用軟件分析系統進行統計學處理。計量資料用均數標研究論文準差妊峪表示,各組間數據比較采用方差分析,差異有統計學二也巴、,思義。結果腎臟形態學改變光鏡下觀察,對照組腎小球、腎小管及腎間質未見明顯異常糖尿病腎病組腎小球體積增大,基底膜彌漫或不規則增厚,細胞外基質增多,嚴重者結節形成,腎小球硬化部分腎小管上皮細胞出現空泡變性,間質纖維化,小動脈管壁略增厚。生化指標檢測糖尿病腎病組患者空腹血糖、糖化血紅蛋白、尿蛋白量、肌酐較對照組均明顯增多,而腎小球濾過率糖尿病腎病組患者比對照組下降尸,。,腎組織中通路的表達免疫組化顯示對照組和在腎小球和腎小管胞漿中有少量表達,糖尿病腎病組與對照組比較表達明顯增強氏,、及在腎小球和腎小管細胞核中表達,糖尿病腎病組比對照組表達增加,。研究論文附圖互寸甕吾尸研究論文圈互譬芝勺蠹口三二血堍圈暑雹屯磊器翟。荽鱗謄一。,弋,墓每,、。五,二一,“。、王工。,”、。、黟黲,。、,“,、一、,。二凄餮菇一一二尊。露薯孓、一,一一,、。、,一冀繁鹺。肇,觚岫玎蛐,撇姻獸磐莒研究論文附表,妊嗡,”研究論文討論信號通路是調節細胞增殖和分化的重要通路,最近在腎小球疾病中的研究越來越得到大家的重視【,。有研究通過在轉基因小鼠體內表達,結果發現其可通過激活途徑,引起足細胞凋亡伴系膜增生,裂孔膜變大,出現蛋白尿,節段性腎小球硬化和腎間質纖維化【。,在非轉基因小鼠模型中應用丫分泌酶抑制劑丫抑通路活化,可保護足細胞損傷,減少足細胞足突消失,阻止蛋白尿產生】。我們通過免疫組化檢測發現在對照組腎小球中通路成員僅見少量表達,而在糖尿病腎病患者腎小球通路配體和受體表達增加,配體和受體的結合可誘導受體發牛構象改變,存分泌酶的介導下向細胞內釋放出。通過觀察發現及其下游基因、在糖尿病腎病患者腎小球中表達較對照組明顯增強。這些說明在發生、發展過程中,腎組織中會出現通路的激活。等也發現在糖尿病腎病患者和糖尿病模型中存在、和表達增加,并與血糖及足細胞損傷程度呈正相關,使用或敲除轉錄因子后可阻止足細胞凋亡,延緩腎小球硬化。足細胞是終末分化的腎小球上皮細胞,它附著在腎小球基底膜外側,是腎小球濾過膜的重要組成部分,由于足細胞是高度分化細胞,增殖能力較差【引。在糖尿病腎病中,血糖、血流動力學改變、脂質代謝紊亂、氧化應激、炎癥因子等引起腎小球足細胞的損傷。我們發現在糖尿病腎病患者腎組織信號通路被激活的同時,還發現糖尿病腎病患者血糖增加,尿蛋白增加,腎臟功能下降,增厚,腎小球硬化。這些提示糖尿病。腎病患者腎組織通路的活化可能與腎小球足細胞損傷有關。受損的足細胞表現為細胞內固有結構蛋白減少,粘附性下降,可發生脫落或凋亡,造成腎小球內足細胞數量和密度減少,暴露,破壞濾過膜,產生蛋白尿【。同時,受損的足細胞引起細胞外基質,增加,進而導致腎小球硬化,造成腎臟損傷引。因此,足細胞的損傷是最終引起腎小球硬化的關鍵性因素。研究論文通過檢澳信號通路,觀察其與發展過程中腎臟損傷之間的關系及機制,將為的防治提供了一條新的途徑。小結糖尿病腎病患者腎組織中出現信號通路激活。糖尿病腎病患者出現腎功能損害及腎小球硬化。參考文獻,一虹,一,/,/,。,研究論文,一,/,。,研究論文第二部分信號通路在糖尿病小鼠腎組織中的表達及意義一刖昌足細胞是高度分化的腎小球臟層上皮細胞,通過帕整合素和砣。蛋白聚糖復合體連接于腎小球基底膜上,足細胞足突之間形成許多裂孔,裂孔上覆蓋有裂孔膜,是維持。