.,1,細(xì)胞培養(yǎng)之無菌操作,.,2,目錄,.,3,無菌定義：對(duì)一個(gè)環(huán)境所謂的無菌，是指在環(huán)境中一切有生命活動(dòng)的微生物的營養(yǎng)細(xì)胞及其芽胞或孢子都不存在無菌技術(shù)定義：無菌技術(shù)是細(xì)胞工程的基本技術(shù)包括實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備、培養(yǎng)室和超凈臺(tái)的消毒、洗手和著裝、無菌操作等意義：因體外培養(yǎng)細(xì)胞沒有抗感染能力，防止污染則是決定培養(yǎng)成功與否的首要條件，即便是在設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室，若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范，也會(huì)導(dǎo)致污染。為在一切操作中盡可能保證無菌，每一項(xiàng)工作我們都必須做到有條不紊和完全可靠。消毒滅菌消毒：是指殺死病原微生物、但不一定能殺死細(xì)菌芽孢的方法。通常用化學(xué)的方法來達(dá)到消毒的作用。用于消毒的化學(xué)藥物叫做消毒劑。滅菌：殺滅或除去特定環(huán)境或物品中一切微生物的過程。目前標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，滅菌過程必須使滅菌物品污染的微生物存活率減少到10-6及以下。,.,4,消毒劑種類,依據(jù)化學(xué)成分主要分為9種醛類消毒劑雜環(huán)類消毒劑含氯消毒劑過氧化物類消毒劑含碘消毒劑季銨鹽類消毒劑酚類消毒劑胍類消毒劑醇類消毒劑重金屬類消毒劑生物類消毒劑,.,5,消毒,新潔爾滅消毒液原理：新潔爾滅滅菌原理為破壞細(xì)胞膜、改變其滲透性而起殺菌作用84消毒液84消毒液是一種以次氯酸鈉為主的高效消毒劑，主要成分是次氯酸鈉，次氯酸鈉的漂白性是其與水反應(yīng)生成的次氯酸所帶來的，因次氯酸具有極強(qiáng)的氧化性，能夠?qū)⒋蠖鄶?shù)物質(zhì)氧化，使其變性，因而能起到消毒作用,.,6,消毒,75%酒精消毒原理酒精之所以能消毒是因?yàn)榫凭軌蛭占?xì)菌蛋白的水分，使其脫水變性凝固，從而達(dá)到殺滅細(xì)菌的目的。如果使用高濃度酒精，對(duì)細(xì)菌蛋白脫水過于迅速，使細(xì)菌表面蛋白質(zhì)首先變性凝固，形成了一層堅(jiān)固的包膜，酒精反而不能很好地滲入細(xì)菌內(nèi)部，以致影響其殺菌能力。75%的酒精與細(xì)菌的滲透壓相近，可以在細(xì)菌表面蛋白未變性前逐漸不斷地向菌體內(nèi)部滲入，使細(xì)菌所有蛋白脫水、變性凝固，最終殺死細(xì)菌，酒精濃度低于75%時(shí)，由于滲透性降低，也會(huì)影響殺菌能力。,.,7,潔凈級(jí)別無菌藥品生產(chǎn)所需的潔凈區(qū)可分為4個(gè)級(jí)別,A級(jí)：高風(fēng)險(xiǎn)操作區(qū)，如灌裝區(qū)、放置膠塞桶和與無菌制劑直接接觸的敞口包裝容器的區(qū)域及無菌裝配或連接操作的區(qū)域，應(yīng)當(dāng)用單向流操作臺(tái)（罩）維持該區(qū)的環(huán)境狀態(tài)。單向流系統(tǒng)在其工作區(qū)域必須均勻送風(fēng)，風(fēng)速為0.36-0.54m/s（指導(dǎo)值）。應(yīng)當(dāng)有數(shù)據(jù)證明單向流的狀態(tài)并經(jīng)過驗(yàn)證。在密閉的隔離操作器或手套箱內(nèi)，可使用較低的風(fēng)速。B級(jí)：指無菌配制和灌裝等高風(fēng)險(xiǎn)操作A級(jí)潔凈區(qū)所處的背景區(qū)域。C級(jí)和D級(jí)：指無菌藥品生產(chǎn)過程中重要程度較低操作步驟的潔凈區(qū)。,.,8,實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備,在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作計(jì)劃，有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需耗材物品及試劑，清點(diǎn)無誤后將其放置在操作場(chǎng)所進(jìn)行消毒處理。凡是需要帶入安全柜（超凈臺(tái)）的培養(yǎng)基、胰酶、培養(yǎng)皿（培養(yǎng)瓶）等耗材和試劑在經(jīng)過消毒處理之后再用75%的酒精棉球擦拭表面。