.,第四節病毒的檢驗,good,.,常用的病毒檢驗方法包括：,一、病毒的分離鑒定二、病毒感染性的檢測三、病毒顆粒檢測四、病毒的血清學檢查五、病毒的分子(蛋白和核酸)檢測,.,一、病毒的分離鑒定,病毒的分離與鑒定可為病毒感染提供最為直接的病原學證據，同時可為進一步的病毒學研究提供材料。病毒的分離和鑒定（含義）：指從病人、帶毒者、外界環境中采集標本經過適當的處理,采用一系列物理、化學、生物學等手段,將病毒從標本中分離出來,并通過有關特異性方法鑒定屬于何種病毒,這一方法稱為病毒的分離與鑒定。,.,病毒的分離與鑒定包括：1、病毒材料的采集與準備2、病毒的分離與培養3、病毒的形態學觀察4、病毒的理化特性測定5、病毒的血清學鑒定及病毒的分子生物學鑒定等基本過程。,.,（一）標本的采取與送檢,病料采集適當與否,直接影響病毒的檢測結果。一般可采集發病或死亡動物的組織病料、分泌物或糞便等,主要因動物及病毒的種類而異,例如檢測犬細小病毒或輪狀病毒,一般應采腹瀉幼犬或犢牛的糞便;懷疑為口蹄疫的豬或牛,則應采其水皰液及水皰皮送檢。,.,應注意下列原則：,1.對本身帶有雜菌(如咽喉拭子、糞便)或易受污染的標本，要進行病毒分離培養時，應使用抗生素。2.因病毒在室溫中易失去活性，標本應低溫保存并盡快送檢。3.血清學診斷標本的采取應在發病初期和病后23w內各取1份血清，以便對比雙份血清抗體效價的動態變化。,.,標本處理：,采集樣本在接種細胞、雞胚或動物之前,都需要做適當的處理,以保證病毒分離的成功幾率。采集的器官或組織樣本：如肺臟、腦、肝、脾、淋巴結等,可取一小塊進行充分研磨,加入含青、鏈霉素的Hanks液,離心取上清液作為接種物;鼻液、膿汁、乳汁等分泌物或滲出液、糞便,應加入高濃度的抗生素,充分混勻后,置4冰箱內處理24h或過夜,離心后取上清做接種用;咽喉拭子在取樣后應迅速將其浸泡入含有2%小牛血清和一定濃度的青、鏈霉素的Hanks液中,充分刷洗棉拭子,反復凍融35次,離心后取上清液作為接種材料。,.,（二）病毒的分離與培養,細胞培養、雞胚和實驗動物可用于病毒的分離與培養,其中細胞培養是用于病毒分離與培養最常用的方法。用于病毒分離與培養的細胞有原代細胞、二倍體細胞株和傳代細胞系,一般說來,本動物的原代細胞最為敏感,但不如傳代細胞方便易得.例如豬傳染性胃腸炎病毒初次分離最好用豬甲狀腺原代或二倍體細胞,但該細胞生長緩慢,通常用PD5(豬甲狀腺細胞系)取代。培養方法常用的有靜置培養和旋轉培養,有的病毒如輪狀病毒,初次分離時旋轉培養的成功率較靜置培養高。,.,1、病毒的分離,不同的病毒分離時采用不同的分離方法,這主要取決于目的病毒的生物學特性。主要有細胞培養法、雞胚接種法、動物接種法等,而對細胞、雞胚不敏感,又沒有合適動物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。,.,（1）動物接種法,是最原始的病毒培養方法，根據病毒種類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位，如嗜神經性病毒（狂犬病毒）可接種于小鼠腦內，痘病毒可接種于家兔角膜或皮內。動物的接種途徑要根據病毒種類、實驗動物種類、接種材料等選擇合適的接種途徑。動物接種途徑的選擇正確與否對提高病毒分離成功率也起到重要作用。,.,常見病毒常用實驗動物及接種途徑,P37,.,在動物實驗的期間或結束時采集動物血液檢測病毒或特異性抗體。實驗動物采血分為致死性采血和非致死性采血兩種。致死性采血是指盡量采集動物血,直至動物死亡。非致死性采血是指采集一定量的動物血而不致動物死亡。對采血動物,應在禁食24h后采血。采血應無菌操作。不同動物采用不同的采血方法。常用的有心臟采血法、眼眶采血法、頸靜脈采血法、頸動脈采血法、耳靜脈采血法等。根據實驗動物和實驗條件靈活選用。,實驗動物采血,.,雞胚對多種病毒敏感。不同病毒在雞胚的不同部位的生長特性差異很大,因此選擇適當的接種途徑是病毒分離成功的關鍵。