.,基因工程的基本操作程序,.,基因工程的基本操作程序,1.目的基因的獲取2.基因表達載體的構建3.將目的基因導入受體細胞4.目的基因的檢測與鑒定,.,.,知識點一：1.原核細胞的基因結構,非編碼區,非編碼區,編碼區,編碼區上游,編碼區下游,與RNA聚合酶結合位點,啟動子,終止子,啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉錄終止。,RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結合位點并與其結合的一種蛋白質.(以模板轉錄然后脫落),.,不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質。,能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質,編碼區,非編碼區,原核細胞的基因結構,有調控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區上游的RNA聚合酶結合位點。,非編碼區,非編碼區,編碼區,編碼區上游,編碼區下游,啟動子,終止子,.,.,能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子,內含子：,外顯子：,知識點一：2.真核細胞的基因結構,.,真核細胞的基因結構,編碼區,非編碼區,外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列,有調控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區上游的RNA聚合酶結合位點等。,非編碼序列：,包括非編碼區和內含子,.,原核細胞與真核細胞的基因結構比較,思考,編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？,連續,不連續,編碼區,非編碼,.,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構建,3、將目的基因導入受體細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,知識點二.基因工程基本操作的四個步驟,.,.,一、獲取目的基因,1.獲取目的基因的途徑A.從自然界已有的物種中分離B.人工合成2.獲取目的基因的方法A.從基因文庫中獲取B.利用PCR技術擴增C.利用化學方法人工合成,目的基因主要是_,編碼蛋白質的結構基因,.,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,1.基因文庫：概念見P9,2.基因文庫的分類:按外源DNA片段的來源分類,種類,基因組DNA文庫：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫,3.基因文庫的目的,為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。,4.獲取目的基因的根據：,見課本P9,.,提取某種生物的全部DNA,用適當的限制酶切,一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,導入受體菌中儲存,基因組文庫,5.基因文庫的構建方法之一,（1）直接分離法(鳥槍法),cDNA合成過程,第一步，反轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。,5.基因文庫的構建方法之,基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較,.,概念：PCR全稱為_，是一項在生物_復制_的核酸合成技術,聚合酶鏈式反應,體外,特定DNA片段,2、利用PCR技術擴增目的基因,.,四種脫氧核苷酸(dNTP),一對引物：,熱穩定DNA聚合酶(Taq酶）,模板DNA(需含有目的基因),Mg2+(激活劑),條件：,緩沖溶液,一對寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物,前提：,利用PCR技術擴增目的基因,原理:DNA雙鏈復制前提:要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。,.,過程,高溫變性（解旋為單鏈）,低溫退火（引物與單鏈互補結合）,適溫延伸（在Taq酶的作用下合成與模板互補的DNA雙鏈）,重復循環,預變性（增加DNA變性的概率）,.,2、具體過程,.,PCR(多聚酶鏈式反應),概念：PCR全稱為_，是一項在生物_復制_的核酸合成技術,條件：_、_、_、_.等,原理：_,方式：以_方式擴增，即_（n為擴增循環的次數）,結果：,聚合酶鏈式反應,體外,特定DNA片段,DNA復制,四種脫氧核苷酸,一對引物,DNA聚合酶,指數,2n,使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）,過程：,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，形成_,b、退火（復性55-65）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,.,PCR技術擴增與DNA復制的比較,堿基互補配對,四種脫氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高溫下變性解旋,解旋酶催化,體外復制,細胞核內,熱穩定的DNA聚合酶,細胞內的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整個DNA分子,.,目的基因的mRNA,單鏈DNA(cDNA）,雙鏈DNA(即目的基因),反轉錄,合成,1）反轉錄法：以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,蛋白質的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結構基因的核苷酸序列,目的基因,推測,推測,化學合成,2）根據已知的氨基酸序列合成DNA法：,3、人工合成的目的基因,.,二、基因表達載體的構建基因工程的核心,1、目的：所需物質：,使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。,2、基因表達載體的組成：,復制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因,.,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來,載體與表達載體的區別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。,注意,三、將目的基因導入受體細胞-植物細胞,農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法,易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力,將目的基因導入受體細胞-動物細胞,顯微注射法,將目的基因導入受體細胞-微生物細胞,Ca2+處理使細胞處于一種能吸收周圍環境中的DNA-感受態細胞,四、目的基因的檢測與鑒定,檢測:是否插入目的基因（DNA分子雜交技術）是否轉錄（mRNA分子雜交技術）是否翻譯（抗原抗體雜交技術）鑒定:功能活性鑒定抗性鑒定,分別提取什么進行檢測,歸納步驟,.,DNA分子雜交示意圖,采用一定的技術手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。,歸納:基因工程的基本操作程序,獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學方法人工合成構建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因將目的基因導入受體細胞農桿菌轉化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉錄、翻譯,基因操作的基本步驟,基因操作的基本步驟,.,練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構建重組DNA分子所用的限制性內切酶作用于圖中的處，DNA連接酶作用于處。（填“a”或“b”）,a,a,.,練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用方法有農桿菌轉化法和法。（3）由導入目的基因的水稻細胞培養成植株需要利用技術，該技術的核心是和。（4）為了確定耐鹽轉基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的作探針進行分子雜交檢測，又要用方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。,基因槍法（花粉管通道法）,植物組織培養,脫分化和再分化,耐鹽基因,一定濃度鹽水澆灌,1）以下說法正確的是（）A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B、質粒是基因工程中唯一的運載體C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后代表現出來,C,練習,2）不屬于質粒被選為基因運載體的理由是A、能復制（）B、有多個限制酶切點C、具有標記基因D、它是環狀DNA,D,練習,3）有關基因工程的敘述中，錯誤的是（）A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來B、限制性內切酶用于目的基因的獲得C、目的基因須由運載體導入受體細胞D、人工合成目的基因不用限制