.,1,微生物學實驗,海南大學海洋學院,.,2,實驗一細菌的形態和結構觀察,.,3,一、實驗目的,觀察細菌的菌落特征掌握簡單染色法和細菌涂片方法在油鏡下觀察細菌個體的形態特征,.,4,形態觀察主要包括群體的形態和個體的形態觀察。細菌的基本形態主要分為球菌、桿菌、螺旋菌三大類，近年還發現星狀和四方形細菌等。細菌形態受培養時間、培養基成分、濃度、培養溫度、培養時間等發生變化。細菌菌落大多表面光滑濕潤，有光澤，一般菌落較小，質地顏色均勻，同培養基結合不緊密。菌落特征與組成菌落的細胞結構、生長狀況、排列方式、好氣性和運動性直接相關。細菌個體微小，較透明，必須染色方可呈現。根據細菌個體形態觀察的不同要求，可將染色分為3種類型：簡單染色、鑒別染色、特殊染色。,二、實驗的基本原理,.,5,二、實驗的基本原理,簡單染色法原理：細菌在中性的環境中帶負電荷，用堿性染料（解離時帶正電荷）如美蘭、結晶紫等進行染色。采用加熱或化學固定兩種方法，使菌體粘附于玻片上，并且增加菌體對染料的親和力,.,6,三、實驗材料,顯微鏡（顯微鏡燈）、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等。0.05%和0.1%呂氏堿性美藍染色液，0.5%番紅染液，中性紅染液，二甲苯，生理鹽水細菌三種形態的染色標本。大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，哈氏弧菌和無乳鏈球菌24h液體培養基培養物蓋玻片、凹玻片、接種環、酒精燈。,.,7,簡單染色法（一般染色法）.菌種：牙垢細菌.涂片.干燥：自然氣干或酒精燈高處微微加熱。固定.染色：在整個涂面上滴加齊氏石炭酸復紅，染色分鐘。.水洗：傾去染液，用自來水細流沖洗至流下的水中無染料顏色為止。干燥：空氣中自然干燥。鏡檢：在油鏡下觀察牙垢中的各種細菌形態并繪圖。,四、實驗步驟,.,8,四、實驗步驟,油鏡的使用1.用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。2.調節光亮度3.低倍鏡觀察：粗調、細調4.依次再進行中倍、高倍觀察5.油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細調至看清物象為止。6.換片：另換新片，必須從第三條開始操作。7.用后復原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復原。,.,9,顯微鏡保養和使用中的注意事項：1.不準擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度3.觀察標本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調節器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。4.觀察時，兩眼睜開，養成兩眼能夠輪換觀察的習慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時，右眼注視繪圖。5.拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。6.顯微鏡應存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。,四、實驗步驟,.,10,細菌三種基本形態的觀察：菌落形態觀察和個體形態觀察，這里主要指個體形態的觀察。1.結合油鏡的使用，觀察三張細菌染色片（球狀菌、桿狀菌、和螺旋狀菌），邊觀察邊繪圖。2.看示范鏡：觀察雙球菌、四聯球菌，并繪圖。,四、實驗步驟,.,11,思考題,油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應特別注意些什么？使用油鏡時，為什么必須用鏡頭油？鏡檢標本時，為什么先用低倍鏡觀察，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？