血小板抗原抗體檢測及臨床應用,長春博德生物技術有限責任公司郭超,目 錄 / contents,血小板抗原,血小板抗體與疾病,血小板抗體檢測的意義和臨床應用,血小板簡介,血小板：D:2-5um V:紅細胞*1/5功能：促進止血和加速凝血正常范圍：100-300109/L,骨髓干細胞,胞質塊脫落,來源：,多功能祖細胞,巨核祖細胞,幼巨核細胞,巨核細胞,血小板,血小板形態,靜息狀態,活化狀態,血小板抗原,血小板“非特異性”抗原,血小板“特異性”抗原 HPA抗原,HLA-類抗原 ABH抗原,主要存在于血小板膜的GP分子上，也少量存在于血管內皮細胞、結締組織細胞和平滑肌細胞。1990年國際輸血協會血小板免疫學工作組提出了HPA命名，以發現的時間順序排列：HPA-1、HPA-2、HPA-3等系統。,HPA抗原,已確定了33個HPA，其中12 個抗原為雙等位基因表達（HPA-1,-2,-3,-4，-5和-15）。其中高頻率抗原命名a，低頻率抗原命名b。其余21個抗原為低頻率抗原，尚未發現對偶抗原，命名為bw。單核苷酸多態性（SNP）:33個HPA中均已搞清楚基因背景，其中32個HPA的多態性型是由一個氨基酸置換所致，而這又是由編碼血小板膜糖蛋白（GP）基因的一個核苷酸的不同所致。HPA-14bw不具有單核苷酸多態性。其核苷酸置換發生在 AAG1929-31。,HPA抗原,HPA抗原,HPA抗原,血小板抗原定型,血清學定型即用已知特異性抗體檢測血小板血型抗原缺點：特異性抗體來源困難 -人血清中血小板抗體通常為多特異性 -單克隆抗體匱乏，目前國際上僅有HPA-1a單抗， 無其它HPA單抗。基因定型限制性片段長度多態性分析（RFLP）序列特異性寡核苷酸聚合酶鏈反應(PCR-SSO)序列特異性引物聚合酶鏈反應(PCR-SSP),用途：（1）健康人群HPA基因分型，建立已知HPA基因型的血小板獻血員庫。（2）檢測受者HPA基因型，以便從血小板獻血員庫中尋找與其HPA基因型相 匹配的血小板供者。（3）檢測患者HPA基因型，輔助臨床胎兒/新生兒免疫性血小板減少癥、輸 血后紫癜及血小板輸注無效癥等疾病的病因診斷。（4）對特定區域或種族人群HPA基因分型，可為人類遺傳學研究提供相關 資料和證據。,血小板抗原定型,血小板抗體的產生方式,以上途徑產生的血小板同種抗體與血小板上的相應抗原結合，導致血小板被內皮網狀系統清除。,移植（骨髓、器官）,輸血小板、紅細胞（尤其是沒有濾白的紅細胞）,血小板抗體與部分相關疾病,胎盤屏障,母體同種異體免疫,胎兒血小板減少,舉例NAIT,NAIT,胎母同種異體免疫血小板減少癥（fetomaternal alloimmune thrombocytopenia，FMAIT）致病機理與新生兒溶血病（HDN）相似，前者是由胎兒父母血小板抗原不合引起的血小板減少癥，后者為紅細胞抗原不合引起的溶血性疾病。由于胎兒遺傳自父親的血小板抗原刺激母體產生IgG型的抗血小板抗體，該抗體能通過胎盤進入胎兒體內并與具有相應抗原的血小板結合，此致敏血小板在胎兒的血液循環中被清除而使得胎兒血小板減少，出現瘀點和瘀斑，其嚴重者會導致神經系統損傷（占已報道病例的20%）、10%出現顱內出血(死亡率近100%）。因多數病例在出生后才得以診斷，故此病也稱作新生兒同種異體免疫血小板減少癥。初次妊娠婦女即可發生FMAIT，其發病率大約為1/800-1500 。,FMAIT患兒病情變化較大，具有自限性，常在出生后 2-3周恢復。輕度血小板減少患兒有時沒有任何臨床癥狀。病情較重患兒 臨床表現為皮膚、體內外黏膜出血，出現紫癜、瘀點或瘀斑。嚴重患兒可能發生顱內出血（intracranial haemorrhage， ICH），占10%。與FMAIT相關的ICH 80%發生在子宮內，其中14%發生在妊娠20 周前，28%發生在妊娠30周前。