一般采用孵化914天的雞胚，根據病毒種類不同，將病毒標本接種于雞胚的不同部位，最常用的雞胚接種部位有：尿囊腔、絨毛尿囊膜、卵黃囊和羊膜腔等。,（2）雞胚培養法,.,是將離體活組織塊或分散的組織細胞加以培養的技術總稱，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。,（3）細胞培養(cellculture)法或組織培養法(tissueculture),.,一般選擇生長旺盛的敏感細胞用于病毒分離。少數病毒例外,例如犬、豬等的細小病毒,病毒的復制有賴于分裂旺盛的細胞,因此需將病毒接種與細胞培養同步進行。細胞培養技術在病毒發現、病毒研究、疫苗研制、抗病毒藥物篩選等病毒學發展的歷程中發揮著重要作用。,.,常見人類病毒的敏感細胞,P36,P36,.,（4）分子生物學技術,對體外培養的細胞、雞胚、動物不敏感的病毒,可采用現代分子生物學技術,如基因克隆技術,對病毒的全基因進行克隆,構建表達載體,并能表達出病毒樣顆粒。,.,（三）病毒的鑒定,步驟：1、初步鑒定2、接種動物的觀察3、最終鑒定,.,1、初步鑒定,(1)根據臨床表現、流行病學特征與標本來源。初步判定屬于哪一類病毒腦炎患者腦脊液乙型腦炎病毒秋季腹瀉病人糞便輪狀病毒發燒小孩（下肢麻痹）糞便脊髓灰質炎病毒,.,(2)病毒的生物學特性,病毒或接種分離標本后，細胞出現的病理性變化。不同的病毒具有不同的敏感細胞，而又能引起不同的細胞病變效應。例如：上呼吸道標本接種到細胞培養上,出現細胞融合,產生多核巨細胞現象，就要考慮副黏病毒、皰疹病毒、腎綜合征出血熱病毒、冠狀病毒、流感病毒等；接種到WI-38或人胚肺細胞培養上出現散在的、局部堆積的巨大細胞，則要考慮巨細胞病毒的可能性；腸道病毒能使細胞圓縮、變小、分散，往往全部細胞受到破壞；腺病毒能使細胞腫大，顆粒增多，細胞聚集成葡萄狀。,細胞病變效應,哪三種現象？,.,血吸附和血凝作用,有些病毒感染細胞后,細胞膜上可鑲嵌著病毒基因編碼產生的糖蛋白,其中有些能吸附特定種類的紅細胞,或將細胞培養單層刮下后,經過適當處理,可以凝集特定種類的紅細胞,此類糖蛋白在細胞表面形成刺突,稱為血凝素。如流感病毒、副黏病毒、風疹病毒等感染細胞后可產生血吸附現象,或通過血凝實驗來證實病毒的存在。,.,新城疫病毒能吸附和凝集豚鼠紅細胞風疹病毒能吸附和凝集鴿子、綿羊等紅細胞病毒的血凝作用往往需要一定的pH和溫度,利用血吸附和血凝集現象可以為初步判定屬于何種病毒提供重要思路。,例子,.,干擾現象,一種病毒感染細胞后,可以干擾另一種病毒在該細胞內的增殖,這種現象稱為干擾現象。利用干擾現象可以檢查出一些不引起細胞病變、血凝、血吸附的病毒。如：鼻病毒就可以利用干擾現象進行初步鑒定。實驗組：感染人胚腎細胞管或培養板細胞用人或豚鼠紅細胞做血吸附實驗,如果陰性,用Hanks液洗滌3次,然后接種仙臺病毒,33培養48h,做血吸附實驗。對照組：正常細胞只接種仙臺病毒。實驗現象：如果對照組血吸附陽性,而實驗組陰性,說明先前接種的標本中存在能干擾仙臺病毒增殖的病毒,此結果即為干擾試驗陽性。,.,（3）病毒的理化特性測定,包括病毒核酸類型鑒定、耐酸性試驗、脂溶劑敏感性試驗、耐熱性試驗、胰蛋白酶敏感性試驗等通常以細胞培養或雞胚培養為觀察體系,應設立已知病毒為對照。,病毒的理化特性是病毒鑒定的重要依據,.,代謝抑制法鑒定病毒核酸類型,病毒核酸類型鑒定是病毒理化特性測定的最主要指標。添加氟脫氧尿核苷(FUDR)或類似物于病毒培養物中,病毒復制被抑制者,即為DNA病毒,否則為RNA病毒,也可用DNA酶或RNA酶分別作用,以判定核酸的性質。綠豆芽酶可降解單股核酸,用它可進一步鑒定核酸是單股或雙股。,.,可直接用純化的病毒核酸通過電鏡觀察，對其進行鑒定。但技術要求較高。近年來,PCR核酸測序技術的應用使得病毒核酸型鑒定的可行性大為增加。（觀看PCR視頻）,.,脂溶性試驗,用乙醚或氯仿處理待檢病毒液,而后與未處理者比較其TCID50的變化,以判斷是否敏感。乙醚、氯仿、脫氧膽酸鈉等脂溶劑能破壞病毒的脂質包膜。