.,1,第七章體液蛋白質(zhì)檢驗(yàn),人類(lèi)白蛋白分子,.,2,本章內(nèi)容概要：,第二節(jié)體液蛋白質(zhì)測(cè)定,第一節(jié)概述,.,3,1、掌握血漿蛋白質(zhì)的組成、功能及分類(lèi)；個(gè)別血漿蛋白質(zhì)（前白蛋白、白蛋白）的來(lái)源和生理功能；血清總蛋白和白蛋白的測(cè)定方法和原理。,2、熟悉急性時(shí)相反應(yīng)蛋白的概念和種類(lèi)；血清球蛋白和纖維蛋白原的測(cè)定方法。,3、了解其他蛋白質(zhì)的來(lái)源和生理功能；尿液蛋白和腦脊液蛋白的檢測(cè)。,本章教學(xué)要求：,.,4,第一節(jié)概述,.,一、血漿蛋白質(zhì)的分類(lèi)和功能,組成：,種類(lèi)：1000種500種200種含量：gmgg來(lái)源：肝臟是蛋白質(zhì)主要的加工廠,（一）血漿蛋白質(zhì)的組成、功能及分類(lèi),.,6,營(yíng)養(yǎng)作用，修補(bǔ)組織蛋白;維持血漿膠體滲透壓：主要是白蛋白；作為PH緩沖系統(tǒng)的一部分：酸性或堿性蛋白質(zhì)；運(yùn)輸作用：作為激素、維生素、脂類(lèi)、代謝產(chǎn)物、離子、藥物等的載體；體液免疫防御系統(tǒng)：作為免疫球蛋白與補(bǔ)體等免疫分子；催化作用：酶的本質(zhì)；代謝調(diào)控作用；作為底物，酶或中間產(chǎn)物抑制或激活組織蛋白酶；參與凝血與纖維蛋白溶解；：除因子外均可。,血漿蛋白質(zhì)的功能,.,7,血漿蛋白質(zhì)的分類(lèi),7,分離方法,鹽析法：白蛋白/球蛋白（pH7.0半飽和的硫酸銨溶液）,電泳法：,醋酸纖維素薄膜電泳：6種,瓊脂糖凝膠電泳：13種,聚丙烯酰胺凝膠電泳：30種,SDS聚丙烯酰胺凝膠等電雙向電泳：300種,分辨率增高,-,-,-,+,纖維蛋白原,醋酸纖維素薄膜,.,醋纖膜電泳或瓊脂糖電泳：5個(gè)成分清蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白分辨率高時(shí)：可有7個(gè)成分有1和22中也可有兩條聚丙烯酰胺凝膠電泳：可以分出30多種蛋白質(zhì),醋纖膜電泳或瓊脂糖電泳：5個(gè)成分,清蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白,2.電泳分類(lèi)法,是臨床實(shí)驗(yàn)室常用的血漿蛋白質(zhì)電泳方法,分辨率高時(shí)：可有7個(gè)成分有1和22中也可有兩條聚丙烯酰胺凝膠電泳：可以分出30多種蛋白質(zhì),.,9,3.功能分類(lèi)法,（1）運(yùn)輸載體類(lèi)血漿脂蛋白：包括CM、VLDL、LDL、HDL等前清蛋白與清蛋白甲狀腺素結(jié)合球蛋白皮質(zhì)素結(jié)合球蛋白類(lèi)固醇激素結(jié)合球蛋白視黃醛結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白觸珠蛋白血色素結(jié)合蛋白銅藍(lán)蛋白,.,（2）蛋白酶抑制物：包括1-抗胰蛋白酶、1-抗糜蛋白酶、2-巨球蛋白等6種以上（3）血清酶類(lèi)：血漿固有酶如LCAT等組織細(xì)胞少量釋放的細(xì)胞內(nèi)酶細(xì)胞破裂而進(jìn)入血循環(huán)的細(xì)胞內(nèi)酶（4）蛋白類(lèi)激素：胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)激素等（5）凝血蛋白類(lèi)（6）免疫球蛋白類(lèi)（7）補(bǔ)體蛋白類(lèi),（2）蛋白酶抑制物：包括1-抗胰蛋白酶、1-抗糜蛋白酶、2-巨球蛋白等6種以上（3）血清酶類(lèi)：血漿固有酶如LCAT等組織細(xì)胞少量釋放的細(xì)胞內(nèi)酶細(xì)胞破裂而進(jìn)入血循環(huán)的細(xì)胞內(nèi)酶（4）蛋白類(lèi)激素：胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)激素等（5）凝血蛋白類(lèi)（6）免疫球蛋白類(lèi)（7）補(bǔ)體蛋白類(lèi),還有許多種類(lèi)的蛋白質(zhì)未被認(rèn)識(shí),還有許多種類(lèi)的蛋白質(zhì)未被認(rèn)識(shí),2.