生物素-親合素放大技術(shù),第二節(jié)親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標(biāo)記一、理化特性二、親合素（或鏈酶親合素）的標(biāo)記,第一節(jié)生物素的理化性質(zhì)與標(biāo)記一、活化生物素二、活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì),第三節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的特點(diǎn)一、靈敏度二、特異性三、穩(wěn)定性四、適用性五、其他,思考題小結(jié),第四節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用一、生物素-親合素系統(tǒng)基本類型及原理二、生物素-親合素系統(tǒng)在酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用三、生物素-親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用四、生物素-親合素系統(tǒng)在放射免疫測(cè)定中的應(yīng)用五、生物素-親合素系統(tǒng)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用,生物素（biotin）、親和素（avidin）是一對(duì)具有高度親和力的物質(zhì)，結(jié)合迅速、專一、穩(wěn)定并具有多級(jí)放大效應(yīng)。,生物素（維生素H）動(dòng)、植物組織中廣泛分布,卵黃和肝含量高分子量小，244.31D,I環(huán)為咪唑酮環(huán)，可與親合素結(jié)合環(huán)為噻吩環(huán)，C2上戊酸側(cè)鏈的未端羧基是結(jié)合生物大分子的唯一結(jié)構(gòu),I咪唑酮環(huán),噻吩環(huán),羧基:可用于活化為其他衍生物,第一節(jié)生物素理化性質(zhì)與標(biāo)記,一、活化生物素,生物素側(cè)鏈的末端羧基經(jīng)化學(xué)修飾后制成帶各種活性基團(tuán)的衍生物活化生物素(生物素化衍生物)為何要活化？,活化生物素,活化生物素易與抗原、抗體、酶及核酸分子中相應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)形成生物素化標(biāo)記物,標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素,標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素,標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素,標(biāo)記核酸的活化生物素,活化生物素,標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素,BNHS分子可與蛋白質(zhì)賴氨酸（堿性AA）的氨基形成肽鍵BNHS適用標(biāo)記抗體和中性或偏堿性的蛋白質(zhì),生物素,N-羥基丁二酰胺,碳二亞胺,生物素羥基琥珀酰亞胺酯(BNHS),如何減小空間位阻,長(zhǎng)臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羥基丁二酰亞胺之間添加了兩個(gè)6-氨基已糖分子基團(tuán)，形成連結(jié)臂，生物素與大分子基團(tuán)的距離增加，更易發(fā)揮生物素的活性作用。,生物素分子量小，當(dāng)與抗體或酶形成生物素標(biāo)記結(jié)合物后，由于大分子蛋白的空間位阻效應(yīng)，可對(duì)生物素與親和素的結(jié)合以及BAS的應(yīng)用效果造成干擾。,？,標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素,生物素酰肼(BHZ)：水合肼與生物素的合成物主要用于標(biāo)記偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)：生物素與賴氨酸連接后，再與無(wú)水肼反應(yīng)而成。除醛基外，BCHZ還可標(biāo)記氨基,標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素,馬來酰亞胺-丙酰-生物胞素（MPB)：能特異地與蛋白質(zhì)巰基結(jié)合的活化生物素,標(biāo)記核酸的活化生物素,光生物素(photobiotin)光敏物質(zhì)側(cè)鏈上連接的芳香基疊氮物基團(tuán),經(jīng)光照后,變?yōu)榉枷慊趸剑芍苯优c腺嘌呤氨基結(jié)合,形成B-核酸探針，用于DNA或RNA的標(biāo)記。生物素脫氧核苷三磷酸（如Bio-dUTP）作為TTP的結(jié)構(gòu)類似物，可采用缺口移位法（DNaseI和DNA聚合酶I）摻入到雙鏈DNA中。BNHS和BHZ可直接標(biāo)記核酸，但對(duì)堿基配對(duì)有影響。,目前常用光生物素和生物素化dUTP作為標(biāo)記核酸的活化生物素。