,.,9,培養(yǎng)室的消毒,進(jìn)入無菌實(shí)驗(yàn)室前先穿好無菌服、戴帽子及口罩無菌實(shí)驗(yàn)室每周用0.2%的新潔爾滅拖洗地面、粘塵桿去除灰塵，再用臭氧消毒室內(nèi)臺(tái)面要保持潔凈，做完實(shí)驗(yàn)后用75酒精或千分之三新潔爾滅棉球擦拭超凈工作臺(tái)的臺(tái)內(nèi)、邊臺(tái)的臺(tái)面、倒置顯微鏡的載物臺(tái)等實(shí)驗(yàn)所用物品盡可能一次性準(zhǔn)備好，避免多次出入,.,10,洗手和著裝,.,11,洗手和著裝,.,12,洗手和著裝,.,13,洗手和著裝,.,14,無菌操作個(gè)人防護(hù),在實(shí)驗(yàn)室工作時(shí)必須使用個(gè)體防護(hù)裝備個(gè)人衣服和普通實(shí)驗(yàn)服不能穿入細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不能穿長(zhǎng)擺裙，短裙及短褲，不得在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)穿露腳趾的鞋子實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁處理和配戴眼鏡嚴(yán)禁穿著細(xì)胞培養(yǎng)室專用防護(hù)服離開實(shí)驗(yàn)室發(fā)生手套破損應(yīng)立即更換,.,15,無菌操作超凈臺(tái)的消毒,超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75%酒精擦洗，然后用紫外線消毒30min在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不可過多堆放，否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果一些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒,.,16,超凈工作臺(tái),超凈臺(tái)是做一般對(duì)人體沒有直接傷害的常規(guī)細(xì)菌的操作實(shí)驗(yàn)，正壓送風(fēng)，工作臺(tái)工作區(qū)域的氣流形成為水平層流型。區(qū)內(nèi)空氣經(jīng)初效過濾器過濾后，由風(fēng)機(jī)壓入靜壓箱，再經(jīng)高效過濾器過濾，由此送出的潔凈氣流，以一定的均勻斷面風(fēng)速通過操作區(qū)將塵埃顆粒帶走，從而形成高潔凈的工作環(huán)境。超凈空氣的流速為，這已足夠防止附近空氣可能襲擾而引起的污染，這樣的流速也不會(huì)妨礙采用酒精燈或本生燈對(duì)器械等的灼燒消毒,.,17,生物安全柜,生物安全柜一般是做致病菌，霉菌，酵母菌，病毒來用，操作區(qū)域是負(fù)壓，簡(jiǎn)單說是往上處抽風(fēng)的，當(dāng)然致病菌也不是直接抽出排到室外，是過濾在生物安全柜的頂部漏器上，從排風(fēng)量上可以分為，50%外排型，75%以及100%外排型。在生物安全柜內(nèi)所形成的幾乎沒有微生物的環(huán)境中，盡量避免使用明火，酒精燈的火焰可能會(huì)影響室內(nèi)的氣流平衡。,.,18,無菌操作器皿的消毒,所有用到的器皿（買時(shí)已滅菌的除外）都必須經(jīng)過高壓滅菌烘干后才能放入超凈臺(tái)內(nèi)已滅菌的、外包裝完好的培養(yǎng)瓶、離心管、凍存管等可以表面經(jīng)75%酒精擦拭后直接放入超凈臺(tái)凡是帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面,.,19,無菌操作細(xì)胞處理,超凈臺(tái)經(jīng)過30min紫外滅菌后，才能打開通風(fēng)裝置開始工作的第一步就是點(diǎn)燃酒精燈，之后的一切操作都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸，繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時(shí)仍要過火進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及已消毒器皿內(nèi)部，如已接觸，則取備品更換不同種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分次處理，以免交叉污染,.,20,無菌操作細(xì)胞處理,培養(yǎng)瓶打開后，應(yīng)平放在臺(tái)面，瓶口保持斜向上打開的培養(yǎng)液瓶口也應(yīng)保持適度傾斜放置，避免瓶口垂直放置在具體操作過程中，也應(yīng)注意所有的瓶口保持傾斜，手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時(shí)如吸管尖碰到瓶口，則應(yīng)將吸管丟掉吸取營養(yǎng)液、PBS、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染,.,21,無菌操作物品擺放,為拿取方便，工作臺(tái)面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央培養(yǎng)的細(xì)胞較多時(shí)，打開的培養(yǎng)瓶蓋應(yīng)按照一定的順序擺放，保證瓶子之間的蓋子不會(huì)亂蓋,.,22,無菌操作培養(yǎng)瓶的拿取,從培養(yǎng)箱內(nèi)取培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶之前，先用酒精消毒雙手，再取培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶做鏡下觀擦?xí)r，保持蓋子是擰緊狀態(tài)操作結(jié)束后，培養(yǎng)瓶先擰緊瓶蓋，經(jīng)75%酒精擦拭后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)瓶蓋、胰酶瓶等的蓋子只有在要取液時(shí)方能打開，取完后立即燒灼旋緊。