功能分類(lèi)法,.,1.作為運(yùn)載蛋白2.組織蛋白酶抑制物3.在血漿中起催化作用的酶4.參與代謝調(diào)控作用的蛋白質(zhì)和肽類(lèi)激素5.參與凝血與纖維蛋白溶解6.組成體液免疫防御系統(tǒng)（Ig與補(bǔ)體）所有血漿蛋白質(zhì)能維持血漿膠體滲透壓組成血液pH緩沖系統(tǒng),（二）血漿蛋白質(zhì)的功能,生物化學(xué),.,12,急性時(shí)相反應(yīng)（acutephasereaction，APR）：血漿蛋白質(zhì)對(duì)急性炎癥和組織損傷的非特異性反應(yīng)。此時(shí)許多蛋白質(zhì)：如1-抗胰蛋白酶、1-酸性糖蛋白、結(jié)合珠蛋白、銅藍(lán)蛋白、C4、C3、纖維蛋白原和C-反應(yīng)蛋白等濃度顯著升高或升高，而少數(shù)蛋白質(zhì)如前清蛋白、清蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白則出現(xiàn)相應(yīng)下降。急性時(shí)相反應(yīng)蛋白(acutephasereactiveprotein，APP)：對(duì)急性炎癥和組織損傷起非特異反應(yīng)從而出現(xiàn)濃度變化的血漿蛋白質(zhì)。增加的蛋白質(zhì)稱(chēng)為正向APP下降的蛋白質(zhì)稱(chēng)為負(fù)向APP,1.急性時(shí)相反應(yīng),（三）影響血漿蛋白質(zhì)濃度的因素,.,13,機(jī)體哪些情況會(huì)出現(xiàn)急性時(shí)相反應(yīng)？急性細(xì)菌性感染如急性肺炎、鏈球菌感染性腎炎急性非特異性炎癥如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性心臟病等急性心肌梗死惡性腫瘤手術(shù)、創(chuàng)傷,.,14,APR的機(jī)制,炎癥損傷部位釋放的細(xì)胞因子，包括白介素、腫瘤壞死因子和、干擾素以及血小板活化因子等，引發(fā)肝細(xì)胞中上述蛋白質(zhì)合成量的改變。正向APP是機(jī)體防御機(jī)制的一個(gè)部分，如：增加的蛋白酶抑制劑控制組織中的酶活性觸珠蛋白保護(hù)從破壞紅細(xì)胞中釋放的HbC反應(yīng)蛋白等可活化補(bǔ)體負(fù)向APP多作為營(yíng)養(yǎng)蛋白，此時(shí)合成減少，可為合成正向APPs提供更多的氨基酸原料。,.,15,APR的時(shí)相,C-反應(yīng)蛋白：首先升高1-酸性糖蛋白：12小時(shí)內(nèi)也升高1-抗胰蛋白酶、觸珠蛋白、C4和纖維蛋白原然后升高C3和銅藍(lán)蛋白：最后是升高通常在25天內(nèi)這些APPs達(dá)到最高值,.,16,測(cè)定APP的臨床意義,幫助監(jiān)測(cè)炎癥的發(fā)生、變化和觀察治療反應(yīng)，尤其是那些升高最早和最多的蛋白質(zhì),.,30,二、血清蛋白質(zhì)電泳組分的臨床分析,血漿蛋白質(zhì)和血清蛋白質(zhì)有何不同？血漿：為生理狀況血清：為常用檢測(cè)標(biāo)本,血漿蛋白質(zhì)和血清蛋白質(zhì)有何不同？血漿：為生理狀況血清：為常用檢測(cè)標(biāo)本,.,31,（一）血清蛋白質(zhì)電泳的正常組分及其含量,清蛋白：57681球蛋白：1.05.72球蛋白：4.911.2球蛋白：713球蛋白：9.818.2,醋纖膜電泳正常百分含量清蛋白：57681球蛋白：1.05.72球蛋白：4.911.2球蛋白：713球蛋白：9.818.2,醋纖膜或瓊脂糖電泳正常區(qū)帶,區(qū)帶圖譜,掃描圖譜,kk,.,.,.,1.