腎小球濾過膜的最后屏障,阻止血漿蛋白濾過,。在糖尿病腎病,中,血糖、血流動力學改變、脂質代謝紊亂、氧化應激、炎癥因子等引起腎小球足細胞的損傷,這一病損可早于系膜細胞和小管細胞數年,與臨床早期持續蛋白尿相關,可導致腎小球硬化【,。首先,糖尿病腎病足細胞中的足細胞相關蛋白發生結構改變、分布異常和表達量的減少。通過對糖尿病腎病患者研究表明,蛋白可以發生從足細胞膜到細胞質的重新分布和表達量減少,導致濾過膜對蛋白選擇通透性的喪失,發生蛋白尿【】。足盂蛋白,是足細胞足突頂膜區主要的帶負電荷跨膜蛋白,也是組成腎小球基底膜電荷屏障的主要物質,當足細胞損傷后表達減少,一方面破壞了足突間的排斥作用使之發生粘附、融合,導致足細胞易于脫落,另一方面裂隙膜完整性受到破壞,腎小球濾過電荷屏障減弱,促進蛋白尿的發生,加速進展。另外,在糖尿病腎病發生時可激活足細胞內凋亡相關蛋白如、發生凋亡。等【】在糖尿病模型及高糖培養的足細胞中發現/值和顯著升高,足細胞凋亡增加。足細胞凋亡后造成足細胞數目減少會進一步加重蛋白尿,而蛋白尿的加重將引起細胞外基質,增加,誘導腎小球間質纖維化和腎小管萎縮,以上不可逆的問質改變和腎小球硬化最終將導致慢性腎功能衰竭【。因此糖尿病腎病足細胞的損傷是最終引起腎小球硬化的關鍵因素。已有研究證實,腎素血管緊張素系統,在的發生時在腎內激活,參與腎組織高灌注、高濾過的病變過程【。研究論文作為系統的主要效應因子,在,血管緊張素腎組織內常明顯升高,通過血流動力學及非血流動力學因素,在進可以通過多種途徑造成足展過程中發揮重要作用。在的早期通過與其受體結合從而發揮生物學細胞損傷,導致蛋白尿發生【引。生物學效應主要是由血管受體有四型,其效應,至今發現緊張素型受體帥,介導。纈沙坦是血管緊張素受體阻斷劑,具有腎臟保護作用,是目前治療的常規藥物】引。大量研究表明,纈沙坦具有降低血壓,減少蛋白尿,改善腎小球損傷及纖維化的作用。在前一部分,我們發現信號通路在糖尿病腎病患者腎小球組織中激活。在這一部分中,我們建立糖尿病小鼠模型,通過檢測糖尿病小鼠腎組織中信號通路的表達情況,來研究信號通路與糖尿病腎病足細胞損傷之間的關系,并觀察纈沙坦對糖尿病小鼠信號通路以及足細胞損傷的影響。材料與方法儀器血糖分析儀美國強生公司電熱恒溫箱重慶實驗設備廠型醫用微波爐上海中達醫學研究所石蠟切片機德國公司石蠟包埋機德國公司臺式高速冷凍離心機北京四環科學儀器廠紫外可見分光光度計上海光譜儀器有限公司旋渦混合器上海精科實業有限公司超低溫冰箱青島自動三重純水蒸餾器上海亞榮生化儀器廠低速大容量多管離心機上海安亭科學儀器廠恒溫磁力攪拌器上海司樂儀器廠壓力蒸汽火菌器博迅實業有限公司醫療設備廠研究論文垂直電泳槽北京市六一儀器廠轉移電泳儀北京市六一儀器廠轉移電泳槽北京市六一儀器廠水浴振蕩器哈爾濱科學儀器廠凝膠成像分析儀美國公司電熱恒溫干燥箱天津市華北實驗儀器有限公司德國公司梯度基因擴增儀實時定量儀安捷倫科技有限公司水平電泳槽北京市六一儀器廠電子恒溫水浴鍋天津市泰斯特儀器有限公司電子天平北京賽多利斯天平有限公司型離心機上海安亭科學儀器廠透射電鏡日本日立公司電子天平重慶衡器廠光學顯微鏡日本型流式細胞儀美國公司試劑鏈脲佐菌素美國公司多聚賴氨酸河北博海生物公司美國公司兔抗多克隆抗體兔抗多克隆抗體美國公司兔抗多克隆抗體美國公司美國公司兔抗多克隆抗體美國公司兔抗多克隆抗體兔抗多克隆抗體美國公司美國公司兔抗多克隆抗體美國公司