,.,23,無菌操作結(jié)束后消毒,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，規(guī)范熄滅酒精燈，用75%酒精棉球擦拭超凈臺(tái)內(nèi)部，操作區(qū)域至少擦拭3次超凈臺(tái)外部，操作口處用75%酒精棉球擦拭消毒結(jié)束后，拉下超凈臺(tái)玻璃門，打開超凈臺(tái)紫外30min離開培養(yǎng)室時(shí)，注意關(guān)閉照明燈，打開紫外燈,.,24,污染及其防治處理,化學(xué)污染物（培養(yǎng)基、血清和水中的雜質(zhì)、內(nèi)毒素、增塑劑和去污劑）生物污染物（細(xì)菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細(xì)胞系的交叉污染）,.,25,生物污染細(xì)菌,細(xì)菌：是一大類廣泛存在的單細(xì)胞微生物。直徑一般為幾個(gè)微米，外形多樣（球狀、桿狀盒螺旋狀）。培養(yǎng)物被細(xì)菌污染后，幾天內(nèi)即可通過簡(jiǎn)單的肉眼觀察發(fā)現(xiàn)：被感染的培養(yǎng)物通常呈渾濁狀，在低背景下可見移動(dòng)的微小顆粒，高倍鏡下可分辨各個(gè)細(xì)菌的形狀。,.,26,生物污染酵母,酵母是真菌界的一種單細(xì)胞真核微生物,大小從數(shù)微米到40微米不等。與細(xì)菌污染類似。在顯微鏡下，酵母呈單個(gè)卵圓形或球形顆粒。有些會(huì)芽生出較小的顆粒。,.,27,生物污染霉菌,霉菌是真菌界的一種真核微生物，已被稱為菌絲的多細(xì)胞絲狀體形式生長(zhǎng)。一般情況下，霉菌污染是較易發(fā)現(xiàn)辨別的。,.,28,生物污染病毒,病毒是一種微觀感染性物質(zhì)，利用宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行復(fù)制。病毒體積極小，因此要檢測(cè)培養(yǎng)物中有無病毒以及將其從細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室所用試劑中去除都十分困難。通過電子顯微鏡檢查、一組抗體的免疫染色、ELISA實(shí)驗(yàn)或者采用適當(dāng)病毒引物的PCR技術(shù)可以檢測(cè)出細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒污染。,.,29,生物污染支原體,支原體是一種沒有細(xì)胞壁的簡(jiǎn)單細(xì)菌，被認(rèn)為是能夠進(jìn)行自我復(fù)制的最小微生物。由于體積極小，支原體的檢測(cè)十分困難。唯一切實(shí)有效的檢測(cè)支原體污染的方法就是采用熒光染色、ELISA、PCR、免疫染色、放射自顯影或者微生物學(xué)測(cè)定技術(shù)定期檢測(cè)培養(yǎng)物。,無支原體細(xì)胞,支原體感染細(xì)胞,用熒光染料Hoechst33258染色，此染料能與DNA特異結(jié)合，可是支原體內(nèi)DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面合,.,30,生物污染交叉污染,交叉污染雖不如微生物污染普遍，但許多細(xì)胞系與HeLa細(xì)胞及其他生長(zhǎng)迅速的細(xì)胞系間廣泛的交叉污染是一個(gè)明確的問題會(huì)造成嚴(yán)重后果。細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、形態(tài)會(huì)發(fā)生變化。無法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)菌帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞細(xì)胞一旦購置或從別處引入，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇培養(yǎng),.,31,污染防治,在生產(chǎn)過程中，從器皿的洗滌、生產(chǎn)所需物品的準(zhǔn)備到細(xì)胞的生產(chǎn)所有的工作人員必須按照GMP和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程完成各項(xiàng)