腎病綜合征,2.肝硬化,正常圖譜,典型的-橋,不典型-橋,IgG型,IgA型,3.多發(fā)性骨髓瘤,2,典型的異常電泳圖譜及其掃描曲線,.,22,（四）球蛋白增多與M蛋白,Ig多克隆性增多：區(qū)帶呈彌散性升高見(jiàn)于反復(fù)或慢性感染、自身免疫性疾病、肝細(xì)胞疾病或寄生蟲(chóng)感染。Ig單克隆性增多M蛋白：區(qū)帶局部有深染窄帶漿細(xì)胞病、尤其惡性漿細(xì)胞病時(shí)，異常漿細(xì)胞單克隆增殖，產(chǎn)生大量單克隆Ig或輕鏈或重鏈片段，病人血清或尿液中可出現(xiàn)結(jié)構(gòu)單一的M蛋白,Ig多克隆性增多：區(qū)帶呈彌散性升高見(jiàn)于反復(fù)或慢性感染、自身免疫性疾病、肝細(xì)胞疾病或寄生蟲(chóng)感染。Ig單克隆性增多M蛋白：區(qū)帶局部有深染窄帶漿細(xì)胞病、尤其惡性漿細(xì)胞病時(shí)，異常漿細(xì)胞單克隆增殖，產(chǎn)生大量單克隆Ig或輕鏈或重鏈片段，病人血清或尿液中可出現(xiàn)結(jié)構(gòu)單一的M蛋白,.,23,二、血漿蛋白質(zhì),（一）前白蛋白（PA）（二）白蛋白（ALB）（三）1-酸性糖蛋白（AAG）（四）甲胎蛋白(AFP)（五）結(jié)合珠蛋白(Hp)（六）2-巨球蛋白(AMG)（七）銅藍(lán)蛋白(CER/CP)（八）轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)（九）2微球蛋白(BMG)（十）C-反應(yīng)蛋白質(zhì)(CRP),.,24,結(jié)構(gòu)：MW=54000，四個(gè)相同亞基構(gòu)成的四聚體。理化性質(zhì)：p4.7，肝細(xì)胞合成，半壽期12小時(shí)。測(cè)定方法：免疫比濁法免疫擴(kuò)散技術(shù)。,.,25,功能：營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)，載體功能（甲狀腺素維生素）。臨床意義：1.作為營(yíng)養(yǎng)不良的早期指標(biāo)；2.作為肝功能不全的指標(biāo)，比Alb更靈敏；3.負(fù)性急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，急性炎癥，惡性腫瘤，肝硬化及腎炎等情況下，PA迅速降低。參考值：0.180.45g/L。,.,26,急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,.,27,.,28,.,29,結(jié)構(gòu)：585個(gè)aa殘基構(gòu)成的單鏈多肽，MW=66458，含17個(gè)二硫鍵。理化性質(zhì)：pI=45.8，肝細(xì)胞合成但不儲(chǔ)存，半衰期為15-19天，占總蛋白的40%60%，p7.4時(shí)帶負(fù)電。測(cè)定方法：色素結(jié)合法:溴甲酚綠（BCG），溴甲酚紫（BCP）,鹽析等。,（二）白蛋白（ALB）急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,.,30,功能：營(yíng)養(yǎng)作用，載體功能（高親和力），維持血漿滲透壓和正常p值。臨床意義：合成受食物影響，敏感性較低。降低:在營(yíng)養(yǎng)不良，肝功不全，急慢性肝疾病時(shí);增高:少見(jiàn),假性升高。參考值：35-50g/,.,31,功能：蛋白酶抑制物（具有90的抑制蛋白酶活力）。如糜蛋白酶，彈性蛋白酶，但此抑制作用有明顯的p依賴(lài)性。臨床意義：降低：血漿AAT僅見(jiàn)于胎兒呼吸迫綜合癥。升高：炎癥、術(shù)后，某些激素治療后。參考值：0.831.99g/L,.,32,結(jié)構(gòu)：181個(gè)aa殘基構(gòu)成的單鏈多肽，MW=4萬(wàn)，含45%的糖，其中唾液酸占11%12%。