,特性：活化生物素通過側(cè)鏈與蛋白分子連接；一個(gè)蛋白分子可被多個(gè)生物素標(biāo)記多價(jià)性（是BAS多級(jí)放大作用的物質(zhì)基礎(chǔ)）；BNHS多標(biāo)記抗體和中性或偏堿性的蛋白質(zhì),BHZ則多標(biāo)記微酸性抗原；抗原、抗體標(biāo)記后活性不變；可對(duì)標(biāo)記材料（如酶）標(biāo)記：堿性磷酸酶標(biāo)記后，活性降低；,二、活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì),注意事項(xiàng)：選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標(biāo)記基團(tuán)的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性；控制生物素：蛋白質(zhì)比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜為2:1,IgG應(yīng)用濃度0.55g/ml;生物素13個(gè)/Ag，35個(gè)/Ab；使用交聯(lián)臂減少空間阻力,第二節(jié)親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標(biāo)記,親合素(avidin,AV)和鏈霉親合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特異性結(jié)合物。而且，二者均為大分子蛋白，因此幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親合素（AV）或鏈酶親合素（SA）結(jié)合。,結(jié)構(gòu)四亞基糖蛋白四肽鏈蛋白無(wú)糖基PI10.56結(jié)合位色氨酸色氨酸生物素44Ka10151015活性1315U1518U,親合素（AV）,鏈霉親合素(SA),一、理化特性,SA表面所帶正電荷少，且不含糖基，非特異性結(jié)合遠(yuǎn)低于AV，因此目前以SA標(biāo)記的酶結(jié)合物更為常用。,二、親合素/鏈霉親合素的標(biāo)記,可標(biāo)記AV/SA的物質(zhì)：酶、抗原或抗體、鐵蛋白、膠體金、125I、異硫氰酸熒光素（FITC）等。HRP-AV(SA)（酶標(biāo)記蛋白的直接標(biāo)記法）：過碘酸鈉法、戊二醛法。ABC/SABC：通過與生物素化酶復(fù)合物中的生物素結(jié)合，間接地與酶形成結(jié)合物。AV(SA)+B-HRP/ALPABC(avidin-biotin-peroxidasecomlplex)/ABAP,第三節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)(BAS)的特點(diǎn),靈敏度高:生物素標(biāo)記蛋白具有多價(jià)性，且標(biāo)記后的抗原/抗體生物活性不變，每個(gè)親合素有四個(gè)生物素結(jié)合部位，可同時(shí)以多價(jià)形式結(jié)合到生物素化大分子衍生物和標(biāo)志物上，因此，BAS具有多級(jí)放大作用，反應(yīng)的靈敏度高。穩(wěn)定性高和特異性強(qiáng)：AV/SA與生物素結(jié)合的親和常數(shù)比抗原-抗體反應(yīng)至少高1萬(wàn)倍，二者的結(jié)合呈高度專一性和不可逆性，且酸、堿、變性劑、蛋白溶解酶、有機(jī)溶劑以及反應(yīng)試劑的高度稀釋均不影響其結(jié)合。因此，BAS穩(wěn)定性高，特異性強(qiáng)。,第三節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)(BAS)的特點(diǎn),適用性廣泛：BAS的多級(jí)放大作用，以及既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標(biāo)記材料，使BAS不僅用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測(cè)及定位觀察研究，亦可制成親和介質(zhì)用于上述各類反應(yīng)體系中反應(yīng)物的分離、純化。其他：可制成通用試劑（如生物素化二抗等）；反應(yīng)試劑可高度稀釋，特別是與一抗偶聯(lián)使用可大幅減少一抗用量，降低實(shí)驗(yàn)成本；實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間不長(zhǎng)。,第四節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用,生物素與親合素之間結(jié)合的親合力高、特異性強(qiáng)，各自均可以與各型大小分子結(jié)合，以及二者在結(jié)合反應(yīng)時(shí)具有的多級(jí)放大作用等優(yōu)越性，使BAS及其相關(guān)技術(shù)被廣泛應(yīng)用在各種標(biāo)記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中，尤其為標(biāo)記免疫檢測(cè)自動(dòng)化分析做出了極大的貢獻(xiàn)。,一、生物素-親合素系統(tǒng)基本類型及原理,BAB法：Ag+BAbAg-AbBA/SAAg-AbB-A/SABEAg-AbB-A/SA-BE特點(diǎn)：以游離A/SA分別連接B-Ab和B-E,BA法，也稱標(biāo)記親合素-生物素法:（labeledavidin-biotin,LAB）Ag+BAbAg-AbBAE/SAEAg-AbB-A/SAE特點(diǎn)：以AE/SAE代替BAB法中的A/SA，省卻了加BE的步驟,3.,ABC法A+BEA-BE-ABCAg+BAbAg-AbBABCAg-AbB-ABC特點(diǎn):將BAB法中的A先與B-E結(jié)合，制備成復(fù)合物ABC,網(wǎng)絡(luò)了大量酶分子，使該法的檢測(cè)靈敏度顯著提高。