急性毒性試驗,急性毒性試驗(單次給藥毒性試驗)主要觀察對實驗動物一次給藥后所產生的毒性癥狀及其程度，出現和消失的時間，死亡的發生率并計算出其最大給藥量，最小致死量、半數致死量(LD50)等。由于中藥毒性常較小，單次給藥往往不能表現明顯的毒性作用，我國藥政部門把一日內多次給藥觀察受試藥物毒性的實驗也稱作急性毒性實驗。急性毒性試驗的目的是推測新藥對人的急性毒性的強弱。同時，它可以為長期毒性試驗、生殖毒性試驗、致突變試驗等試驗設計提供劑量選擇依據和有關毒性信息，還可以推測受試藥物毒性發生的速度和持續時間，與半數有效量(ED50)比較判斷新藥的安全系數。因此，急性毒性試驗對了解新藥的毒性是非常必要的。鑒于種種因素造成急性毒性試驗結果(癥狀和致死量)在不同實驗室內有較大的差異，且耗費大量動物而所取得的動物毒性的信息量相對較少，因此，各國目前都在修訂急性毒性試驗的技術要求，希望能利用盡可能少的動物數量而取得有價值的信息，同樣達到急性毒性試驗的目的。,第一節急性毒性試驗方法的有關問題一、動物(一)動物種動物種(或系)的差異是動物急性毒性差異的主要原因，藥酶則是毒性種差的重要原因之一。為推測新藥對人的急性毒性，某些發達國家動物急性毒性試驗要求包含非嚙齒類動物(除家兔外)在內的兩種動物，我國對此未作出明確規定。由于中藥已在臨床長期使用，一般認為，如尤特殊情況，使用一種動物已基本上達到急性毒性試驗的目的。目前雖常用的實驗動物是小鼠或大鼠。但在某些特殊情況下，例如受試物中已知含有強烈胃腸刺激物，就還應再采用非嚙齒類大動物進行實驗，否則，即使毒性較大(如巴豆)也并不能引起大、小鼠嘔吐反應。,(二)動物的年齡、性別、體重急性毒性受動物的健康狀態、年齡、性別、遺傳因素、體重、藥物的吸收、分布、代謝、排泄和內分泌激素等的影響。未成年的動物藥酶活性一般較低，對于經代謝后減毒的藥物表現毒性較強。而且，年幼動物藥物代謝功能和敏感度較易發生變化，性別間的特性也尚未確立，因此，口服毒性通常使用年輕的性成熟的動物，般小鼠68周齡，兩種性別，體重18-22g(同次試驗體重相差不超過2g)，大鼠68周齡，兩種性別，體重120150g(同次試驗體重相差不超過10g)。(三)動物數量視不同試驗而異。最小致死量或半數致死量，小動物(大鼠、小鼠)試驗組在三組以上，每組般至少10只動物(雌雄各半)。一些國家對動物數和組數不作規定，因此，有只用3只一組經多組試驗測得近似致死量或LD50者。大動物(犬、猴)并不定要求得到LD50，可用少量動物采用劑量遞增的方法觀察中毒癥狀，求近似致死量即可。最大給約量試驗般要求用小鼠或大鼠20只即可。,二、試驗準備實驗應在符合GLP的實驗室內進行，實驗樣品質量和穩定性應符合要求，與藥效學及臨床試驗一致。(一)樣品液的配制中藥材町用濃縮煎劑或浸膏，中藥制劑可用不含輔料的提取物加水或用o5羧基纖維素鈉，05吐溫80，5阿拉伯膠等混懸劑、增溶劑配成混懸液等，盡可能配成水溶液，水不溶性成分可用植物汕配成油溶、乳濁液。也有用乙醇、聚乙醇等溶劑配成樣品液者，但溶劑本身的急性毒性能干擾試驗結果，因此，急性毒性試驗報告中應對樣品液的配制方法加以詳細說明，必要時設溶劑對照組。(二)樣品液的濃度及給藥容量為了求得最低致死且或半數致死量，需要設不同劑量組，使部分組反應率在50以上，部分組反應率在50以下。不同劑量的設定有兩種方式，是濃度一定不同給藥容量，另種是容量一定不同給藥濃度，兩者各有所長。濃度一定適用于某些已經固定濃度的制劑，其有利之處是避免了滲透、粘度、溶質顆粒的分散狀態等理化性狀不致對毒性試驗結果的影響，因此，濃度一定也可得到較好的結果，但由于動物的投藥用量是有限的，范圍較窄，按體重給藥容量難以達到試驗要求。因此，通常采用同容量不同濃度的給藥方法，注射給藥藥液濃度應勺體液濃度等滲(至少不應低滲)，口服液不必作特殊考慮，對毒性低的中藥制劑而言，應以能保持一定流動性的最大濃度作為口服樣品液。,三、給藥方法(一)動物禁食動物購入后應在實驗室觀察1星期，口服給藥前，為減少吸收差異和大容量給藥造成胃急性擴張，小鼠和大鼠至少應停食4-6h，要求一夜停食(不停水)，投藥后再停食3-4h。