,.,12,實驗二細菌的革蘭氏染色,.,13,一、實驗目的,掌握細菌的革蘭氏染色進一步熟練掌握顯微鏡油鏡的使用技術觀察和識別細菌細胞的特殊構造,.,14,細菌細胞壁的結構和組成存在差異，因此不同細菌對革蘭氏染色有不同的反應（陽性和陰性）：革蘭氏陰性菌的細胞壁中含有較多脂類，肽聚糖層較薄、交聯度低，當以95%酒精脫色時，脂類被溶解除去，使得細胞壁空隙變大，肽聚糖因95%酒精處理，其孔徑會縮小，但由于肽聚糖含量較少，細胞壁孔徑縮小有限，使得結晶紫與碘形成的紫色染料復合物被95%酒精洗脫出細胞壁之外，并被隨后的紅色復染劑染成紅色；革蘭氏陽性菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，脂類含量少，經95%酒精脫色處理后，肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，使得結晶紫與碘形成的紫色染料復合物很難被95%酒精洗脫出細胞壁之外，因此細菌仍保留初染時的顏色，呈現紫色。,二、實驗的基本原理,.,15,顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環，香柏油，二甲苯，雙層瓶，擦鏡紙，生理鹽水，吸水紙，染色缸等。染色劑：草酸銨結晶紫染色液，盧（路）哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番紅染色液。菌種：哈氏弧菌和鰻弧菌24h普通海水瓊脂斜面28培養物，金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌24h牛肉膏瓊脂斜面28培養物。,三、實驗材料,.,16,革蘭氏（Gram）染色法1.涂片2.初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。4.脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約30秒，后立即用流水沖洗。5.復染：滴加番紅染色液，染1分鐘，水洗后用吸水紙吸干。6.鏡檢：觀察染色結果并繪圖。,四、實驗步驟,.,17,思考題,要得到正確的革蘭氏染色結果必須注意哪些操作？關鍵在哪幾步？為什么？,.,18,實驗三實驗室環境及人體表面的微生物檢查,.,19,認識細菌分布的廣泛性；掌握對菌落識別；懂得無菌操作的重要性。,一、實驗目的,.,20,每一菌體在適宜條件下，經過多次細胞分裂可形成一個肉眼可見的子細胞集合體，稱為菌落。由于不同細菌其個體的形態、結構、生理和生化等特征不同，當一個菌體經分裂繁殖形成菌落后，就使得菌落呈現其固有的特點。通過合適的方法，將自然環境中的微生物接種到平板培養基上，經過培養后觀察平板上的菌落，就可以檢查環境中及人體細菌的數量和類型。,二、實驗的基本原理,.,21,無菌試管，無菌吸管，無菌空培養皿，細菌計數器，蠟筆，玻片，消毒牙簽，酒精燈，接種環，無菌棉拭子等。瓊脂平板培養基，高層瓊脂培養基，無菌生理鹽水，2碘酒，75乙醇，普通瓊脂平板，血瓊脂平板，革蘭氏染色劑。水樣，泥土，空氣和人體。,三、實驗材料,.,22,1、正常人體的細菌檢查皮膚細菌的檢查（1）將手指在平板上按一下；取一根頭發，用無菌鑷子貼放在平板上。（2）平板培養、觀察,四、實驗步驟,.,23,咽部細菌的檢查（1）用無菌棉拭子蘸取咽部分泌的液體，然后將該棉拭子在血瓊脂平板一端涂抹，接下來用接種環以涂抹處為起點，在平板上畫之字形圖案進行分離。（2）將血瓊脂平板置37培養箱中，培養1824h，挑選不同菌落作革蘭氏染色，鏡檢。,四、實驗步驟,.,24,牙垢中細菌的檢查（1）用消毒牙簽剔牙垢少許，置于玻片中央。（2）加少許生理鹽水將牙垢混勻，涂成薄層，用酒精燈干燥固定。（3）革蘭氏染色，鏡撿。,四、實驗步驟,.,25,2、空氣中細菌的檢查（1）取4個無菌操作制備的瓊脂平板，將3個分別置于實驗臺、走廊、窗臺等位置，并打開皿蓋放置1530min后，蓋好皿蓋；另外1個不打開皿蓋作為對照。