-,1,E玫瑰花環形成實驗,中山醫學院免疫教研室2011-04,ERosetteFormingCellTest,-,2,掌握E花環形成的原理熟悉E花環形成實驗的步驟及光鏡下E花環的形態熟悉磁珠分離的原理,實驗目的,T細胞的表面分子是T細胞與其它細胞和分子間相互識別及作用的物質基礎。它們在T細胞活化、增殖和分化等過程中起重要作用。TCR-CD3復合物參與T細胞的抗原識別和信號轉導；CD2、CD28、CTLA-4、CD45、CD40L等膜蛋白參與T細胞活化及T細胞與其它細胞間相互作用。CD4/CD8分子輔助TCR識別結合抗原，參與信號轉導；根據CD4和CD8分子的表達將其分為CD4+T和CD8+T細胞。,T細胞表面分子,-,4,依靠表面標記的分離方法,流式細胞術分離法：利用各種熒光素標記的表面標記特異性抗體，使不同表面標記的細胞結合上不同的熒光素，借助熒光活化細胞分選儀將各種細胞分離開來。,*,-,5,*免疫磁珠分離法：將針對細胞某種表面標記的特異性抗體包被在磁性微珠上，與磁珠交聯的抗體能夠特異性結合具有這種表面標記的細胞，然后用強磁場可將具有這種表面標記的細胞分離出來。,磁珠(microbead),標記細胞上的磁珠在掃描電鏡下也幾乎看不到,-,6,磁珠分離策略：,一.陽性分選,磁珠標記目的細胞,未標記細胞先行流出,移出磁場后收集目的細胞,CD4+T細胞,分離柱,CD4-T細胞,-,7,磁珠標記非目的細胞,目的細胞先行流出,二.陰性分選,-,8,成熟的人T細胞表面表達綿羊紅細胞（SRBC）受體（即CD2分子），能與SRBC結合形成玫瑰花環樣結構，可在光學顯微鏡下觀察計數。本法可用于分離外周血T細胞及檢測T細胞的數量和比例。,E花環分離法原理,*,-,9,實驗方案,取外周血,綿羊紅細胞,淋巴細胞,分離,顯微鏡下觀察,+,-,10,實驗材料,1.肝素抗凝血2.Hanks液3.淋巴細胞分離液4.綿羊紅細胞懸液5.滅活小牛血清6.水平離心機、37溫箱、顯微鏡等,-,11,實驗步驟,用Hanks液配成106細胞/0.1ml,-,12,加等量滅活小牛血清(0.1ml),取0.1ml,加入0.5綿羊紅細胞0.2ml,混勻，37溫箱放置5分鐘,1000rpm離心5min,-,13,加1小滴1美藍，用毛細吸管輕輕混勻,取1滴于玻片上，加上蓋玻片,高倍鏡下觀察玫瑰花環形成細胞,置4冰箱,5min,30-45min,-,14,結果判斷,凡能結合三個以上綿羊紅細胞者為玫瑰花形成陽性細胞。正常人的花環形成率50-70%，大致可以代表周圍血中T細胞的百分數。,-,15,左:（甲紫染色，800）：可見2個被綿羊紅細胞包圍而形成玫瑰環的T淋巴細胞；右:（吖啶橙染色）：圖中可見3個染成橙黃色熒光的T淋巴細胞被綿羊紅細胞所包圍。,T淋巴細胞玫瑰花環,-,16,T淋巴細胞玫瑰花環掃描電鏡，6500,-,18,測定外周血中的T細胞數，觀察受檢者的細胞免疫功能及免疫增強劑的療效。觀察免疫抑制劑的效果，協助進行惡性腫瘤療效的觀察及預后判斷等。,臨床應用,-,19,注意事項