(二)給藥途徑中藥新藥除臨床給藥途徑外，、二類新藥還希望其他給藥途徑，水溶性藥物應同時采用靜脈給藥途徑，其他如油劑，混懸劑之類可采用皮下給藥途徑。腹腔汁射在人體極少用，中藥粗制劑成分復雜，動物毒性試驗中也盡可能少用，以避免腹腔刺激性的干擾。各給藥途徑的容量一般為小鼠0405ml20g(體重)，大鼠lmll00g(體重)。小鼠口服最大容量不超過08ml20g(體重)，其他途徑不超過05ml20g(體重)。大鼠口服最大容量不超過2mll00g(體重)，其他途徑不超過lmll00g(體重)。,四、急毒試驗觀察指標和致死量的計算(一)觀察指標不能把求得致死劑量看作是急性毒性實驗的唯一要求。發現毒性癥狀及毒性反應的靶器官同樣是急毒實驗非常重要的目的。給藥前后應觀察體重、進食、進水的狀況，密切觀察異常毒性癥狀，特別是給藥后的一、二日。以后1日至少觀察1次，觀察7日觀察癥狀包括行動：不安定、多動、發聲；神經系統反應：舉尾、振顫、痙攣、運動失調、姿態異常；自主神經系統反應：眼球突出、流涎、流汨、排尿、下瀉、豎毛、皮膚變色、呼吸；死亡。應每日記錄體重、毒性反應和死亡情況，瀕死動物應單獨飼養，死后及時解削進行肉眼觀察和病理組織學觀察。試驗結束存活動物也進行解剖，如有病變進行組織學觀察。(二致死劑量計算可用Bliss點斜法、簡化機率法、改進寇氏序貫法等計算最小致死量或半數致死量。Bliss法嚴謹精確，缺點是計算非常繁復。但近代有計算機軟件，汁算方法可推薦Bliss法。各種方法原則基本相同，如：劑量劉數值應為等差，即劑量應按等比級數排列；各組動物數應相等；死亡率應在50上下基本對稱分布等。但各種方法還各有特殊設計要求，如有的要求Dm和Dn必須為100和0死亡率等，可參考有關專著，此處不贅述。如受試物毒性低，測不出LD50，可求得最大給藥量。,第二節急性毒性試驗方法一、LD50的測定最小致死量是使動物剛好致死的藥物劑量，但由于藥物的性質，給藥方法和個體差異，每只動物的最小致死量確很大的差異，實驗和統訓學原理表明一群動物最小致死量的平均值相當于半數致死量。半數致死量測定方法很多，但實驗沒計大同小異，所不同者為算方法的不同，其試驗方法如下：預試驗：目的是找出0及100估計致死量。更確田地說是找到個0死亡的最大劑量和100死亡的最小劑量的估值以決定實驗中采用的最大劑量(Dm)和最小劑量(Dn)，這在測定中非常重要，是實驗成敗的關鍵。可用雌或雄性動物，設四組以上，每組3-4只，先用1；10的劑量比給藥(如5mgkg、50mgkg、500mgkg、5000mgkg固定劑量)。觀察7日，記錄死亡動物數。然后在死亡數44和04兩組之間按1；2(如50mg/kg、100mg/kg、200mgkg、400mgkg)以下的劑量比進行重復試驗，以此測得近似的0和100死亡率。,正式試驗：在預試驗Dn和Dm劑量范圍內按等比設三個以上劑量組，其組間劑量的比值，一般在1；06至1：09范圍內。購入動物試驗前應馴化1星期，隨機或按體重分組，每組10只以上，雌雄各半，分別編號，給藥前應禁食(不禁水)過夜。各給藥組和溶劑對照組按體重給藥后，試驗當日應多次觀察，第二日至最后日應每日有二人以上同時觀察1次并及時詳細汜錄毒性反應癥狀，癥狀出現和消失的時間，死亡時間，第七日全部動物測量體重處死并剖檢，肉眼觀察病變情況。有毒性反應、體重減輕或臟器有病變的動物應在剖檢后立即進行主要臟器的病理組織學觀察。LD50和最小致死量及其可信限的汁算可采用Bliss法，改進寇氏法、點斜法、簡化概率單位法或其他的計算方法。汁算結果對比表明，不同的汁算方法，結果間一般無明顯差異，而不同實驗室對同一樣品試驗結果卻常見有顯著差異。岡此，采用較簡單的計算方法完全可以滿足LD50計算的準確性。,二、最大給藥量試驗如同受試藥物的濃度或體積限制，無法測出半數致死量(LD50)時，作最大給藥量試驗。試驗選用擬推薦臨床試驗的給藥途徑，以動物能耐受的最大濃度(溶液仍有較好的流動性)，最大體積的給藥量1次或1日內23次給予動物。以小鼠口服為例：動物數不得少于20只，雌雄各半，容量次不超過04ml/10g(體重)，多次給藥間隔時間不低于4h，觀察7日，汜錄毒性反應和體重變化。