（2）將上述4個瓊脂平板置37培養箱中培養1824h。,四、實驗步驟,.,26,3.水中細菌的檢查（1）十倍梯度稀釋（2）稀釋水樣與培養基混合倒平板（3）培養、觀察。,四、實驗步驟,.,27,對各種來源的樣品進行對比，如平板菌落數和菌落類型等？飯前為何要洗手？如何防止培養物的污染與防止細菌的擴散方面？,思考題,.,28,實驗四培養基的配制與滅菌,.,29,一、實驗目的,1.熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準備。2.掌握培養基和無菌水的制備方法。3.掌握高壓蒸氣滅菌技術。,.,30,培養基是用人工的辦法將多種營養物質按微生物生長代謝的需要配制成的一種營養基質。培養基中均應含有滿足微生物生長發育且比例合適的水分、碳源、氮源、無機鹽、生長因素以及某些特需的微量元素外還應具有適宜的酸堿度pH值、緩沖能力、氧化還原電位和滲透壓。,二、實驗的基本原理,.,31,(1)藥品和試劑：牛肉膏、蛋白陳、NaCl、10NaOH溶液、l0鹽酸溶液、瓊脂、水(2)器材：小燒杯、小鋁鍋、天平、牛角匙、1000mL刻度燒杯、玻棒、玻璃珠、pH試紙、試管、分裝漏斗、棉花。高壓蒸氣滅菌鍋、烘箱。,三、實驗材料,.,32,一、玻璃器皿的洗滌和包裝清洗并烘干玻璃器皿：如培養皿、移液管、試管等。棉塞的制作包裝培養皿和移液管等。,2-1棉塞制作方法,2-2移液管滅菌前的包裝,四、實驗步驟,.,33,二、培養基的配制,牛肉膏蛋白胨培養基的配制（一）培養基配方：牛肉膏2.5g蛋白胨5.0g、NaCl2.5g、瓊脂10.0g、自來水500mL、pH7.27.4。（二）操作步驟：1.取一個1000mL燒杯，裝500mL蒸餾水。2.按配方逐一正確稱取各種成分，依次加入水中溶解。注意：a.前一種成分溶解之后，才能加入下一種成分b.蛋白胨、肉膏可加熱促進溶解c.加熱過程應不斷攪拌，以免糊底燒焦，并適當補充因蒸發而損失的水量。,.,34,3.調pH值：用10NaOH調pH至7.27.4，用精密pH試紙對照。4.過濾液體培養基可用濾紙過濾，固體培養基可用4層紗布趁熱過濾，以利結果的觀察。但是供一般使用的培養基，該步可省略。5.分裝：將培養基分裝于5支試管，其余全部倒入250mL錐形瓶中，分別塞上棉塞。分裝時可用漏斗以免使培養基沾在管口或瓶口上面造成污染(見圖23)。分裝量：固體培養基約為試管高度的15，滅菌后制成斜面（圖24）。分裝入錐形瓶內以不超過其容積的3/5為宜。半固體培養基以試管高度的1/3為宜滅菌后垂直待凝。注意不要污染棉塞和瓶口。6.包扎成捆，掛上標簽，注明何種培養基。7.滅菌備用：滅菌條件：1210C（相當蒸汽壓力0.103MPa）培養基滅菌后必須在37下恒溫培養24h，確定無菌生長，方可使用。,.,35,圖例,圖23培養基分裝圖24斜面制作,.,36,三、稀釋水的制備,1.取一個250mL的錐形瓶裝90(或99)mL蒸餾水，放30顆玻璃珠(用于打破活性污泥、菌塊或土壤顆粒)于錐形瓶內，塞棉塞、包扎，待滅菌。2.另取5支18mm180mm的試管，分別裝9mL蒸餾水，塞棉塞、包扎，待滅菌。無菌稀釋水為微生物分離實驗中所需要的材料。,.,37,四、滅菌,加熱滅菌有干熱滅菌和濕熱滅菌。干熱滅菌法：電熱烘箱作為干熱滅菌器干熱滅菌的操作方法a.將待滅菌的物品放入恒溫箱，將溫度調節至160并維持2h；b.把恒溫箱的調節旋鈕調回零處，待溫度降到50左右，才能將物品取出。,.,38,濕熱滅菌：高壓蒸氣滅菌法,高壓蒸氣滅菌法的操作步驟如下：1.滅菌鍋內加入一定量的水。2.將待滅菌的物品放入鍋內，并關嚴鍋蓋。注意：器物不能裝得太滿。3.接通電源，進行加熱。4.排除高壓鍋內的冷空氣，可將排氣閥打開，待溫度計指示溫度為100時關閉排氣閥；或當排出的蒸氣相當猛烈且微帶藍色時關閉排氣閥。,.,39,5.當壓力達1.05kg/cm2(滅菌器內的溫度為121)即開始滅菌，使其維持1530min。對熱不穩定的培養基如含有葡萄糖、氨基酸等物質時，應適當降低壓力(0.56kg/cm2)，延長時間。6.