液相色譜基礎知識,關于色譜,色譜是一種分離工具，而不是傳統意義上的分析儀器常見的分離方式：蒸餾、離心、電泳、過濾、超濾等等,色譜是其中一種分離工具,色譜法簡介,色譜法（Chromatography）溯源俄國科學加1903年發現色譜的吸附原理，開創了應用吸附原理分離植物色素的新方法并見諸于俄文的文獻1906年正式命名（見諸文獻）色譜法；Chromatography50年代開始廣泛研究和應用主要是氣相色譜及薄層色譜高效液相色譜法的廣泛應用始于70年代,色譜的發明人,俄國科學家：M.S.Tswett正式命名“色譜”的文獻,一、色譜起源,經典液相色譜,色譜分離的機理,分離是一個物理的過程,流動相（MobilePhase）固定相（StationaryPhase）樣品（溶解于流動相中的溶質）,什么是液相色譜,氣相色譜：流動相是氣相液相色譜：流動相是液相,什么是高效液相色譜,HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜法，簡稱：HPLC是一種區別于經典液相色譜；基于儀器方法的高效能分離手段：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測器廣泛應用于各個領域：醫藥/環保/石化/生命科學/食品及農業在技術，理論及應用上仍處于發展階段,液相色譜的基本流程圖,流動相,泵,色譜柱,檢測器,泵輸液,分離,檢測,記錄,進樣閥,進樣,HPLC的儀器配置,色譜泵,自動進樣器,色譜柱及柱溫箱,檢測器,數據處理系統,溶劑,HPLC的應用,在食品研究中的分析應用食品中的天然成分碳水化合物類脂化合物、甘油三酸酯、膽固醇脂肪酸和有機酸蛋白、肽、氨基酸食品添加劑酸味劑、甜味劑、香精、乳化劑抗氧化劑、防腐劑顏料和染料（色素維生素污染物霉菌（黃曲霉毒素農藥和獸藥殘留多環芳烴（PAHS和亞硝酸,HPLC的應用,在獸藥研究中分析應用在醫藥研究中分析應用藥物分析有USP、BP、CP等標準常用藥物研究中的應用：解熱鎮痛藥、鎮靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類消炎藥等。甾體藥物研究中的應用：腎上腺皮質激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。抗菌素類藥物研究中的應用：青霉素、頭孢菌素、慶大毒素、四環素、氯霉素、諾氟沙星等。中草藥研究中的應用：生物堿、甙類(皂甙、強心甙、黃酮甙等)、萜類手性藥物研究中的應用：光學異構體的拆分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構體毒性很強)醫療藥物的檢測、新藥研究、藥物代謝、藥代動力學研究。,HPLC的應用,在生物化學和生物工程中的應用氨基酸、多肽和蛋白質的分析研究核堿、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（兒茶酚胺類)在精細化工分析中的應用醇、醛和酮、醚的分離分析酸和酯的分離分析表面活性劑的分析聚合物的分析研究藥物、農藥、染料、炸藥等工業產品在無機離子分析中應用飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽離子分析,HPLC的應用,在公安、刑警破案工作需要毒品分析等在環境污染分析中的應用廢氣、廢水、廢渣中多環芳烴、多氯聯苯、農藥殘留、酚類和胺類的檢測*2004年獲悉，世界上化合物總數達到4700萬，其中絕大部分是有機化合物，而大約有70以上是不揮發的。對HPLC來說，只要被分析物質在流動相溶劑（各種各樣中有一定的溶解度便可分析。所以，HPLC在各行各業有著廣泛的應用潛力。,高效液相色譜基本概念,色譜圖：HPLC圖形結果（Chromatogram）,色譜圖即色譜柱流出物通過檢測器時所產生的響應信號對時間的曲線圖，其縱坐標為信號強度，橫坐標為保留時間。,色譜峰,保留時間（分）,基線,峰高,峰寬,響應值,液相色譜圖相關術語,色譜峰Peak色譜柱流出組分通過檢測器時產生的響應信號的微分曲線峰底PeakBase峰的起點與終點之間連接的直線峰高PeakHeight峰最大值到峰底的距離峰寬PeakWidth在峰兩側拐點處所作切線與峰底相交兩點之間的距離半（高）峰寬PeakWidthatHalfHeight通過峰高的中點作平行于峰底的直線，其與峰兩側相交兩點之間的距離,液相色譜圖相關術語,峰面積PeakArea峰與峰底之間的面積,又稱響應值標準偏差；StandardError0.607倍峰高處所對應峰寬的一半拖尾峰TailingPeak后沿較前沿平緩的不對稱峰前伸峰LeadingPeak前沿較后沿平緩的不對稱峰鬼峰GhostPeak并