如仍未見毒性反應或體重正常增加，則可認為該藥物小鼠最大給藥量未見毒性反應，或LD50大于最大給藥量。經統計學計算，該劑量不可能大于LD14。如用10只動物未見毒性反應或死亡則該劑量不可能大于LD26。,三、近似致死量試驗國外近年來有采用少量動物進行近似致死量測定的方法。其中有的類似LD50的預試驗或霍恩氏法。每組用34只動物，設多組，詳細觀察并汜錄動物毒性反應井進行血液學，血液生化以及病理組織學觀察。有的采用劑量遞增法即只動物一個劑量以幾何級數遞增，根據前個劑量的反應，決定下個劑量。或采用劑量累積法，同一批動物間隔一定時間、劑量由小到大給藥，觀察毒性反應，同時結合血藥濃度的測定，確定動物的急性毒性反應、靶器官、中毒或致死劑量、毒性反應時的血藥濃度。劑量遞增法類似于LD50測定的階梯法(或稱序貫法、上下法)，適用小動物而且毒性反應出現快的試驗，1020只動物即可測定。劑量累積法則適用大動物，利用大約6只合格動物即可進行急性毒性試驗的全面觀察。另外，國外還有采用固定劑量給藥觀察近似致死劑量，以決定藥物毒性大小者。,四、急毒試驗結果評價(一)可靠性評價為保證急毒結果，實驗條件應符合GLP的要求，供試品質量穩定，動物合格，實驗方案，實驗原始記錄，標準操作規程，總結報告應符合要求。總結報告中應包括摘要、供試品、試驗動物，試驗環境、給藥方法、觀察方法、毒性反應癥狀、體重變化、病理組織學變化、雄性反應和死亡出現的時間、LD50和LD5及其可信限的計算方法、結果討論等。根據試驗結果對急性毒性進行全面評價。,(二)安全性評價(1)根據急性毒性試驗結果判斷供試藥物毒性的強弱、類型。國內尚無統規定。(2)急性毒性試驗結果對臨床研究有指導意義，可以為臨床研究時探索安全有效劑量避免出現急性不良反應提供依據。但是，鑒于人體與各種動物對各類化合物的吸收、分布、代謝、排泄以及各類型毒性反應的差異，尚無規律可循，現有化學藥品統計數據表明，在進行臨床研究時，仍應根據實驗結果參考文獻資料報道進行由低到高的安全治療劑量的探索。(3)急性毒性試驗結果對推測長期毒性試驗劑量具重要意義，、不同種動物之間的差異，急性毒性結果無論用體重劑量還是體表面積劑量計算常見有差異而尚無規律。如果急性毒性試驗與長期毒性試驗采用同種動物，則急性毒性試驗的劑量對長毒有更大的參考價伉。即使如此，還應考慮該藥的蓄積作用。不同種動物間雖然也可以進行劑量推測但僅可作為參考仍需要長期毒性試驗前進行必要的預試驗。,三、動物規格和數量長期毒性實驗一般由雌雄各半、健康無病、檢疫合格的動物組成。各組平均體重相似，體重變異不超過20。對照組動物數，可以與給藥組相同，也可按公式計算：對照組動物數：給藥組動物數x劑量組數的平方根。試驗周期3個月之內的，嚙齒類宜用68周齡的大鼠，每組數量不少于20只；非嚙齒類可用610月齡的犬，每組數量6只；試驗周期3個月以上的，嚙齒類宜用5、6周齡的大鼠，每組數量應增至30-40只。非嚙齒類可用4-6月齡的犬，每組數量6只。確定每組動物數的原則，主要考慮藥物毒性致實驗動物死亡數，實驗中處死動物的批次和實驗結束時及停藥后觀察恢復狀況所需能用于統計分析的動物數。,四、飼養條件(1)通風良好：動物飼養室的換氣次數和氣流速度能控制在1015次h和1318cms較好，目的是利于動物的散熱及排除臭氣、粉塵和微生物，又不明顯影響室內的溫、濕度和動物的耗能。(2)光照規律：因生物節律對動物的反應性有明顯的影響，光照會影響動物的生物節律從而影響不同批次之間的毒性對比。大鼠、小鼠應為12h明，12h暗；倉鼠應是14h明，l0h暗。(3)環境清潔：微生物或寄生蟲感染等，均叫能影響毒性試驗的結果。有條件者應盡可能選用清潔級、SPF級試驗設施。(4)溫、濕度適中且穩定：常溫動物在1533C下，體溫波動在1.5C以內。濕度是種潛熱，宜控制在3070。溫度、濕度的突然變化，體溫雖然變化不大，但并不意味著動物的生理狀況未受影響，同樣可以導致動物對外環境變化的抵抗力降低，影響毒性實驗結果。(5)室內噪聲最好在50dB以下：雌雄分養，不宜擁擠，必要時(如摻飼給藥或需精確測定飲食量時)單籠飼養，但要注意單養和群養的動物劉藥物的反應是有差異的。