滅菌時間一到，切斷電源，待壓力降至零時，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品，排出鍋內剩余水。7.待培養基冷卻后置于37恒溫箱內培養24h，若無菌生長則放入冰箱或陰涼處保存備用。,.,40,間歇滅菌法：,即常壓滅菌，用于一些受高溫而破壞的培養基的滅菌。操作方法：a.待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮1次，每次在100煮沸3060min，連續3d重復進行。b.在每兩次蒸煮之間，將物品（指培養基）放在37恒溫條件下培養24h，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發成營養體，以便下次蒸煮時殺滅。c.第三次蒸煮之后基本無菌，但為了確保無菌仍要放在37恒溫條件下培養24h，確定無菌才能使用。,.,41,過濾除菌法：不能用加熱滅菌的液體物質（如維生素、血清），一般可用細菌過濾器進行除菌。,用于除菌的濾器：a.蔡氏濾器，b.注射器裝置濾器,.,42,1.配制培養基有哪幾個步驟?在操作過程中應注意些什么問題?為什么?2.培養基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時滅菌應如何處理？已滅菌的培養基進行無菌檢查？3.高壓蒸汽滅菌中為什么要把冷空氣排凈，為什么在滅菌后不能驟然快速降壓，并要再放盡鍋內蒸汽才能打開鍋蓋?,思考題,.,43,實驗五細菌純種分離、培養和接種技術,.,44,1.掌握從環境（土壤、水體、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分離培養細菌的方法，從而獲得若干種細菌純培養技能。2.掌握幾種接種技術。,一、實驗目的,.,45,無菌培養皿(直徑90mm)10套、無菌移液管1mL2支、10mL1支。營養瓊脂培養基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶，無菌稀釋水90mL1瓶、9mL5管。其它：接種環、酒精燈、恒溫箱。,二、實驗材料,.,46,一、細菌的純種分離,三、實驗步驟,.,47,(一)稀釋平板法,1.取樣用無菌錐形瓶到現場取一定量的湖水，迅速帶回實驗室。2.稀釋水樣將1瓶90mL和5管9mL無菌水排列好，用記號筆依次編上101、102、103、104、105、106。在無菌操作條件下，用10mL的無菌移液管吸取10mL水樣(或其它樣品)加入編號為101無菌水(內含玻璃珠)中，將移液管吹洗三次，用手搖10min將顆粒狀樣品打散。即為101濃度的菌液。用1mL無菌移液管吸取1mL101濃度的菌液于編號為102無菌水中，將移液管吹洗三次，搖勻即為102濃度菌液。同樣方法，依次稀釋到106。,.,48,稀釋液的制備,10mL試樣90mL蒸餾水,.,49,3.平板的制作取10套無菌培養皿編號，104、105、106各3個，另一個為空氣對照。取1支1mL無菌移液管從濃度小的菌液開始，以106、105、104為序分別吸取0.5mL菌液于相應編號的培養皿內(每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻)。,.,50,加熱培養基，當其冷至45左右時，右手拿裝有培養基的錐形瓶，左手拿培養皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，靠近火焰，將皿蓋掀開，倒入培養基后將培養皿平放在桌上，順時針和逆時針來回轉動培養皿，使培養基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于30培養2448h，然后觀察結果。,a:皿法b:倒平板,.,51,取對照無菌培養皿，倒平板待凝固后，打開皿蓋10min后蓋上，倒置于30培養2448h，然后觀察結果。,.,52,（二）平板劃線法,1.平板制作：將融化并冷至約50的肉膏蛋白胨瓊脂培養基倒入無菌培養皿內，使凝固成平板。