第十一章熒光分析法,本章基本要求：理解分子熒光的基本原理；理解分子熒光激發光譜、發射光譜的含義；掌握分子熒光發射光譜的特征；了解熒光光譜儀的組成及部分作用；掌握熒光分析法的主要應用范圍。,第一節熒光分析法的基本原理,一、分子熒光分子熒光的產生分子吸收電磁輻射后處于激發態，激發態分子經歷碰撞及發射的去激發過程。一般用Jablonski能級圖來定性描述分子吸收和發射過程。分子的電子能級與激發過程物質的分子體系中存在著電子能級、振動能級和轉動能級。由于一般的光譜儀器分辨不出轉動能量，因而Jablonski能級圖中未畫出轉動能級。,若分子的電子數是偶數，則分子中電子凈的自旋之和為S=0，即基態分子的電子是自旋成對的。由分子多重性的定義有M=2S+1=1,稱之為單重態。基態單重態以S0表示，S1和S2則分別代表分子的第一和第二激發單重態。當分子處于激發態時，若分子的電子自旋與基態相同，仍然是單重態，即分子處于S1和S2。,在激發態中，分子的某個電子也有可能改變自旋，即自旋平行則S=1，所以多重性M=2S+1=3,分子處于這樣的激發態稱為三重態，圖中最低三重態以符號T1表示，T2代表較高的激發三重態。由于自旋平行比自旋配對的狀態更穩定，故三重態的能級比單重態的能量略低。每個電子能級都有多個振動能級，在同一個電子能級中，最低的線代表該能級的振動基態。吸收過程發生在10-15s左右的時間內。,分子吸收和發射過程的Jablonski能級能級圖,S0,3210,3210,T2,S1,3210,21043210,S2,T1,1234吸收吸收熒光磷光,分子的去激發過程,分子被激發到較高的能級后不穩定，將以不同途徑釋放多余的能量回到基態，該過程為分子的去激發過程。去激發包括下面幾個可能的途徑。振動弛豫在凝聚相體系中，被激發到激發態的分子通過與溶劑分子的碰撞迅速以熱的形式把多余的振動能量傳遞給周圍的分子，而自身返回該電子能級的最低振動能級，這一過程稱為振動弛豫。振動弛豫過程發生大約為10-12s。,內部能量轉換,當S2的較低振動能級與S1的較高振動能級的能量相當或重疊時，分子有可能從S2的振動能級以無輻射方式過渡到S1的能量相等的振動能級上該過程為內部能量轉換。內轉換發生的時間約為10-12s。內轉換過程同樣也發生在激發三重態的電子能級間。,由于振動弛豫和內轉換過程極為迅速(10-12s),因此，激發后的分子很快回到第一激發單重態S1的最低振動能級。所以高于第一激發態的熒光發射十分少見。,熒光發射,當分子處于第一激發單重態S1的最低振動能級時，分子可能通過發射光子躍遷回到基態S0的各振動能級上，這個過程稱為熒光發射。熒光發射過程約為10-8s.外部能量轉換激發態分子與溶劑和其它溶質分子間的相互作用及能量轉換等過程稱為外部能量轉換。外轉換過程是熒光或磷光的競爭過程，因該過程發光強度減弱或消失，該現象稱為“猝滅”或“熄滅”。,體系間跨越,系間躍遷是不同多重態之間的一種無輻射躍遷該過程是激發態電子改變其自旋態，是分子的多重性發生變化的結果。當兩種能態的振動能級重疊時，這種躍遷的幾率增大。S1T1即是單重態到三重態的躍遷，即較低單重態振動能級與較高的三重態振動能級重疊，這種躍遷是“禁阻”躍遷。,磷光發射,激發態分子經過系間跨越到達激發三重態后，并迅速的以振動弛豫到達第一激發三重態(T1)的最低振動能級上，第一激發三重態分子經發射光子返回基態。此過程稱為磷光。磷光發射是不同多重態之間的躍遷(T1S0)屬于“禁阻”躍遷，因此磷光的壽命比熒光要長的多，約為10-3s10s。所以，將激發光從磷光樣品移走后，還常可觀察到發光現象，而熒光發射卻觀察不到該現象。,二、熒光壽命和熒光效率,熒光壽命和熒光效率是熒光物質的重要發光參數熒光壽命熒光壽命是當除去激發光源后，分子的熒光強度降低到最大熒光強度的1/e所需的時間，常用f表示。