各劑量組和對照組的飼養條件應等同。室內飼養另種動物，或其他飼養條件的突然改變，均可引起實驗動物應激反應，從而影響毒性實驗結果。(6)食物應清潔，無霉變：食物中的脂肪、蛋白質、碳水化合物等營養成分要符合各種動物的生理需求目恒定，因有時營養成分對藥物的毒性也有很大的影響。飲水要潔凈，防止病源微生物、重金屬或其他有毒物質的污染。,長期毒性實驗,本書的長期毒性實驗與國際現行的反復給藥的毒性實驗概念是基本一致的，包含了過去“亞急性毒性實驗”、“亞慢性毒性實驗”、“慢性毒性實驗”及“終身毒性實驗”等稱謂。長期毒性實驗的主要目的有：是觀察藥物在選定時間內反復給予動物的情況下，動物出現損害的靶組織或器官及劑量效應關系和可逆性等；二是了解實驗動物對藥物能耐受的劑量范圍和對人來說可能無毒的安全劑量。組成長期毒性實驗的三個主要部分是實驗動物、受試藥物和觀察指標。長期毒性試驗贊時、費力，故必須根據新藥類別、受試物性質和用途、療程長短、急性毒性試驗和長期毒性預試驗結果等周密考慮，精心設計，以避免難以彌補的缺失。長期毒性試驗設計一般需要重點考慮以下幾個方面。,第一節實驗動物一、動物種類(1)我國對中藥三、四類新藥，處方中各味藥材均符合法定標準，無毒性藥材，無十八反、十九畏等配伍禁忌，又未經化學處理(水、乙醇粗提者除外)，難以測出LD50，而給藥量大于20g(生藥)kg(體重)，臨床用藥期為1星期以內者可免做長期毒性實驗。(2)符合上述條件，用藥1星期以上者及需反復應用的藥物，規定可只選用大鼠進行長期毒性實驗。(3)對一、二類新藥以及含有毒藥材、非法定標準藥材，或有十八反、十九畏等配伍禁忌的三、四類中藥新藥，我國及各國藥政部門普遍規定，長期毒性實驗應用嚙齒類和非嚙齒類二種動物進行。嚙齒類中，大鼠公認為首選動物，其次是小鼠、地鼠或豚鼠等；非嚙齒類中，常用的是犬，也可根據需要選用猴、貓、兔或小型豬等。,二、動物品系實驗應選用封閉群動物，如嚙齒類的Wistar或SpragueDewley品系大鼠，非嚙齒類的Beagle犬。既易得、易養、易于操作，又接近實際用藥人群的基因組成情況。除非有特殊目的，一般不用近親繁殖的動物。也有認為雜交第一代鼠兼有對藥物反應波動少和接近人群基因組成情況的優點而提倡選用的，尚未被普遍接受。由于不同國家、不同實驗室的動物經過長期傳代，其品系基因已發生了很大的變化，因此長期毒性實驗動物必須來源清楚，并有繁殖生產合格證號。,三、動物規格和數量長期毒性實驗一般由雌雄各半、健康無病、檢疫合格的動物組成。各組平均體重相似，體重變異不超過20。對照組動物數，可以與給藥組相同，也可按公式計算：對照組動物數：給藥組動物數x劑量組數的平方根。試驗周期3個月之內的，嚙齒類宜用68周齡的大鼠，每組數量不少于20只；非嚙齒類可用610月齡的犬，每組數量6只；試驗周期3個月以上的，嚙齒類宜用5、6周齡的大鼠，每組數量應增至30-40只。非嚙齒類可用4-6月齡的犬，每組數量6只。確定每組動物數的原則，主要考慮藥物毒性致實驗動物死亡數，實驗中處死動物的批次和實驗結束時及停藥后觀察恢復狀況所需能用于統計分析的動物數。,四、飼養條件(1)通風良好：動物飼養室的換氣次數和氣流速度能控制在1015次h和1318cms較好，目的是利于動物的散熱及排除臭氣、粉塵和微生物，又不明顯影響室內的溫、濕度和動物的耗能。(2)光照規律：因生物節律對動物的反應性有明顯的影響，光照會影響動物的生物節律從而影響不同批次之間的毒性對比。大鼠、小鼠應為12h明，12h暗；倉鼠應是14h明，l0h暗。(3)環境清潔：微生物或寄生蟲感染等，均叫能影響毒性試驗的結果。有條件者應盡可能選用清潔級、SPF級試驗設施。(4)溫、濕度適中且穩定：常溫動物在1533C下，體溫波動在1.5C以內。濕度是種潛熱，宜控制在3070。溫度、濕度的突然變化，體溫雖然變化不大，但并不意味著動物的生理狀況未受影響，同樣可以導致動物對外環境變化的抵抗力降低，影響毒性實驗結果。(5)室內噪聲最好在50dB以下：雌雄分養，不宜擁擠，必要時(如摻飼給藥或需精確測定飲食量時)單籠飼養，但要注意單養和群養的動物劉藥物的反應是有差異的。各劑量組和對照組的飼養條件應等同。