2.劃線：用接種環挑取一環樣品，左手拿培養皿，中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，將培養皿稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀半開，右手將接種環伸入培養皿內，在平板上輕輕劃線(切勿劃破培養基)。劃線完畢蓋好皿蓋，30培養2448h后觀察結果。,.,53,平板劃線分離的劃線方法左：連續劃線法（1，2依次劃線的起點）右：分區劃線法（1，2，3，4依次劃線的起點）,.,54,二、細菌的接種技術,接種方法：常用的有斜面接種法、平板接種法、液體接種法、試管深層固體培養基的穿刺接種法。接種工具：常用的有接種針、接種環、接種鉤、接種圈、接種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等。,.,55,（一）斜面接種法,左手平托兩支試管，拇指壓住兩支試管。外側是菌種試管，內側是待接種的空白斜面(兩支試管的斜面同時向上)。右手將棉塞旋松，以便在接種時容易拔出。右手拿接種環，在火焰上先將環端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部位也過火滅菌。將兩支試管的上端并齊，靠近火焰，用右手小指、無名指和手掌將兩支試管的棉塞一并夾住拔出，棉塞仍夾在手中，然后讓試管口緩緩過火焰。,1,2,3,.,56,將已灼燒過的接種環伸入菌種試管內。先冷卻，而后再用環挑取少許菌種，將接種環抽出并迅速伸入待接種試管底部，在斜面上由底部向上劃線。抽出接種環，塞上棉塞將試管插在試管架上，最后再次燒紅接種環，則接種完畢。,4,5,6,7,8,.,57,（二）液體接種和穿刺接種,1.液體接種法(從斜面菌種接入培養液)：用接種環挑取斜面菌種送入培養液中，使環在液體表面與管壁接觸輕輕研磨，將環上的菌種全部洗入培養液中，取出接種環塞上棉塞。將試管輕輕撞擊手掌使菌體在培養液中均勻分布。最后將接種環燒紅滅菌。2.穿刺接種法(從斜面菌種接入(半)固體培養基)：用接種針經火焰滅菌后，挑取少量菌種，垂直地穿入試管固體培養基中心至底部，然后穿刺線緩慢將針抽出，塞上棉塞。燒紅接種針滅菌，則接種完畢。,.,58,（三）稀釋平板涂布法,1.稀釋樣品：方法同稀釋平板分離法2.倒平板：將融化并冷至50左右的培養基倒入無菌培養皿中，冷凝后即成平板3.用無菌移液管吸取一定量的經適當稀釋的標志樣品液于平板上，換上無菌玻璃刮刀在平板上旋轉涂布均勻4.將培養皿正擺在恒溫箱中，調節一定溫度進行培養。如果培養時間較長，次日把培養皿倒置繼續培養，直至長出菌落。,.,59,（四）液體培養基中的菌種接入液體培養基接種工具：無菌移液管和無菌滴管移液管和滴管不能在火焰上燒，應預先滅菌用無菌移液管自菌種管中吸取一定量的菌液接到另一管液體培養基中，將試管塞好棉塞即可。,.,60,1.斜面接種取菌前為什么要將灼燒過的接種針在無菌培養基上沾一下？2.用一根無菌移液管接種幾種濃度的水樣時，應從哪個濃度開始？為什么？,思考題,.,61,實驗六微生物細胞的計數,.,62,1.了解血球計數板的結構及計數原理。2、掌握使用血球計數板進行微生物計數的方法。,一、實驗目的,.,63,測定微生物數量方法很多，通常采用的有顯微鏡直接計數法、平板計數法和光電比濁計數法。顯微鏡直接計數法將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，又稱血球計數板，于顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法。,二、實驗的基本原理,.,64,血球計數板的構造,.,65,血球計數板的計算方法,血球計數板上刻有一長寬各為1毫米的方形大格，其體積為0.1mm3。計數板有兩種刻度，一種是每大格分為16個中格，而每中格又分25個小格，每大格為1625小格=400小格，而另一種，則是每大格分為25個中格，而每中格又分為16個小格，則每大格為2516=400小格（計數板上的標識為XBK25）計數時，如果使用16格25格規格的計數室，要按對角線位，取左上、右上、左下、右下4個中格（即100個小格）的酵母菌數。