理化性質(zhì)：pI值2.73.5，肝合成，膿毒癥時(shí)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞及某些腫瘤組織也可合成。位于1-球蛋白區(qū)帶。測(cè)定方法：免疫化學(xué)法（擴(kuò)散,濁度）,化學(xué)法（間接法），ELISA法等,（三）1-酸性糖蛋白（AAG）急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,.,33,功能：與免疫防御功能有關(guān)，機(jī)制不詳；抑制血小板凝集影響膠原纖維形成；參與脂類(lèi)運(yùn)輸。臨床意義：升高：急性炎癥，組織損傷，風(fēng)濕，腫瘤，AMI，潰結(jié)時(shí)；降低：營(yíng)養(yǎng)不良降低,嚴(yán)重肝損傷和雌激素作用。參考值：.252.0g/L。,.,34,結(jié)構(gòu)：590個(gè)aa殘基構(gòu)成的單鏈多肽，MW=6.5萬(wàn)萬(wàn)，含4%的糖。理化性質(zhì)：pI值.7-.8，在白蛋白和1-球蛋白之間。胎兒肝卵黃囊合成，成人量微，升高由于腫瘤細(xì)胞合成。測(cè)定方法：免疫化學(xué)法（擴(kuò)散,火箭電泳）,ELISA等,（四）甲胎蛋白(AFP),.,35,功能：胎兒血漿主要蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞生長(zhǎng)和腦細(xì)胞發(fā)育；抑制細(xì)胞和體液的免疫反應(yīng)；維持正常妊娠，防止母嬰排斥。臨床意義：胎兒產(chǎn)前監(jiān)測(cè)（羊水或母血）增高：原發(fā)性肝癌患者診斷和鑒別（80%原發(fā)增高），其他癌癥也可見(jiàn)增高。參考值：20-100g/L(成人)5g/L(新生兒),.,36,結(jié)構(gòu)：兩對(duì)肽鏈形成四聚體，有變異體。理化性質(zhì)：肝合成，pI值為4.1，電泳位a2-球蛋白區(qū)帶測(cè)定方法：電泳法，免疫化學(xué)法（擴(kuò)散,濁度）,化學(xué)法等,（五）結(jié)合珠蛋白(Hp)急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,.,37,功能：與紅細(xì)胞中釋出自由Hb結(jié)合,防止Hb從尿中丟失保存鐵,急性溶血后一周再生恢復(fù)。高效的過(guò)氧化物酶。需鐵細(xì)菌的天然抑菌劑。臨床意義：升高：急性時(shí)相反應(yīng)；降低：血管內(nèi)溶血時(shí)；雌激素作用。參考值：0.5-2.2g/L,.,38,結(jié)構(gòu)：MW=6280萬(wàn),分子量最大，由四個(gè)相同的亞基組成，含糖量約。理化性質(zhì)：肝細(xì)胞與單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中合成，半壽期5天。測(cè)定方法：免疫化學(xué)等,（六）2-巨球蛋白(AMG),不屬于急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,.,39,功能：與多種分子和離子結(jié)合，影響蛋白水解酶活性（主要的蛋白酶抑制劑具有選擇性保護(hù)某些酶的作用）。臨床意義：嬰幼兒及兒童比成人高；升高：雌激素，低蛋白血癥尤其是腎病綜合征時(shí)，可顯著升高以維持血漿膠體滲透壓；降低：胰腺炎及前列腺癌時(shí)。參考值：1.31-2.93g/L,.,40,結(jié)構(gòu)：MW=12-16萬(wàn),1046個(gè)aa殘基構(gòu)成的單鏈多肽，含糖約，每分子銅藍(lán)蛋白可結(jié)合個(gè)銅原子。理化性質(zhì)：肝合成,巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞合成少量；pI值為4.4，具遺傳基因多態(tài)性。