室內飼養另種動物，或其他飼養條件的突然改變，均可引起實驗動物應激反應，從而影響毒性實驗結果。(6)食物應清潔，無霉變：食物中的脂肪、蛋白質、碳水化合物等營養成分要符合各種動物的生理需求目恒定，因有時營養成分對藥物的毒性也有很大的影響。飲水要潔凈，防止病源微生物、重金屬或其他有毒物質的污染。,第二節受試藥物一、藥物形式應與臨床試驗用制劑完全致(除可以不含賦形劑外)。三類以下的中藥新藥復方制劑，體積較大，以不含賦形劑如中藥浸膏作受試物為宜。固體制劑灌胃給藥，不溶于水的可制成餛懸液。混懸液要均勻，固體物先磨成80目以上的細粉，再加1左右的羧甲基纖維素鈉或10左右阿拉伯膠助懸，冰箱放置，臨用前搖勻，短期內用完，以免受試物活性下降。,二、給藥途徑和方法給藥途徑應盡量與臨床一致。口服藥物可灌胃或摻飼給藥。灌胃給藥有血藥高峰期：摻飼給藥血藥濃度波動較小，維持時間較長。靜脈注射或肌內注射給藥可以肌內注射或皮下注射。腹腔注射時大部分藥物依然是首先入肝，因此不能完全代替臨床注射給藥途徑。皮下注射，大鼠每l00g體重不超過1ml，小鼠為0103mll0g(體重)。肌內注射，大鼠每腿不超過05ml，小鼠每腿不超過03ml。注射給藥應嚴格消毒，并需經常變換注射點以減少對局部的刺激，還應考慮藥液的酸堿度和滲透壓。灌胃容積，大鼠一般每100g體重12ml，小鼠為01-0.3mll0g(體重)。犬等大動物常采用口服或摻飼給藥。從營養考慮摻飼藥量不宜超過攝食量的5。摻飼給藥(摻入飼料或飲水中給藥)應有保證攝入規定藥量的措施，還應有均勻混合、穩定性及質量檢杳等措施。對中藥復方制劑很難做到這點，必須摻飼，給藥時，采用現喂現摻的方法較好。長期毒性實驗的給藥量應根據動物體重的變化不斷調整，一般每期稱量體重并調整藥量1次。各劑量組應采用等容量不同濃度給藥。,三、給藥分組(1)應設3個或9個以上的劑量組。高劑量組應有少數動物出現嚴重毒性反應或死亡(不超過20)，低劑量組應相當或略高于藥效學試驗的有效劑而不出現毒性反應，中劑量組在高低劑量組之可以等比關系排列。中藥般毒性較低，體積較大。在即使最大限度提高劑量(技術上能投給的最高劑量)仍不能使動物中毒死亡的情況下，高劑量組應相當于臨床用量50倍以上，雖低不能低于臨床劑量的30倍(按千克體重計算)，且必須高于藥效學實驗的高劑量組。(2)如采用臨床試驗用制劑，對照組應給等容量的賦形劑，應注意有時賦形劑或溶劑的種類和用量會影響藥物的實驗結果。如采用不含賦形劑制劑，對照組可給等容量的水等溶劑。如賦形劑或溶劑可能產生毒性時，還需另設空白對照組。,四、給藥周期不應少于臨床療程的1倍。新藥審批辦法中藥藥理毒理研究的技術要求中規定：中藥三、四類新藥，處方中各味藥材均符合法定標準，無毒性藥材，無十八反、十九畏等配伍禁忌，又未經化學處理(水、乙醇粗提除外)，難以測出LD50而給藥量大于20g生藥kg(體重)，臨床用藥期為1早期以內者町免做長期毒性實驗。1星期以上者及需反復應用的藥物，可選用大鼠進行長期毒性實驗。對一、二類新藥以及含有毒藥材、非法定標準藥材或有十八反、十九畏等配伍禁忌的三、四類中藥新藥，長期毒性實驗應用嚙齒類和非嚙齒類兩種動物進行。給藥周期：嚙齒類一般不超過6個月，非嚙齒類不超過9個月。,第三節觀察指標一、檢測次數試驗周期在3個月以內的，末次給藥后24h，每組活殺部分動物(1223)，檢測各項指標，余下動物停藥繼續觀察24星期之后，同樣活殺全面檢測，以了解可能出現的遲緩性毒忭和毒性反應的可逆程度。試驗周期在3個月以上的，可增加在實驗中期活殺少量動物(如高劑量組和對照組)檢測各項指標。,二、檢查項目(一)一般檢查(1)長期毒性試驗的癥狀發生得快慢不。因此，在給藥開始l星期內須嚴密觀察，以后每日至少觀察一次行為活動、外觀體征、糞便性狀等。非嚙齒類動物還可以觀察劉刺激的反應等更高一層的行為變化。(2)體重，反映動物的生長和一般健康狀況，也是反映毒性的敏感指標，同時給約量的調也需根據體重的變化，因此至少每星期稱量記錄1次。(3)攝食量的測定應與體重變化同時測定。攝食量(g)體重增加(g)是說明體重變化原因的重要指標。(4)攝水量的測定有時是必要的。