,NAIT臨床表現,母體血清抗HPA抗體檢測，然而母體抗體水平到預產期時逐漸下降，約有30%的病例抗體陰性。父母雙親的HPA基因檢測，在高加索地區采取對其HPA-1和HPA-5基因檢測，而在亞洲地區應考慮進行HPA-4和HPA-5基因檢測。父母雙親交叉配型實驗，將母體血清與父親血小板進行交叉配型實驗，即使不能確切知道不相合的抗原，但這種方法也能發現母體是否存在血小板同種異體免疫反應。,NAIT早期診斷與篩查,NAIT,NAIT,血小板抗體檢測常用方法,方法,指標,血小板抗體檢測方法-固相凝集法,血小板抗體篩檢，包括HLA抗體、HPA抗體及其它血小板反應性抗體。輔助血小板相關免疫性疾病的診斷。患者自身抗體檢測，包括血小板結合抗體和血清中游離抗體。檢測血小板結合抗體可將患者血小板平鋪在反應孔后，直接加入抗人IgG和指示紅細胞進行檢測。血清中的游離抗體可通過患者自身血小板和血清反應來檢測。,用途：,血小板抗體檢測方法-固相凝集法,1.主要應用科室：檢驗科，血液病科，婦產科，新生兒科。 2.檢驗科： 檢驗科在常規血型鑒定中加入血小板抗體檢測，可對臨床輸血中出現發熱、黃疸、急性肺損傷等非溶血性輸血反應的風險作出評估。,血小板抗體檢測臨床意義,3.婦產科:孕前，孕期，產后1).反復流產、不孕不育查因：對于反復和習慣性流產史（尤其是孕早期）和不孕不育史的患者，檢測患者血清和血漿中血小板抗體的水平，可對其造成流產和不孕不育的原因作出輔助診斷。2).產檢（尤其針對高齡和二胎產婦）孕早期檢測：在孕早期（三個月）產檢中常規檢測母親與胎兒的血小板相容性，對于孕早期出現流產和死胎的風險評價具有非常重要的意義孕晚期檢測：在孕晚期（胎兒出生前）檢測母體血清或血漿中血小板抗體水平，對胎兒出生后罹患新生兒血小板同種免疫性疾病風險評價具有非常重要的意義。3).妊娠期血小板降低的查因：孕婦在妊娠期血小板減少是一種常見現象，如是生理性降低則危害不大，往往生產后會恢復正常。但如果血小板的降低是由于孕婦自身免疫性疾病引起的則會引起流產、死胎、以及新生兒相關的血小板減少性疾病，危害嚴重。,血小板抗體檢測臨床意義,4.血液病科：1）自身免疫性疾病的輔助診斷：檢測患者血清和血漿中自身血小板抗體的水平和特異性，可輔助診斷自身免疫性疾病如白血病、再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合癥、血小板減少癥、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、特發性血小板減少性紫癜等。 2）藥物性抗體的檢測：某些藥物的存在如肝素、奎寧、奎尼丁、環磷酞胺、甲氨蝶呤、阿司匹林、水楊酸鈉等，選擇性的抑制了骨髓巨核細胞造血功能，使血小板的生成減少，同時應用某種藥物后，產生藥物相關抗體，藥物抗體復合物附著血小板膜上與補體結合，使血小板聚集破壞，一些藥物進入人體后也可直接破壞血小板，造成血小板破壞增多，從而引發血小板減少。5.新生兒科：新生兒血小板同種免疫性疾病的輔助診斷。,血小板抗體檢測臨床意義,婦產科領域 檢驗科常規血型鑒定檢測（門診血型）自身免疫性疾病的輔助診斷藥物性抗體檢測,血小板抗體檢測臨床應用,曾有反復流產史的育齡婦女，可在懷孕前進行夫妻雙方的血小板相關抗體檢測，對由于母嬰血小板血型不合而導致的流產或 NAIT進行早期的診斷和治療。,青年女性流產率逐年上升,每一次懷孕、流產都可能造成母體因外來抗原刺激而產生抗體，危及下一次妊娠。,如何在孕前/孕期正確地評估因父母血小板血型不合引起的流產、NAIT的風險？