測(cè)定方法：免疫化學(xué)（擴(kuò)散或比濁）等,（七）銅藍(lán)蛋白(CER/CP)急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,.,41,功能：具氧化酶活性且起抗氧化劑作用，銅的無(wú)毒代謝庫(kù)臨床意義：增加感染,創(chuàng)傷,腫瘤;降低-營(yíng)養(yǎng)不良，嚴(yán)重肝病及腎綜;協(xié)助診斷Wilson病（肝豆?fàn)詈俗冃裕﹨⒖贾担?.21-0.53g/L,.,42,結(jié)構(gòu)：MW=7.7萬(wàn),單鏈糖蛋白，含糖約。理化性質(zhì)：肝細(xì)胞合成，pI值為5.5-5.9,半壽期7天，可逆結(jié)合多價(jià)離子如Fe、Cu、Zn、Co等，一分子TRF可結(jié)合兩個(gè)三價(jià)鐵。測(cè)定方法：免疫擴(kuò)散法，放免法和免疫比濁法等。,（八）轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF/Tf)急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,.,43,功能：運(yùn)輸鐵。臨床意義：血TRF濃度受鐵供應(yīng)調(diào)節(jié)，缺鐵TRF升高，鐵治療后恢復(fù)。可用于貧血的診斷（缺鐵性低色素性貧血TRF升高，再障時(shí)TRF正常或者降低）和對(duì)治療的監(jiān)測(cè)。降低:急性時(shí)相反應(yīng)、慢性肝病、營(yíng)養(yǎng)不良及蛋白丟失時(shí)；升高：妊娠或雌激素會(huì)使其降低;缺鐵性低色素貧血。參考值：2.5-4.3g/L(成人)1.30-2.75g/L(新生兒),.,44,結(jié)構(gòu)：MW=11800，100個(gè)aa殘基構(gòu)成的單鏈多肽，分子中含一對(duì)二硫鍵，不含糖。理化性質(zhì)：pI值為5.7，淋巴細(xì)胞合成，存在細(xì)胞表面，特別是淋巴和腫瘤細(xì)胞。釋放入血循環(huán)。半衰期107分鐘，幾乎由腎小管回收。測(cè)定方法：放射免疫化學(xué)等。,（九）2微球蛋白(BMG),.,45,功能：分子量小，可自由通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)膜，在腎小管幾乎全部重吸收，可監(jiān)測(cè)腎小管功能；是HLA（人類(lèi)白細(xì)胞抗原）鏈的輕鏈部分。臨床意義：增高：腎功能衰竭，炎癥及腫瘤時(shí)。參考值：1.02.5mg/L（血漿）,.,性質(zhì)：因在急性炎癥病人血清中出現(xiàn)，可結(jié)合肺炎球菌細(xì)胞壁C-多糖的蛋白質(zhì)而命名。結(jié)構(gòu)：MW11.5-14萬(wàn)，分子含個(gè)相同的亞基，亞基間靠非共價(jià)鍵連接成圓盤(pán)狀多聚體。理化性質(zhì)：肝合成，pI值為6.2，電泳位于區(qū)帶。測(cè)定方法：半定量沉淀法（早），免疫化學(xué)法。,（十）C-反應(yīng)蛋白質(zhì)(CRP)急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,.,47,功能：結(jié)合多糖，磷脂和核酸；激活補(bǔ)體，抗凝。臨床意義：第一個(gè)認(rèn)定的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,是急性時(shí)相反應(yīng)的一個(gè)敏感指標(biāo)，在、創(chuàng)傷、感染、外科手術(shù)、腫瘤浸潤(rùn)時(shí)含量迅速升高，達(dá)到正常的2000倍。CRP是非特異性指標(biāo)，需結(jié)合臨床病史。參考值：8.0mg/L（血漿）,.,48,急性時(shí)相反應(yīng)蛋白分類(lèi)：,升高：其他種蛋白質(zhì)。