對可能影響飲水量、尿量的受試藥物，或摻入飲水紿藥時，應測定攝水量。(5)死亡，是中毒最明顯的表現，但須注意與自然死亡或意外死亡的區別應及時進行剖檢和記錄。對瀕死動物應立即處死，剖檢和進行血液學、血液生化及病理組織學檢查。,(二)實驗室檢查1血液學血常規(纖細胞和網織纖細胞計數、血紅蛋白含量、白細胞計數、白細胞分類、血小板計數)、出凝血時間等。反應骨髓造血功能，外周各類血細胞的受損或活動情況，凝血機制的影響程度等。2尿液尿量、尿常規(尿蛋白、尿糖、尿血紅蛋白等)檢查，反應腎臟功能、心臟和內分泌功能。3血液生化血液生化檢測反應動物體內各系統、各組織器官的功能狀態或受損情況。若能預測毒性作用的靶器官，可以有目的地選擇指標，否則原則上應盡可能多地進行檢測。嚙齒類受到血液量的限制，非吶齒類雖不受采血量限制，但實際上不可能無限制地選擇檢測項目，因此，般首先選擇下列指標以初步廠解受試藥物對機體的毒性概況，為較深入地研究受試藥物的毒性指明方向。,(1)丙氨酸氨基轉換酶：主要反應肝臟受損情況，其次為由心臟病變引起的肝臟淤膽或郁血。(2)總膽紅素：反應肝臟解毒功能和膽道排泄狀況或溶血等。(3)堿性磷酸酶(ALP)：增高反應骨骼受到影響或肝臟排泄受阻或甲狀旁腺功能亢進。(4)尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)：增高反應腎臟功能受損或蛋白質分解增強或脫水。(5)天冬氨酸氨基轉換酶：主要心臟受損情況。(6)總蛋白(TP)：用以求出球蛋白含量。(7)白蛋白：常見其濃度降低，反應肝臟合成功能或胃腸消化吸收受影響后的攝入不足或腎臟受損丟失過多。其濃度增高見于脫水及血液濃縮。(8)球蛋白：常見是其濃度增高，反應受到感染或機體免疫功能亢進。其濃度降低較少見，原因可能是丟失增多或體液免疫受損。(9)血糖(GLU)：增高或降低均上要與內分泌系統改變有關。(10)總膽固醇(TCHO)：增高見于代謝減退，脂類動員增加等。,(三)病理組織學檢查病理組織學檢查目的足了解受試藥物毒性引起的質性改變，是診斷毒性反應的重要指標。對給藥期間死亡動物、瀕臨死亡和計劃活殺動物都應進行病理組織學檢杳。正確肉眼觀察記錄的同時要保留相應的影像、照片等資料。常用方法和注意事項如下。(1)處死動物時，要考慮到組織器官免受損傷，也要考慮到動物免受痛苦和應激反應。常用的麻醉后頸動脈或腹主動脈放血的方法比較合理。(2)進行剖檢時，應觀察皮膚、口鼻、眼耳等外觀，再剝離皮膚觀察皮下組織，最后剪開腹腔、胸腔及顱腔觀察內腔組織器官及注射部位，包括組織器官的正常位置、形狀大小、顏色硬度及剖切面。取出的組織應放在頂先排定組織器官名稱扦盛有生理鹽水的容器中以防漏取及干燥。(3)取材原則上應盡量廣泛。考慮到中藥的特點，可根據急毒實驗發現有病變的器官組織和中藥藥性可能出現中毒的靶器官、靶組織具體確定。應包括心、肝、脾、肺、腎等重要的實質性器官組織。剖取的實質性臟器應稱重。(4)病理切片原則亦應盡量廣泛。在同一張片上盡量含有同一器官組織的不同層面。實際操作中可先對高劑量組動物及尸解發現異常器官進行重點切片檢查，在高劑量組發現有異常病變時再進行詳細檢查。,皮膚黏膜用藥的毒性試驗,皮膚黏膜用藥即局部用藥，包括皮膚用藥、直腸或陰道給藥、滴眼藥、滴鼻藥、滴耳劑、吸入劑及口腔咽喉用藥等。主要考察它們的局部毒性作用和局部用藥后引起的全身毒性作用。如果是局部用藥治療全身疾患的，還應參照全身用藥的規定做長期毒性試驗。三、四類外用藥治療局部疾患且方中不含毒性藥材或有毒成分的，般可不做長期毒性試驗，但需做局部刺激試驗、過敏試驗，必要時需做光敏試驗。有關皮膚黏膜用藥的毒性試驗分述如下。,第節皮膚黏膜用藥急性毒性試驗皮膚黏膜用藥急性毒性試驗目的是，觀察動物皮膚(完整皮膚和破損皮膚)或黏膜短時期(一般為單次，或中藥制劑毒性較低，24h內數次)接觸受試物，因吸收作用而使機體產生毒性反應。一、動物常用動物為成年健康的白色家兔、白色豚鼠、白色大鼠或白色小型豬，雌雄各半。嬰兒用藥用年輕的動物，如白色家兔(15kg左右)、白色豚鼠(o.2kg左右)。