,血小板抗體檢測在婦產科領域的應用,血小板抗體檢測在婦產科領域的應用,父母血小板血型不合引起新生兒同種免疫性血小板減少癥的初步研究 鄧晶、夏文杰、葉欣、徐秀章、邵媛、陳揚凱、丁浩強、羅廣平、王嘉勵（廣州血液中心臨床輸血研究所）熱帶醫學雜志 2012年11月第12卷第11期文中觀點： 通過收集22例臨床上確診為新生兒免疫性血小板減少癥（NIT）的患兒為研究對象，采用 ELISA 方法檢測患兒及其父母的血小板相關抗體，應用 PCR-SSP法對患兒及父母進行 HLA及HPA基因分型，根據相應的抗原進行抗體特異性分析。結果22例NIT患兒中，14 例是由于同種免疫性因素引起的，其中 27.3（6例)由 HLA抗體引起,13.6（3例）由HPA抗體引起，22.7（5例）由HLAHPA 抗體引起 ；9.1（2例）由于被動免疫性因素引起;27.3（6例 ）由自身抗體引起 。其中,同種免疫性抗體以抗 HLA-A2、19，抗-B40 及抗 HPA-3a多見。結論： 在新生兒免疫性血小板減少癥中，主要以父母血小板血型不合引起新生兒同種免疫性血小板減少癥為主，臨床產前診斷預防和產后治療具有重要意義。,血小板抗體檢測在婦產科領域的應用,血小板抗體檢測在婦產科領域的應用,檢測方案（僅供參考）,目前臨床對不良孕產史查因、不孕不育查因、反復和習慣性流產查因多采用綜合檢測方案排因如遺傳因素、感染因素、免疫性因素等。血小板抗體檢測可歸類在免疫性因素套餐中。如深圳某三甲醫院的免疫類檢測套餐項目包括抗甲狀腺微粒抗體（TMab）抗甲狀腺球蛋白抗體（TGab）抗核抗體滴度檢測狼瘡抗凝物質檢測血漿D-二聚體檢測（D-Dimer）抗2糖蛋白I型抗體抗精子抗體抗磷脂抗體血小板特異性和組織相關融性抗體檢測（HPA+HLA I類）,檢測時段方案（僅供參考）,結果解釋,治療方案（僅供參考）,由血小板抗體陽性引起的相關性疾病可結合患者的個人情況建議采取茵陳湯調理并可適時服用阿司匹林（孕晚期禁用），丙球配合激素的治療方案（1）血小板抗體弱陽：可服用茵陳湯或阿司匹林調理。 （2）血小板抗體陽性：起始劑量為潑尼松10-20 mg/d，起效后逐漸減至維持量5-10mg。 （3）首次診斷者出現明顯血小板減少及出血傾向：起始劑量為潑尼松 0.5-1 mg/（kgd），血小板計數維持（20-3010 9 /L以上且出血傾向改善后 2 周可逐漸減量。 （4）血小板抗體強陽性：期待快速起效時，可考慮大劑量的丙球0.4 g/（kg.d）持續3-5d，或甲基潑尼松龍1g/d持續3d。 （5）糖皮質激素和丙球可同時使用。,血小板抗體檢測應用：非溶血性輸血反應的風險評估,白細胞特異性和組織相容性（HLA）抗體是引起臨床非溶血性發熱性輸血不良反應的最主要原因，尤其是有輸血史、輸血小板史、妊娠史、器官移植史、自身免疫性疾病史等的患者的臨床輸血工作中，非溶血性發熱反應是臨床最常見的輸血不良反應（約70%），文獻報道輸注紅細胞為26%，輸注血小板為2030%，多次輸血患者高達 2763，而非溶血性發熱性輸血反應與白細胞特異性和組織相容性（HLA）抗體密切相關，是影響臨床安全輸血的嚴重因素。白細胞特異性和組織相容性（HLA）抗體的檢測對于預防和減少非溶血性發熱性輸血反應非常有意義。,血小板抗體檢測應用：非溶血性輸血反應的風險評估,吳宇辰，徐笑紅，葉宏宇. 血小板抗體對非溶血性輸血反應的影響. 中國輸血雜志，2015年第28卷第8期.,輸血反應與血小板抗體的關系,血小板抗體檢測應用：非溶血性輸血反應的風險評估,分兩個步驟：1、高危高發人群必檢2、可進入相關檢測套餐,血小板抗體檢測應用：非溶血性輸血反應的風險評估,檢測建議：常規普檢已成為趨勢浙江、貴州為代表的全國近50家醫院,血小板抗體檢測應用：非溶血性輸血反應的風險評估,檢測套餐參考：,血小板抗體檢測應用：非溶血性輸血反應的風險評估,檢測套餐參考：1、常規血型鑒定套餐2、術前配血套餐3、與紅細胞血型抗體篩查檢測捆綁,1、能不輸血就不輸血2、輸濾白、輻照血3、輸自體血4、血漿置換5、臨床干預（免疫抑制、丙球、激素、中醫中藥調理）并告知輸血風險,血小板抗體檢測應用：非溶血性輸血反應的風險評估,臨床處理方案參考：,進行血小板抗體檢測，可以輔助診斷血小板免疫性疾病，如ITP。