,BAB與ABC成員相同，反應(yīng)順序不同,此外，按待檢反應(yīng)體系中所用的是生物素化第一抗體或生物素化第二抗體，BAS分為直接法和間接法。,BAS實(shí)驗(yàn)方法及反應(yīng)層次,二、生物素-親合素系統(tǒng)在酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用,BAS在ELISA中的應(yīng)用：BAS用于固相化抗原/抗體的制備AV/SA先包被固相載體、抗原/抗體先與生物素結(jié)合AV/SA-B反應(yīng)而使抗原/抗體固相化。BAS用于ELISA的終反應(yīng)放大BA-ELISA、BAB-ELISA、ABC-ELISABAS在均相酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用：BE*AA-BE（酶因活性中心受空間位阻作用而失活）反應(yīng)系統(tǒng)：BE*、AgA、Ab（限量）、標(biāo)準(zhǔn)Ag/待檢AgAgA和待檢Ag競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合限量Ab，若AgAgAbAgAAgA-BE酶活性變化與待測(cè)標(biāo)本中抗原濃度呈負(fù)劑量相關(guān)。（酶活性降低）,三、生物素-親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用,BAS用于熒光抗體技術(shù)可明顯提高方法的靈敏度和特異性，通常采用BA法，即用熒光素直接標(biāo)記親合素（或鏈酶親合素）；也可采用游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標(biāo)記的生物素（BAB法）或熒光標(biāo)記的抗親合素（或鏈酶親合素）抗體的夾心法。BAS用于時(shí)間分辨熒光免疫分析也可以將反應(yīng)信號(hào)放大。,四、生物素-親合素系統(tǒng)在放射免疫測(cè)定中的應(yīng)用,BAS主要與免疫放射分析(IRMA)檢測(cè)體系偶聯(lián)，用于對(duì)終反應(yīng)的放大（BA法）BAS也可用于IRMA反應(yīng)后B、F成分的分離,五、生物素-親合素系統(tǒng)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用,以生物素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行的定位檢測(cè)用BAS制備的親和吸附劑進(jìn)行基因的分離純化將免疫測(cè)定技術(shù)與PCR結(jié)合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的檢測(cè)如DNAB-SAProA-IgG-Ag,Ag和DNA間建立對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而將對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)轉(zhuǎn)化為對(duì)核酸的檢測(cè)，抗原抗體反應(yīng)的特異性與PCR技術(shù)的高度敏感性相結(jié)合，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)10-21mol水平，是迄今最敏感的分析方法。,思考題,生物素的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是什么？生物素通過什么結(jié)構(gòu)、形式與生物大分子相連結(jié)？親合素或鏈霉親合素的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)有何特點(diǎn)？為什么親合素、鏈霉親合素具有“橋聯(lián)”作用？親合素、鏈霉親合素可以被哪些示蹤劑標(biāo)記？為什么生物素親合素系統(tǒng)具有放大作用？生物素與親合素或鏈霉親合素的結(jié)合是否與抗原抗體結(jié)合相同？生物素親合素系統(tǒng)放大的是反應(yīng)過程還是單一檢測(cè)信號(hào)？生物素、親合素或鏈霉親合素如何與標(biāo)記免疫技術(shù)聯(lián)接？如何將生物素鏈霉親合素放大系統(tǒng)用于所有雙位點(diǎn)ELISA?,小結(jié),生物素親合素（鏈霉親合素）系統(tǒng)具有的多級(jí)放大獨(dú)特效應(yīng)，可極大地提高分析測(cè)定的靈敏度；二者之間的高親和、高特異結(jié)合以及既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標(biāo)記材料的特性，使該系統(tǒng)在標(biāo)記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性和適用性。該系統(tǒng)有二種基本類型：以游離親合素為中間物，分別連接包含生物素化大分子的待檢反應(yīng)體系和標(biāo)記生物素的BAB法或ABC技術(shù)；另一類是直接用標(biāo)記親合素連接生物素化大分子反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)的BA法或LAB。此外，