兔抗多克隆抗體鼠抗美國一單克隆抗公司體兔抗多克隆抗體美國公司北京博奧森公司兔抗多克隆抗體研究論文小鼠檢測試劑盒上海藍基生物科技有限公司組織提取試劑盒美國公司熒光檢測試劑盒美國公司增強化學發光試劑盒美國公司北京中杉公司進口分裝辣根酶標記羊抗兔北京中杉公司進口分裝辣根酶標記羊抗小鼠預染蛋白分子量美國公司蛋白酶抑制劑美國公司膜美國公司顯色試劑盒北京中杉生物技術有限公司三步法免疫組化試劑北京中杉生物技術有限公司三羥甲基氨基甲烷天津市華東試劑廠脫氧膽酸鈉美國公司二硫蘇糖醇美國公司苯甲磺酰氟德圍公司考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒南京建成生物工程研究所十二烷基磺酸鈉美國公司溴酚藍美國公司石家莊拜昂生物公司甘氨酸美國公司美國公司丙烯酰胺美國公司亞甲雙丙烯酰胺美國公司過硫酸銨美國公司匝美國公司美國公司美國公司脫氧核糖核苷三磷酸心汀賽百盛公司美國公司美國公司瓊脂糖葡萄牙進口分裝研究論文溴化乙錠美國公司纈沙坦北京諾華制藥有限公司試劑配制/,蒸餾水中。,溶于,用濃調節,加蒸餾水值至,加水補足至。含的,即為。檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液/,液/檸檬酸蒸餾水檸檬酸溶于液/檸檬酸鈉蒸餾水檸檬酸鈉溶于取皿液,液,混合成終濃度為的緩/,沖液。配制溶于蚰檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液中,濃度為酬,現用現配,避光。/,取液和/檸檬酸抗原修復液。液,混合后加蒸餾水定容至電泳緩沖液甘氨酸,。蒸餾水溶解后,定容至蒸餾電轉移緩沖液甘氨酸,預冷備用。水溶解,甲醇,蒸餾水定容至貯存液丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺,先用,避“蒸餾水溶解,待完全溶解至溶液透明,加水定容至光保存。/溶于蒸餾水中,用,保存。/的調值為,加水定容至/堿溶于蒸餾水中,保存。用/的調值為,加水定容至電鏡固定液液雙蒸水液唧研究論文雙蒸水組織固定液液與液混合戊二醛。后,加入戊二醛加樣緩沖液/甘油溴酚藍糖尿病動物模型建立及分組只雄性小鼠,周購自北京維通利華公司。動物隨機分為組對照組和糖尿病組。糖尿病組小鼠腹腔單次注射/,對照組只注射相當體積的枸櫞酸鹽緩沖液,小時后尾尖取血,血糖儀測定血糖,尿糖試紙測/,尿糖者確定為糖尿病模型。分別定尿糖,血糖于注射后周、周、周及周每組取只小鼠,分別用代謝籠收集小時尿,用于尿液和檢測股動脈取血分離血清切取腎臟,取部分腎組織置于中性甲醛及戊二醛固定,用于光鏡、電鏡觀察及免疫組化檢測部分腎皮質組織經液氮速凍后保存于冰箱,用于和檢測部分腎皮質用乙醇固定后用于流式細胞術檢測。血尿生化指標檢測全自動生化分析每個樣本取血清和山尿液,采用日立儀測定血糖、尿素氮及肌酐。每個樣本取山尿液用西門子全自動免疫發光分析儀檢測尿蛋白濃度,計算尿蛋白量。檢測尿中的含量先后加入稀釋后的標準品、待測樣品于反應孔內,立即加入山的牛物素標記的一抗,輕輕振蕩混勻,孵育分鐘。甩去孔內液體,震蕩洗滌次,每次秒。每孔加入山的辣根酶標記的二抗,輕輕振蕩混勻,孵育分鐘。甩去孔內液體,震蕩洗滌次,研究論文輕輕振蕩混勻,孵育每次秒。每孔加入底物、各山,分鐘,避免光照。取出酶標板,迅速加入終止液,立即測定結果