如果使用25格16格規格的計數室除了取其4個對角方位外，還需再數中央的一個中格(即80個小方格)的酵母菌數。(6)當遇到位于大格線上的酵母菌，一般只計數大方格的上方和左方線上的酵母細胞(或只計數下方和右方線上的酵母細胞)。,.,66,計數公式,(1)1625的血球計數板計算公式：酵母細胞數ml=（100小格內酵母細胞個數100）40010000稀釋倍數(2)25x16的血球計數板計算公式：酵母細胞數ml=（80小格內酵母細胞個數80）40010000稀釋倍數,.,67,三、實驗器材,顯微鏡、血球計數板、酵母菌液、蓋玻片、吸管、吸水紙。,.,68,操作步驟,1.鏡檢計數室對計數板進行鏡檢。若有污物，則用自來水沖洗，用電吹風吹干后才能進行計數。2.加樣品在血球計數板上蓋上蓋玻片,用滴管將搖勻的酵母菌液由蓋玻片邊的小槽滴一小滴,菌液會自動進入計數室，靜置5分鐘。3.計數將血球計數板置于載物臺上，先用低倍鏡找到計數室的位置，再換高倍鏡計數。25個中格的取計數板四角和中間位置的五個中方格計菌數。重復計2-3次，取其平均值，按公式計算每毫升酵母菌液中菌體的個數。4.清洗血球計數板計數后將血球計數板用自來水沖洗干凈，勿用硬物刷，吹干后鏡檢。若不干凈，則必須重復洗滌干凈為止。,.,69,結果記錄,.,70,1.使用血球計數板應注意什么問題?2.試分析影響本實驗結果的誤差來源并提出改進措施,思考題,.,71,實驗七大腸桿菌生長曲線的測定,.,72,1.了解大腸桿菌的生長曲線特征和繁殖規律，并學會繪制生長曲線；2.學習光電比濁法測量細菌數量的方法。,一、實驗目的,.,73,將少量細菌接種到一定體積的、適合的新鮮培養基中，在適宜的條件下進行培養，定時測定培養液中的菌量，以菌量的對數作縱坐標，生長時間作橫坐標，所繪制的曲線叫生長曲線。它反映了單細胞微生物在一定環境條件下進行液體培養時所表現出的群體生長規律。細菌懸液的濃度與光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌液的濃度，并將所測的OD值與其對應的培養時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線，,二、實驗的基本原理,.,74,722型分光光度計，恒溫振蕩搖床，無菌試管，無菌吸管等。LB液體培養基。大腸桿菌。,三、實驗材料,.,75,四、實驗步驟,1.250mL三角瓶11個，分別編號為0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。2.大腸桿菌接入盛有50mLLB液體培養基振蕩培養。3.分別按對應時間將三角瓶取出，立即于4條件下貯存，待所有培養結束時一同測定OD值。,.,76,四、實驗步驟,4.將未接種的LB液體培養基倒入比色杯中，選用600nm波長分光光度計上調節零點，作為空白對照，并對不同時間培養液從0h起依次進行測定，對濃度大的菌懸液用未接種的LB液體培養基適當稀釋后測定，使其OD值在0.100.65以內，經稀釋后測得的OD值要乘以稀釋倍數，才是培養液實際的OD值。,.,77,如果用活菌計數法制作生長曲線，你認為會有什么不同?兩者各有什么缺點？次生禮謝產物的大量積累在哪個時期?根據細菌生長繁殖的規律，采用哪些措施可使次生代謝產物積累更多?,思考題,.,78,實驗八細菌的生理生化反應大分子物質的水解試驗,.,79,1、證明不同微生物對各種有機大分子的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統。2、掌握進行微生物大分子水解試驗的原理和方法。3、了解糖發酵的原理和在腸道細菌鑒定中的重要作用。4、掌握通過糖發酵鑒別不同微生物的方法。5、了解IMViC與硫化氫反應的原理及其在腸道菌鑒定中的意義和方法。,一、實驗目的,.,80,1、微生物對生物大分子的分解利用,淀粉水解：淀粉酶油脂水解：脂肪酶明膠液化：蛋白酶石蕊牛乳試驗：產酸、產堿、胨化、酸凝固等。