,二、試驗方法(一)皮膚準備動物給藥前24h背部脊柱兩側去毛(剪、剃，或適宜脫毛劑)，去毛面積約為體表面積的10(家兔約150cm2，豚鼠約40cm2，小型豬約300cm2)。去毛后24h檢杳去毛皮膚是否因去毛而受傷，受傷的皮膚不能作完好皮膚的毒性試驗。破損皮膚的制作采用不同方法將去毛消毒皮膚劃破(消毒手術刀作井字劃破或砂紙磨擦打毛)，以滲血為度。(二)黏膜給藥盡量模擬臨床的用藥途徑。保證受試物與黏膜接觸4h以上。需設賦形劑對照組。如賦形劑有毒性，應再設空白對照組。,(三)受試藥原則上盡量與臨床用制劑一致，并保證受試物與皮膚接觸良好。1劑量設置(1)如果受試物毒性較大預試驗時提高劑量可使大部分動物死亡，應按全身給藥的原則，沒置幾個劑量組(完整皮膚組和破損皮膚組備數個劑量組)。具體方法可參見本篇“急性毒性試驗”。動物宜采用大鼠或豚鼠。(2)如果受試物毒性較小，可只一個劑量組。每組家兔或豬4只，如用豚鼠需10只。并增加其他給藥途徑的最大給藥量試驗。,2給藥方法受試物如為膏劑或液體劑型，可直接涂抹于去毛皮膚；如是固體粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形劑(如羊毛脂、凡上林、橄欖油等)混合均勻，以保證受試物與皮膚接觸良好。藥物涂抹后應以適當的法固定，如用無刺激性紗布、膠布或有孔尼龍繃帶固定；豚鼠或大鼠可用剪去指套的乳膠手套包住整個背部和腹部；如受試物是液體，應先覆以聚乙烯薄膜，防止液體揮發。同時要注意防止試驗動物舔食受試物。黏膜用藥，如直腸或陰道或滴鼻或吸入用藥時，可將動物固定；口腔用藥時，可將藥物涂抹在下唇與齦之間(不能排除動物舔食受試物)；或提高受試物的黏稠度；或分次數用藥，目的是要保證受試物與黏膜接觸4h以上。有些毒性很小的外用制劑，也可用全身給藥途徑(如皮下注射等)反應其毒性。受試物劑量應以同面積不同濃度為宜。如采用其他方法，應說明理由。,3給藥周期皮膚黏膜用藥的急性毒性試驗時，受試物與皮膚或黏膜接觸不超過24h。根據中藥特點，可適當提高濃度或增加24h內用藥次數。給約24h后，用溫水或無刺激溶劑除去殘留受試物。三、觀察記錄與檢查除去受試物后每日觀察至第七日，記錄動物的體重、皮膚毛發、眼和黏膜的變化，中毒表現的觀察項與全身給藥的急性毒性實驗相同。若有死亡動物，應及時進行尸檢，有肉眼可見的病變應進行病理組織學檢查。,第二節皮膚黏膜用藥長期毒性試驗皮膚黏膜用藥急性毒性試驗目的是，觀察動物皮膚(完整皮膚和破損皮膚)或黏膜反復多次接觸受試物，因吸收作用而使機體產生的毒性反應。一、動物常用動物為成年健康的白色家兔(2kg左右)、白色豚鼠(03kg左右)、白色大鼠(02kg左右)或白色小型豬(7kg左右)，雌雄各半。嬰兒用藥應用更年輕的動物，如白色家兔(11kg左右)、白色豚鼠(02kg左右)。,二、實驗方法(一)皮膚準備皮膚長期毒性試驗和皮膚急性毒性試驗的皮膚準備相同。(二)受試藥物原則上盡量與臨床用制劑致，并保證受試物與皮膚接觸良好。1劑量設置皮膚黏膜用藥的長期毒性試驗，一般設高、低兩個劑量組和一個對照組。高劑量組應是使動物產生嚴重毒性反應或有少數動物死亡的劑量，低劑量組應相當或略高于藥效學有效劑量。具體方法可參見本篇“長期毒性試驗”。如急毒試驗濃度超過臨床用量20倍(經劑量轉換)而未出現毒性反應或死亡，叫只設一個相當臨床用量20倍以上的劑量組和一個對照組。每組家兔6只或小型豬4只，如用豚鼠需10只。,2給藥方法受試物如為膏劑或液體劑型，可直接涂抹于去毛皮膚上；固體粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形劑(如羊毛脂、凡士林、橄欖油等)混合均勻，以保證受試物與皮膚接觸良好，藥物涂抹后應以適當的力法固定，如用無刺激性紗布、膠布或有孔尼龍繃帶固定；豚鼠或大鼠可用剪去指套的乳膠手套包住整個背部和腹部；如受試物是液體，應先覆以聚乙烯薄膜，防液體揮發。同時要注意防試驗動物舔食受試物。黏膜用藥，如直腸或陰道或滴鼻或吸入用藥時，可將動物固定后進行；口腔用藥，可將藥物涂抹在下唇與齒齦之間(不能排除動物舔食受試物)；或提高受試物的黏稠度；或增加用藥次數。目的足要保證受試物與黏膜接觸4h以上。受試物劑量應以同面積不同濃度為宜。