,降低：前白蛋白、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白,.,49,第二節(jié)體液蛋白質(zhì)測(cè)定,總蛋白測(cè)定,個(gè)別蛋白質(zhì)的測(cè)定,蛋白分離測(cè)定技術(shù),發(fā)展趨勢(shì):,測(cè)定體液標(biāo)本:,血漿：普遍,尿液，腦脊液和胸腹水等：有選擇性的組織病變檢查,.,50,免疫化學(xué)法特異定量個(gè)別蛋白質(zhì),體液蛋白質(zhì)的測(cè)定方法概括：,常規(guī)：免疫濁度法、免疫擴(kuò)散法，免疫電泳法，微量：放射免疫測(cè)定（RIA），酶免疫測(cè)定法（ELA/ELISA）,.,51,電泳測(cè)定：,定量化學(xué)測(cè)定TPr，Alb,電泳組成圖譜半定量定量,染料結(jié)合法，UV法，折光法等,.,52,一、血清總蛋白測(cè)定,假設(shè)：,、純多肽鏈，含氮量平均為16%、各種蛋白質(zhì)與化學(xué)試劑反應(yīng)性一致，僅為相對(duì)定量,.,53,測(cè)定依據(jù)：蛋白質(zhì)測(cè)定一般利用蛋白質(zhì)以下的結(jié)構(gòu)或性質(zhì),1、元素組成測(cè)定：含N穩(wěn)定；2、重復(fù)的肽鏈結(jié)構(gòu)：具有多個(gè)肽鍵；3、酪氨酸和色氨酸與Folin-酚試劑反應(yīng)顯色或UV吸收；4、與色素結(jié)合的能力：與染料以離子鍵或共價(jià)鍵連接；5、沉淀后借濁度測(cè)定：光度計(jì)測(cè)定；6、光折射測(cè)定：折射儀測(cè)定。,.,54,方法：,1.凱氏定氮法參考方法2.雙縮脲法(推薦)3.酚試劑法4.散射比濁法5.染料結(jié)合法6.UV法.折光測(cè)定法,.,55,1.凱氏定氮法參考標(biāo)準(zhǔn)方法(0.05mgN0.3gpro),消化用濃硫酸將蛋白質(zhì)消化為硫酸銨；（耗時(shí)）蒸餾用堿性溶液堿化消化液并蒸餾揮發(fā)；吸收用酸性溶液（硼酸）吸收氣態(tài)氨（使H+）滴定用已標(biāo)定的無(wú)機(jī)酸滴（使H+恢復(fù)），計(jì)算總氮量定蛋白（總氮量-非蛋白氮）6.25=蛋白含量,納氏試劑：碘化汞和碘化鉀的堿性溶液與氨反應(yīng)生成淡黃棕色膠態(tài)化合物，其色度與氨氮含量成正比。,原理：,.,56,評(píng)價(jià)：,優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確度高，精密度高，靈敏度高，是公認(rèn)的參考方法。缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，不適合常規(guī)檢測(cè)，血清各蛋白含氮量會(huì)有所變化尤其是疾病時(shí)。,應(yīng)用：標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)定及校正其它常規(guī)方法,.,57,2.雙縮脲法,原理：,蛋白質(zhì)中的肽鍵（-CONH-）在堿性溶液中能與Cu2+作用而產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)。,條件：至少含兩個(gè)肽鍵（-CONH-）基團(tuán)才能和Cu2+形成絡(luò)合物,氨基酸及二肽無(wú)反應(yīng),三肽以上才能反應(yīng)。,雙縮脲生成,.,58,評(píng)價(jià)：,優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，10g-120g/L線性好，特異性與精密度好，批內(nèi)CV%2%，顯色穩(wěn)定。缺點(diǎn)：靈敏度較差，對(duì)蛋白質(zhì)含量低的體液標(biāo)本不適合。,應(yīng)用：常規(guī)推薦方法。手工或上機(jī)使用。,.,59,3.