,自身免疫性疾病的輔助診斷,一般認為，ITP的發病機制包括血小板自身抗體導致的血小板破壞和清除。,檢測患者血小板自身結合抗體，了解血小板是否在體內致敏，是血小板自身抗體導致ITP發生的直接證據,檢測患者血小板自身游離抗體，了解血漿中的自身抗體是否能在體外與患者自身血小板結合，是血小板自身抗體導致ITP發生的間接證據,自身免疫性疾病的輔助診斷,血液病患者血小板抗體檢測及其與血小板輸注療效的相關性研究夏世勤 蘇莉 劉秋洪 楊眉 安邦權 王茂玲 于慧芳1貴州省人民醫院輸血科 ，2遵義醫學院檢驗系，結論 血小板抗體的產生與血小板輸注療效密切相關，血小板抗體是直接影響血小板輸注效果 的重要免疫因素之一 ；血液病患者的病因與血小板抗體的產生有一定相關性 ； 血小板抗體的產生與患者性別無關 ； 血小板輸注次數與血小板抗體產生密切相關： 血小板抗體的產生與輸注的血小板種類有關，單采組明顯低于濃縮組。 醫學檢驗 2013年8月第2O卷第22期,流式細胞技術檢測血小板相關抗體在ITP診斷中的應用研究吳國才，王珍(廣東醫學院附屬醫院 血液內科 ，廣東 湛江 524001)摘要 ：目的 探討流式細胞技術檢測血小板相關抗體在ITP診斷中的意義 。方法 選擇2012年5月至2013年6月在我院血液科住院的3O例ITP患者為觀察組,同期本院健康體檢正常者3O例為對照組，采用流式細胞技術檢測兩組對象的外周血血小板相關抗體PAIg(PAIgG 、PAIgM 、PAIgA )水平 。結果FCM檢測觀察組患者血小板抗體 ，PAIgG陽性率為7O,平均熒光強度為(25.154-2.61)，對照組平均熒光強度為 (5.09士0.54),兩組比較有顯著性差異(P 0.05)。結論 流式細胞儀檢測血小板相關抗體 在ITP診斷中具有重要的臨床意義 中國實驗診斷學 2O14年6月第18卷第 6 期,自身免疫性疾病的輔助診斷,許多藥物會導致血小板減少，常見的有肝素、奎寧、奎尼丁等，均會誘導產生藥物依賴性血小板抗體，從而產生血小板減少癥。 藥物性抗體產生的機制尚不完全明了。目前認識的產生機制主要有： 免疫復合物機制：藥物與抗體結合形成免疫復合物，與血 小板上的Fc受體結合，介導血小板的破壞。 半抗原機制：藥物小分子與血小板膜蛋白結合，形成新的 抗原，刺激免疫系統產生抗體，從而破壞血小板。,藥物性抗體檢測,可能產生藥物性抗體的用藥：抗生素類：頭孢他啶、頭孢曲松、磺胺類、萬古霉素鎮痛劑：芬太尼、布洛芬、對乙酰氨基酚消化系統用藥：雷尼替丁、心血管系統用藥：ACEI、阻滯劑抗腫瘤藥：奧沙利鉑,2. MF Leach. Detection of drug-dependent platelet antibodies by use of solid-phase red cell adherence assay. British Journal of haematology,1997,97,755-761.,1. Alan D. Michelson Platelets, Third Edition，Chapter 42,藥物性抗體檢測,懷疑患者因應用藥物而導致血小板減少癥時，應準備相應的藥物。如果為液體劑型，可以直接使用。如果為固體劑型，需要將其破碎、溶解于蒸餾水中。 對于免疫復合物機制，可以將藥物直接加入待檢標本中；對于半抗原機制，可將其加入0.5%緩沖液中。 檢測時加入藥物的濃度，應參照相應藥物的藥代動力學數據，選用下列三個濃度： 1.略低于谷濃度 2.峰濃度 3.峰濃度的5-10倍。,藥物性抗體檢測,對照標本與血小板,無藥物性血小板減少癥的健康人標本，作為本實驗的對照標本。,4-6人份混合，O型血小板。該血小板與待檢血小板做配型實