如采用其他方法，應說明理由。毒性很小的中藥外用制劑，也可用全身給藥途徑(如皮下注射等)反應具毒性。,3給藥周期皮膚黏膜用藥長期毒性試驗時，給藥時間不少于臨床用藥療程的兩倍，具體用藥周期可參照全身用藥的長期毒性試驗。每周給七次，每日1次，每次6h黏膜用藥至少4h)。三、觀察記錄與檢查皮膚黏膜用藥的長期毒性試驗，觀察項包括血液學，血液生化和病理學檢查均同全身給藥的長期毒性試驗，只是受試物涂抹的局部皮膚應列為檢查劉象。,第三節皮膚刺激試驗試驗目的足觀察動物皮膚接觸受試物后產生的刺激反應情況。分為1次給藥的皮膚刺激實驗和多次給藥的皮膚刺激試驗。一、動物選成年健康的白色家兔(2kg左右)，其次是白色豚鼠(03kg左右)。嬰兒用藥應用更年輕的動物，如白色家免15kg左右，白色豚鼠02kg左右。二、受試物應盡量與臨床用制劑致。粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形劑時，也應參考臨床使用方法，合理配制。,三、試驗方法至少用3只家兔或5只豚鼠。給藥前24h，動物背部去毛。分完整皮膚給藥區、破損皮膚給藥區、完整皮膚對照區、破損皮膚對照區4個區，每區均為體表面積的35，各區之間留有適當距離。破損皮膚制造方法、給藥和固定方法等同皮膚毒性試驗。給藥區涂抹受試物(固體)或1ml(液體)，對照區涂以等量賦形劑，二層紗布覆蓋，適當方法固定。一次給藥的皮膚刺激實驗，24h后以溫水或無刺激性溶劑洗去殘留受試物和賦形劑，觀察1h，24h、48h、72h涂抹部位的紅斑和水腫等反應。原發反應在12日內達到最劇，消退較快，多次給藥的皮膚刺激實驗，每日涂抹1次，連續1星期或以上。其他同1次給藥的皮膚刺激實驗。,第四節皮膚過敏性試驗皮膚過敏性試驗的目的足觀察在重復接觸受試物后，受試物作為致敏原引起的變態反應在皮膚上的表現。皮膚過敏性試驗可以分成兩大類，一類是使用佐劑(或稱免疫增強)的方法，一類是不用佐劑的方法。一、動物原則上選擇敏感性高的動物。一般用白色豚鼠，250300g(或13個月齡)，雌雄齊半。每組10只，或由是否會影響結果評價決定。二、陽性對照對苯二胺，1氯2，4二硝基苯、二鉻化鉀、璜胺新霉素、磺化鎳等。,三、受試物受試物如為膏劑或液體劑型，可直接涂抹于去毛皮膚；如是固體粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形劑(如羊毛脂、凡士林、橄欖等)混合均勻，以保證受試物與皮膚接觸良好。確定劑量應考慮受試物的溶解性等性質，局部、全身的耐受性等。必要時應能陳述所用劑量的理由。四、試驗方法給受試物(致敏或激發)前24h，動物頸背部兩側脫毛，側用于致敏涂敷，另側用激發涂敷。脈鼠去毛范圍約3cm3cm(或2cmx4cm)。試驗組動物背部側脫毛處涂敷受式物，陰性對照組動物背部脫毛處涂敷賦形劑，陽性對照組動物背部一側脫毛處涂敷1DNCB(或其他陽性對照藥)，均持續6h動物分籠飼養。14日后，在動物背部另一側，試驗組涂敷受試物，陰性對照組涂敷賦形劑，陽性對照組涂敷o1DNCB(或其他陽性對照藥)。6h后，去掉涂敷物，即刻觀察皮膚過敏反應情況，之后于24h、48h、72h再次觀察。以上是代表性步驟。測試皮膚過敏反應的還有其他方法，據報道認為福氏完全佐劑法的敏感忭略高。簡述如下：,(一)不用佐劑的方法l，Buehler試驗法包敷封閉式涂敷受試物致敏，2星期后包敷封閉式涂敷受試物激發。2，Dmize試驗法皮內注射受試物致敏，2星期后皮內注射受試物激發。3敞開式敷皮試驗法(openeplcutmeotest)按臨床擬用方法，反復涂敷受試物致敏。2星期后涂敷受試物激發。(二)使用佐劑的方法1佐刑貼敷試驗法頸背部脫毛區四角各皮內注射蒸餾水和福氏完全佐劑(1；1)乳化劑(油包水，WO)01ml。在注射部位用注射針呈井字擦傷皮膚，24h，將受試物(01mI或0.lg)涂敷破損皮膚上。步驟每日重復1次，連續3次。致敏第一日起計算，1星期后，皮內注削部位涂敷10月桂醇硫酸鈉的凡士林液。在同一部位包封式涂敷受試物(02ml或0，1g)致敏，保持48h。致敏結束2期后，在背部或側腹脫毛處，敞開式涂