酚試劑法,原理：,蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基和色氨酸殘基能夠和酚試劑中的磷鎢酸-磷鉬酸反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，,Lowry改良法：在酚試劑中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的靈敏度，為雙縮脲法的100倍左右。,.,60,評(píng)價(jià)及應(yīng)用：,優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，改良法靈敏度高（10g-60g），適合測(cè)定蛋白含量少的標(biāo)本。缺點(diǎn)：各種蛋白質(zhì)酪氨酸和色氨酸比例不同，只適合測(cè)定單一蛋白質(zhì)。受一些藥物干擾。,.,61,4.比濁法,原理：,評(píng)價(jià)及應(yīng)用：,優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便不需特殊儀器。缺點(diǎn)：濁度形成的干擾因素多（加試劑方法，反應(yīng)溫度，蛋白絮狀沉淀等）,某些酸類(lèi)（磺基水楊酸等）和血清蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生沉淀，測(cè)其濁度，與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比，可求蛋白含量。,.,62,5.染料結(jié)合法,在酸性環(huán)境下，帶正電的蛋白質(zhì)（-NH3+)與染料的陰離子產(chǎn)生顏色反應(yīng)，使染料的吸收峰改變，可既而用分光光度法比色測(cè)定。,原理：,常用染料：氨基黑，考馬斯亮藍(lán)等,評(píng)價(jià)及應(yīng)用：,優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，靈敏度高，且干擾因素少。缺點(diǎn)：特異性不高；不同蛋白質(zhì)和染料的結(jié)合力不一致，標(biāo)準(zhǔn)物不易確定。,.,63,6.紫外分光光度法,蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白質(zhì)溶液在280nm處有一吸收峰。可用于測(cè)定蛋白質(zhì)但需避免核酸干擾。（1）Lowry-Kalcker公式蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260（2）Warburg-Christian公式蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260,原理：,.,64,評(píng)價(jià)及應(yīng)用：,優(yōu)點(diǎn)：敏感而簡(jiǎn)便，可保留蛋白生物活性，常用與較純的酶和免疫球蛋白。需紫外分光光度計(jì)及石英比色皿。缺點(diǎn)：各種蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm測(cè)定易受游離色aa和酪aa以及尿酸和膽紅素的干擾；導(dǎo)致準(zhǔn)確性和特異性受影響。措施：在220-225nm波長(zhǎng)區(qū)域，用0.15mol/l的NaCl稀釋1000-2000倍可消除干擾。,.,65,7.折光測(cè)定法,溶解在溶液中的固體可增加溶液的光折射率，在固定波長(zhǎng)和溫度下，光折射率和血清中蛋白質(zhì)含量成正比。,原理：,評(píng)價(jià)及應(yīng)用：,優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速，易掌握，重復(fù)性較好，適合臨床急診，體檢篩查和胸腹水蛋白質(zhì)測(cè)定。缺點(diǎn)：準(zhǔn)確性較差，易受高血脂癥，高膽紅素血癥以及溶血等因素影響，會(huì)由于A/G比值變化而產(chǎn)生誤差。