當熒光物質受到一個極其短暫的光脈沖激發后，熒光強度的變化可用下列公式表示：,若t=f,此時Ft=（1/e）F0，則上式為：則K=1/f，將其帶入則得：以對t作圖，直線斜率即為：1/f,由此計算熒光壽命。利用分子熒光壽命的差別，可以進行熒光混合物的分析。,熒光效率熒光效率也稱熒光量子效率，是發射熒光的分子數與總的激發態分子數之比。也可定義為物質吸光后發射的熒光的光子數與吸收的激發光的光子數之比。熒光的去激發過程：發射熒光返回基態(強的熒光物）無輻射躍遷回到基態(低熒光物質),熒光效率與熒光發射過程的速率及無輻射過程的速率有關。式中，Kf是熒光發射過程速率常數，Ki是系間跨越和外轉換等有關無輻射躍遷過程的速率常數總和。其中Kf主要取決于分子的化學結構，而Ki主要取決于化學環境。化學環境能使體系的Kf升高、Ki降低，從而可使體系的熒光增強；反之，則使體系的熒光減弱。,三、熒光的激發光譜和發射光譜任何熒光分子都具有兩種特征的光譜，即激發光譜和熒光光譜。熒光激發光譜激發光譜是通過固定發射波長，掃描激發波長而獲得的熒光強度(F)激發波長(ex)的關系曲線。激發光譜反映了在某一固定的發射波長下，不同激發波長激發的熒光的相對效率。激發光譜可以用于熒光物質的鑒別，并作為進行熒光測定時供選擇恰當的激發波長。,熒光發射光譜通過固定激發波長，掃描發射(即熒光測定)波長所獲得的熒光強度(F)發射波長(em)的關系的曲線為熒光發射曲線。熒光光譜反映了在相同的激發條件下，不同波長處分子的相對發射強度。熒光光譜可用于熒光物質的鑒別，并作為熒光測定時選擇恰當的測定波長或濾光片。,同步熒光光譜1971年Lloyd提出用同步掃描技術來繪制光譜圖。該技術是在同時掃描激發和發射單色器波長的條件下，測繪光譜圖，所得到的熒光強度激發波長(或發射波長)曲線為同步熒光光譜。熒光信號同步信號,測定同步熒光光譜的三種方法：固定波長同步掃描法：在掃描過程中，激發波長和發射波長有一個固定的波長差，即=emex=常數固定能量同步掃描法：使發射單色器與激發單色器之間保持一個恒定的波數差，即（1/ex1/em）107=常數。可變波長同步掃描法：使兩單色器在掃描過程中以不同的速率同時進行掃描，即波長可變。,同步熒光光譜的特點：使光譜簡化；使譜帶窄化；減小光譜的重疊現象；減小散色光的影響。這種光譜提高了分析測定的選擇性，避免了其它譜帶所引起的干擾。但對光譜學的研究不利，因為它損失了其它光譜所含的信息。,四、熒光光譜的特征,斯托克斯(Stokes)位移在溶液中，分子的熒光發射波長總是比其相應的吸收(或激發)光譜的波長長。熒光發射這種波長位移的現象稱為Stokes位移。原因：處于激發態的分子一方面由于振動弛豫等損失了部分能量，另一方面溶劑分子的弛豫作用使其能量進一步損失，因而產生了發射光譜波長的位移。Stokes位移表明在熒光激發和發射之間所產生的能量損失。（見P220圖11-3）,鏡像對稱規則一般而言，分子的熒光發射光譜與其吸收光譜之間存在著鏡像關系。（見P220圖)鏡像對稱規則的產生是由于大多吸收光譜的形狀表明了分子的第一激發態的振動能級結構，而熒光發射光譜則表明了分子基態的振動能級結構。一般情況下，分子的基態和第一激發單重態的振動能級結構類似，因此吸收光譜的形狀與熒光發射光譜的形狀呈鏡像對稱關系。,熒光光譜的形狀與激發波長無關用不同波長的激發光激發熒光分子，可以觀察到形狀相同的熒光發射光譜。這是由于熒光分子無論被激發到哪一個激發態，處于激發態的分子經振動弛豫及內轉換等過程后最終回到第一激發態的最低振動能級。而分子的熒光發射總是從第一激發態的最低振動能級躍遷到基態的各振動能級上。,五、影響熒光強度的因素,熒光是由具有熒光結構的物質吸收光后產生的，其發光強度與該物質分子的吸光作用及熒光效率有關，影響物質熒光強度的因素主要有兩個：分子結構一般具有強熒光的分子都具有大的共軛鍵結構、供電子取代基、剛性的平面結構等。分子中至少具有一個芳環或具有多個共軛雙鍵的有機化合物才容易發射熒光，而飽和的或只有孤立雙鍵的化合物，不呈現顯著的熒光。