非由試樣所產生的峰；亦稱假峰,液相色譜圖相關術語,基線Baseline在正常操作條件下，僅由流動相所產生的響應信號的曲線基線飄移BaselineDrift基線隨時間定向的緩慢變化基線噪聲；NBaselineNoise由各種因素所引起的基線波動譜帶擴展BandBroadening由于縱向擴散,傳質阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內移動過程中譜帶寬度增加的現象,液相色譜圖相關術語,死時間，t0Deadtime不被固定相滯留的組分，從進樣到出現峰最大值所需的時間保留時間，tRRetentiontime組分從進樣到出現峰最大值所需的時間死體積，V0Deadvolume不被固定相滯留的組分，從進樣到出現峰最大值所需的流動相體積保留體積，VRRetentionvolume組分從進樣到出現峰最大值所需的流動相體積,液相色譜應用：制備型液相色譜,分離及純化樣品是液相色譜原理的直接利用對分離及純化的要求化合物的穩定性樣品的復雜性制備量的要求純度的要求，及純度的鑒定方法的安全性,液相色譜應用：分析型液相色譜,定量分析主要基于與標準品的比較是其最大應用領域定性分析；不是色譜的強項基于樣品的保留時間比較借助于和其聯用的紫外、質譜或其他檢測器對定量及定性分析的要求靈敏度、精度及準確度的要求樣品量的要求；復雜樣品的分析能力容易使用,色譜方法轉換,如果沒有與文獻或要求相近的色譜柱轉換進樣量轉換流速,液相色譜實驗所需的基本參數,液相色譜實驗所需的基本參數流動相：種類及配比，等度或梯度固定相：色譜柱類型及內徑、長短流動相輸送系統參數：流速檢測器參數：紫外檢測波長，靈敏度等溫度控制進樣量以上參數即構成一個具體的HPLC方法；亦稱色譜條件,評價液相色譜方法的標準,問題：什么樣的分離結果是好的？分離度？靈敏度？,什么是色譜的分離度,分離度的公式：,R：分離程度的量度,影響分離度的因素：K、及N,分離度方程：K是容量因子，表達了被分離組分與柱填料之間作用的強弱是分離因子，描述兩個被分離組份分離的好壞程度，是化學因素N是理論塔板數，描述色譜峰譜帶展寬的程度,若N增加2倍或3倍,R會如何變化?,分離度方程解析：柱效項,N理論塔板數：分離效率的量度,PW=.5,PW=2,色譜柱的柱效N,理論塔板數計算公式：Ws方法Wtan16切線法Wh5.54半峰高W3s93sW4s164sW5s255s,分離度與N的關系,分離度方程解析：分離因子項,若=1.1or1.4，R會如何變化？,分離因子：峰分離程度的量度,分離因子：,定義：a=1時兩組分分不開，改變a的途徑改變固定相或改變流動相(組成)改變溫度改變樣品的本身性質,通過改變流動相組成改變，同樣強度的不同溶劑改變色譜柱,改變分離因子的例子,若=1,2,10or20,R會如何變化?,分離度方程解析：容量因子項,K容量因子：保留能力的量度,V0,V1,V2,V3,時間0.5125,k值k項k對分離度影響00011/2.5022/3.6733/4.751010/11.912020/21.95,容量因子k與分離度的關系,與R的關系,容量因子k與峰高的關系,改變k值的方法：調節流動相的極性（比例）、pH、離子強度等梯度淋洗,改變容量因子K的例子,譜圖,、k及N如何控制分離度,對稱因子計算示意圖,色譜峰的對稱性對稱因子：a.拖尾因子b.不對稱因子,峰對稱因子計算公式,對稱因子(fs)：,式中：fs=0.951.05為正常峰fs0.95為前延峰fs1.05為拖尾峰,液相色譜原理更進一步的探討,離子型化合物的分離方式多數化合物是離子型的！使用離子交換柱：離子交換法主要用于“強”陰、陽離子使用反相柱離子抑制色譜法：通過改變流動相的pH值，使樣品成中性離子對色譜法：加入“對離子”，使樣品呈中性,離子抑制色譜,離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動相的pH值，抑制樣品離子的電離主要適用于弱酸性化合物的分離降低流動相的pH值，使樣品降低離子化使用硅膠基質C18填料使用條件應在填料基質的范圍內硅膠柱的pH在2-8（較保險值3-7）內,離子抑制色譜實例,而在乙腈/水并且pH=7時，多數組份保留時間很短，無法完全分離。,離子抑制色譜的使用范圍,下列情況下不能使用離子抑制方法，如果：一些酸在pH低于2時還保持離子化一些堿在pH高于7時還保持離子化可以有以下的選擇離子交換色譜使用聚合物或其他耐堿性流動相的反相柱，在pH高于7時用離子抑制法使用“離子對色譜法”,在高pH值下用離子抑制,色譜柱：D18-613(聚合物基質)，室溫流動相：乙腈/0.01MNH4OH+0.01MTBA流速：1.0ml/min檢測：UV-240nm樣品：巴比妥的衍生物巴比妥己瑣巴比