,.,66,參考范圍：成人6080g/L,臨床意義：,總蛋白升高：,總蛋白降低：丟失過(guò)多消耗增加白蛋白合成減少水腫,真性升高：MM、巨球蛋白血癥、自身免疫性疾病等,假性升高：機(jī)體明顯失水，總蛋白含量相對(duì)升高，A/G幾乎不變,.,67,二、血清白蛋白測(cè)定,方法：,1.染料結(jié)合法(推薦)2.鹽析法3.電泳法4.免疫化學(xué)法,.,68,1.染料結(jié)合法(推薦),原理:血清ALB可通過(guò)離子鍵或疏水鍵與包括染料在內(nèi)的各種有機(jī)離子結(jié)合,而GLB很少結(jié)合外源性染料,可在不分離ALB與GLB的情況下直接測(cè)定ALB。,染料,BCG,BCP,優(yōu)點(diǎn),缺點(diǎn),易于和非人源性白蛋白結(jié)合與白蛋白結(jié)合特異性較差,與非人源性白蛋白結(jié)合力弱與白蛋白結(jié)合特異性好,在30秒內(nèi)測(cè)可提高特異性,.,69,應(yīng)用及評(píng)價(jià):,嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間的BCG法既適合手工也適合自動(dòng)化分析。臨床上推薦使用。,.,70,原理:鹽析是由于加入大量的中性鹽破壞了蛋白質(zhì)的水化膜、中和其所帶的電荷從而使蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀析出。各種蛋白質(zhì)的親水性和帶電荷不同，故鹽析時(shí)所需鹽濃度與pH不同。GLB在生理pH下帶電荷及水化膜比ALB少，可被較低濃度中性鹽沉淀。,2.鹽析法,中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉等,.,71,應(yīng)用及評(píng)價(jià):,操作繁瑣，不宜自動(dòng)化，基本不用,.,72,3.電泳法,操作：,醋纖膜電泳,染色,晾干,透明,光密度儀掃描,洗脫,比色,染色,分離,測(cè)得蛋白組分百分比,計(jì)算得出各種蛋白質(zhì)含量,半定量,定量,.,73,評(píng)價(jià)及應(yīng)用：,優(yōu)點(diǎn)：電泳特異性好，可了解血清蛋白質(zhì)全貌,缺點(diǎn)：電泳技術(shù)繁瑣，不易自動(dòng)化；白蛋白與染料親和力高會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏高,.,74,4.免疫化學(xué)法,原理及特點(diǎn):,應(yīng)用：特異性高,但成本較高,費(fèi)時(shí),生化檢驗(yàn)用的不多.,.,75,參考范圍:成人3555g/L.,臨床意義：,白蛋白升高：,白蛋白降低：丟失過(guò)多消耗增加白蛋白合成減少水腫先天性ALB缺乏病,真性升高：未見(jiàn),假性升高：機(jī)體明顯失水，或治療輸入過(guò)多白蛋白,.,76,三、血清球蛋白測(cè)定,方法：,間接法:TP-ALB=GLB,直接法:乙醛酸比色法(GLB中的色氨酸遠(yuǎn)大于ALB中的色氨酸含量),色氨酸+乙醛酸紫色化合物,H+,Hopkins-Cole反應(yīng):,參考范圍:成人2030g/L.A/G：1.52.5A/G1,比例倒置，清蛋白降低亦可因球蛋白增高引起，見(jiàn)于嚴(yán)重肝功能損傷及M蛋白血癥，如慢性重度以上持續(xù)性肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥等。,.,77,臨床意義：,球蛋白升高：,球蛋白降低：合成減少、低或無(wú)-球蛋白血癥,真性升高（常見(jiàn)）：自身免疫性疾病、感染反應(yīng)、MM、巨球蛋白血癥。,假性升高（少見(jiàn)）：機(jī)體明顯失水。,.,78,四、血漿纖維蛋白原測(cè)定,血漿纖維蛋白原：,結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：凝血因子，肝合成，MW=3.4萬(wàn)，大分子糖蛋白，pI5.3，22