,2、糖發酵試驗,產酸：溴甲酚紫指示劑大腸桿菌：產氣腸桿菌：產氣：杜氏小管檢測大腸桿菌：產氣腸桿菌：,3、IMViC試驗,二、實驗的基本原理,.,81,IMViC試驗,吲哚試驗：甲基紅試驗（M.R.試驗）：伏-普試驗（乙酰甲基甲醇試驗）：檸檬酸鹽試驗：,色氨酸酶：色氨酸吲哚對二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚（紅色）大腸桿菌：產氣腸桿菌：,產酸能力：強，甲基紅變紅；弱：甲基紅不變色大腸桿菌：陽性產氣腸桿菌：陰性,葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇2,3-丁二醇乙酰甲基甲醇OH二乙酰精氨酸的胍基紅色化合物大腸桿菌：陽性產氣腸桿菌：陰性,能否利用檸檬酸作為碳源大腸桿菌：陰性產氣腸桿菌：陽性,.,82,1、菌種：枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa），普通變形桿菌（Proteusvularis），產氣腸桿菌。2、培養基：固體油脂培養基，固體淀粉培養基，明膠培養基試管，石蕊牛奶試管，尿素瓊脂試管、葡萄糖發酵培養基試管和乳糖發酵培養基試管各3支，普通變形桿菌（內裝有倒置的德漢氏小管），蛋白胨水培養基，葡萄糖蛋白胨水培養基，檸檬酸鹽斜面培養基，醋酸鉛培養基。3、溶液或試劑：革蘭氏染色用盧氏碘液（Lugolsiodinesolution），甲基紅指示劑，40%KOH，5%-萘酚，乙醚，吲哚試劑等。4、儀器或其他用具：無菌平板，無菌試管，接種環，接種針，試管架。,三、實驗材料,.,83,1、細菌水解大分子物質試驗,淀粉水解試驗,培養基：淀粉培養基平板菌種：大腸桿菌和枯草芽孢桿菌方法：平板上劃“十”字接種注意：接種前在平板底部作記號；“十”字不要太大,油脂水解試驗,培養基：油脂培養基平板菌種：大腸桿菌和金黃色葡萄球菌方法：平板上劃折線接種注意：接種前在平板底部作記號,明膠液化試驗,培養基：試管明膠培養基菌種：大腸桿菌或產氣腸桿菌方法：穿刺接種注意：20培養,石蕊牛乳試驗,培養基：試管石蕊牛乳培養基（2支）菌種：粘乳產堿菌或銅綠假單胞菌方法：斜面劃線接種注意：觀察結構注意牛乳產酸、產堿、凝固、胨化現象是連續出現的。,四、實驗步驟,.,84,1、細菌水解大分子物質試驗2、糖發酵試驗,培養基：葡萄糖發酵培養基和乳糖發酵培養基（內裝杜氏小管）（各3支）菌種：大腸桿菌和產氣腸桿菌方法：分別接種于葡萄糖發酵培養基和乳糖發酵培養基,四、實驗步驟,.,85,1、細菌水解大分子物質試驗2、糖發酵試驗3、IMViC試驗,四、實驗步驟,86,.,IMViC試驗,.,87,1、不利用碘液，你怎樣證明淀粉水解的存在？2、假如某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發酵試驗應該出現什么結果？3、為什么大腸桿菌的甲基紅反應陽性，而產氣腸桿菌為陰性？這個試驗與伏普試驗最初底物與最終產物有何異同之處？4、說明在硫化氫試驗中醋酸鉛的作用，可以用哪種化合物代替醋酸鉛？,思考題,.,88,實驗九菌種的保藏,.,89,一、實驗目的,1.學習和掌握菌種保藏的基本原理;2.比較和掌握幾種不同菌種保藏的方法。,.,90,微生物個體微小、代謝活躍、生長繁殖快，如果保存不妥容易發生變異，被其他雜菌污染，甚至導致細胞死亡，因此，菌種的長期保藏對任何微生物學工作者都很重要，也是非常必要的。人為地創造低溫、缺氧、干燥、缺少營養物質等不良條件，抑制微生物的生長、繁殖，使其處于休眠狀態，從而可以較長時間保持菌種不死亡和不變異。,二、實驗的基本原理,.,91,幾種常用的保藏方法：1、傳代培養法保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養基（用于厭氧細菌）培養好后，置4C冰箱中存放，定期進行傳代培養、再存放。可用膠塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體石蠟來進一步延長保存期。