發光分子所處的環境熒光分子所處的溶液環境對其熒光發射有直接的影響。因此適當的選取實驗條件有利于提高熒光分析的靈敏度和選擇性。,分子結構,躍遷類型：大多數熒光化合物多是由或n躍遷所致的激發態去活后，發生或n躍遷產生的。躍遷的量子效率高，是由于躍遷的摩爾吸光系數比n躍遷大1001000倍,躍遷的壽命(10-710-9s)又比n(10-510-7）躍遷壽命短，因此Kf較大；其次，系間跨越的速率常數小，有利于發射熒光。,共軛效應,含有躍遷能級的芳香族化合物的熒光最強，最有用。含脂肪族和脂環族羰基結構的化合物也會發射熒光，但這類化合物的數量比芳香族少。稠環化合物一般會產生熒光。最簡單的雜環化合物（吡啶、呋喃、噻吩、吡咯）等不產生熒光。當苯環被稠化至雜環核上時，吸收峰的摩爾吸光系數增加，因此喹啉、吲哚等會產生熒光。,取代基效應,苯環上的取代基會引起最大吸收波長的位移及相應熒光峰的改變。給電子基團，使熒光增強。如:NH2,OH,OCH3,NHCH3和N(CH3)2等，吸電子基團，使熒光減弱如:Cl,Br,I,NHCOCH3,NO2和COOH等，。,分子的剛性效應,在同樣長共軛分子中，分子的剛性越強，熒光效率越大。本來不發生熒光或熒光較弱的物質與金屬離子形成配位化合物后，如果剛性共平面性增加，則可以產生熒光或增強熒光。如：8-羥基喹啉本身是弱熒光物質，與Mg2+、Al3+形成配位化合物后，熒光增強。順反異構體的熒光性,聯苯,芴,=0.2,=1.0,環境因素,熒光分子所處的溶液環境對其熒光發射有直接的影響。適當的選取實驗條件有利于提高熒光分析的靈敏度和選擇性。溶劑效應溶劑的極性：溶劑的極性增大，躍遷的能量減小，紅移。溶劑的粘度溶劑的粘度降低，分子間碰撞機會增加，無輻射躍遷幾率增加，熒光減弱。,溫度的影響由于當溫度降低時，溶劑的粘度增大，溶劑的弛豫作用大大減小，熒光發射幾率增加；當溫度升高時，碰撞頻率增加，外轉換的去激發幾率增加，熒光發射幾率變小。一般地，隨溫度降低，溶液中熒光效率和熒光強度將增大，并伴隨光譜的藍移。因此，選擇低溫條件進行熒光檢測將有利于提高分析的靈敏度。,pH的影響對于含有酸性或堿性基團的熒光物質而言，溶液的pH將對這類物質的熒光強度產生較大的影響。如：在pH712的溶液中，苯胺以分子形式存在，產生藍色熒光；當pH3、pH13時，苯胺以陽離子、陰離子形式存在，均無熒光。溶液的pH也影響金屬配合物的熒光性質。,熒光猝滅熒光猝滅：熒光分子與溶劑或其它溶質分子之間相互作用，使熒光強度減弱的作用。熒光猝滅劑：能引起熒光強度降低的物質。動態猝滅：被激發的熒光分子與猝滅劑發生碰撞，使熒光分子以無輻射形式躍遷回到基態而使熒光猝滅。靜態猝滅：熒光分子與猝滅劑形成不發光的基態配合物從而使熒光猝滅。氧是最常見的碰撞猝滅劑，因此在較嚴格的熒光實驗室中，需要除氧。利用熒光的這兩種猝滅作用可以檢測猝滅劑的濃度。,自猝滅：當熒光物質的濃度較大時，會產生激發態的熒光分子與基態的熒光分子碰撞從而使熒光猝滅。因此在熒光測量中，熒光物質的濃度不應太大。當物質中存在能與熒光分子發生能量轉移的物質時，有時也使體系的熒光強度下降。,內濾作用內濾作用：當溶液中存在能吸收熒光物質的激發光或發射光的物質時，會使體系熒光減弱的現象。散射光散射光對熒光測定有干擾，尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光。選擇適當的激發波長可消除此干擾。例：見書224225頁,第二節熒光定量分析方法,一、熒光強度與物質濃度的關系I0IF在ECl0.05時，F=KC,溶液的熒光強度與溶液中熒光物質的濃度呈線性關系；在ECl0.05，溶液的熒光強度與溶液中熒光物質的濃度不呈線性關系；熒光分析法的測定靈敏度高。,二、定量分析法,校正曲線法比例法聯立方程式法,第三節熒光分光光度計第四節熒光分析新技術簡介,掌握內容：分子熒