2、載體法使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進行干燥。常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。,二、實驗的基本原理,.,92,3、懸液法將細菌、酵母菌細胞懸浮在一定的溶液中保存。溶液包括蒸餾水、糖溶液、磷酸緩沖液、食鹽水等。4、冷凍法使菌種始終存放在低溫環境下的保藏方法。包括低溫法和液氮法。此法關鍵是要克服細胞的冷凍損傷。注意控制降溫速率及保護劑的使用。5、真空干燥法這類方法包括冷凍真空干燥法和L干燥法。冷凍真空干燥法是將要保藏的微生物樣品先經低溫預凍，然后在低溫狀態下進行減壓干燥。L-干燥法則不需要低溫預凍樣品，只是使樣品維持在1020C范圍內進行真空干燥。,二、實驗的基本原理,.,93,試管，棉塞，研體，燒杯，pH試紙，干燥器，高壓滅菌鍋，干燥箱，培養箱，真空泵，接種針，超凈工作臺，酒精燈，火柴，凍存管，安瓿管，吸管。甘油，液體石蠟，干冰，培養基等。哈氏弧菌。,三、實驗材料,.,94,1、斜面保藏法將菌種轉接在適宜固體斜面培養基上，待其充分生長后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠塞效果更好），置4C冰箱中包藏。保藏時間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存24個月移種一次，酵母菌間隔兩個月，普通細菌一個月，假單胞菌兩周傳代一次。此法優點是操作簡單、使用方便，缺點是保藏時間短、易被污染。,四、實驗步驟,.,95,2、液體石蠟保藏法將無菌石蠟加在已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存。此法實用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏12年，普通細菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法按穿刺接種方式培養菌種，菌種長好后用膠塞封嚴，置4冰箱存放。,四、實驗步驟,.,96,4、砂土管保藏法（1）河砂處理取河砂若干加入鹽酸10%，加熱煮沸30min除去有機機質。倒去鹽酸溶液，用自來水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過篩，棄去粗顆粒，備用。（）土壤處理取非耕作層不含腐殖質的痩黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過篩，粗顆粒部分丟掉。(3)砂土混合處理妥當的河砂與土壤按3：1的比例摻合(或根據需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻后，裝入10 x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進行滅菌(通常采用間歇滅菌2-3次)，最后烘干。,四、實驗步驟,.,97,(4)無菌檢查每10支砂土管隨機抽1支，將砂土倒入肉湯培養基中，30培養40h，若發現有微生物生長，所有砂土管則需重新滅菌，再作無菌試驗，直至證明無菌后方可使用。(5)菌懸液的制備取生長健壯的新鮮斜面菌種，加入2-3ml無菌水(每18x180mm的試管斜面菌種)，用接種環輕輕將菌苔洗下，制成菌懸液。(6)分裝樣品每支砂土管(注明標記后)加入05ml菌懸液(剛剛使砂土潤濕為宜)，用接種針拌勻。(7)干燥將裝有菌懸液的砂土管放入干燥器內，干燥器底部盛有干燥劑。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口)。(8)保存置4冰箱或室溫干燥處，每隔一定的時間進行檢測。此法多用于產芽孢的細菌、產生孢子的霉菌和放線菌。在抗生素工業生產中應用廣泛、效果較好，可保存幾年時間，但對營養細胞效果不