有包膜的病毒對脂溶劑敏感,受脂溶劑的處理能使病毒失去感染性;無包膜的病毒往往對脂溶劑有抵抗力。因此,用乙醚等可以鑒定所分離的病毒是否有包膜。,.,病毒粒的結構模式圖,殼粒,衣殼,核心（核樣物）,核衣殼,包膜,包膜病毒,包膜子粒,.,處理方法:,將病毒懸液20003000r/min離心20min,取上清液,分成兩組：一組為試驗組：按與乙醚4:1的比例振蕩混合均勻,管口密封好,4過夜后,20003000r/min離心20min。此時液體分為兩層,上層為乙醚,下層為病毒液。吸取下層部分,避免混有乙醚。另一組為對照組：不加乙醚,處理方法同試驗組。將兩組的病毒液同時測定病毒滴度,如果試驗組病毒滴度明顯降低,與對照組有明顯差異,說明病毒對乙醚敏感,屬于有膜病毒。如果兩組的病毒滴度沒有顯著差異,說明病毒對乙醚有抵抗力,屬于無膜病毒。,.,耐酸性試驗,耐酸性試驗和脂溶劑敏感性試驗是最常做的兩項理化指標。耐酸性試驗設置緩沖液pH為3和7的病毒做比較。通過腸道傳播的病毒對酸有抵抗力,借此可鑒別某些病毒。如腸道病毒與鼻病毒同為RNA病毒,腸道病毒對酸有抵抗力,而鼻病毒則沒有。,.,處理方法:,試驗組：病毒懸液用0.1mol/L的HCl調pH至3.0,37放置2h后,用5.6%的NaHCO3調pH至7.2對照組：除了不加酸外,其他步驟和試驗組相同。將兩組同時測定病毒滴度,如果試驗組病毒滴度明顯降低,與對照組有顯著差異,說明病毒對酸敏感,不屬于腸道病毒。如果兩組的病毒滴度沒有顯著差異,說明病毒對酸有抵抗力,屬腸道病毒。,.,2、接種動物的觀察,根據動物的感染范圍,可初步推斷屬于何種病毒。接種動物的觀察是非常重要的,通過觀察試驗動物的反應有時也可初步鑒定何種病毒。每天都需要觀察,有時1d需要觀察數次。,.,觀察指標:,動物發病的潛伏期,病毒感染都有一定的潛伏期。因此,潛伏期在病毒的初步鑒定方面也是非常重要的。如乙腦小鼠腦內接種潛伏期一般為4d,狂犬病腦內接種潛伏期一般為68d。接種動物的飲食情況是否有變化,活動與飲食能力是否發生改變,糞便是否有變化。每天在同一時間測量動物的體重和體溫,比較接種前后變化情況。觀察局部或全身性反應,如出現毛松、軟弱無力、震顫、不安、抽搐,甚至死亡等全身癥狀,可考慮神經系統感染的可能性。對照組不接種病毒,用生理鹽水代替,其他步驟和觀察指標與試驗組完全相同。,.,3、最終鑒定,病毒的最終鑒定需要免疫學方法、分子生物學方法、電子顯微鏡與免疫電子顯微技術等特異性方法加以鑒定。（1）病毒的血清學鑒定（2）病毒的分子生物學鑒定（3）電子顯微鏡技術,.,（1）病毒的血清學鑒定,病毒分離后,可用已知的抗病毒血清或單克隆抗體,對分離毒株進行血清學鑒定,以確定病毒的種類、血清型及其亞型。常用的血清學試驗有血清中和試驗、血清抑制試驗、免疫熒光試驗等。此外,可采用一些血清學技術如免疫沉淀技術和免疫轉印技術分析病毒的結構蛋白成分。,.,中和試驗,基本原理：特異性的抗病毒免疫血清（即中和抗體）和病毒體表面的抗原結合后,使病毒不能吸附于敏感細胞,或兩者結合后抑制了病毒的穿入和/或脫殼過程。因此,病毒就失去了感染的能力。中和試驗是以測定病毒的感染力為基礎的,試驗必須在培養的細胞內,或動物、雞胚等活體內進行,而且都必須是對病毒敏感的。以病毒受免疫血清中和后的殘存感染力為依據,判定中和抗體的滴度。中和試驗需要設對照試驗。,.,結果判定的科學依據：,用細胞培養進行試驗時,可依據細胞病變情況、蝕斑數量、顏色反應等。用雞胚進行試驗時,可依據雞胚的死亡數、絨毛尿囊膜斑點數量和特征、血凝素產生情況等;用動物進行試驗時,可依據動物死亡數、發病數、出現癥狀數等。,.,操作步驟：,中和試驗常用的有兩種方法：一種是固定病毒數量,一般用100TCID50的病毒與等量一系列倍比稀釋的血清進行中和試驗。然后接種于動物、雞胚或細胞中，用Reed-Muench法計算50%感染的血清中和終點。另一種是固定血清用量與等量一系列對數稀釋的病毒進行中和試驗。,.,病毒毒價單位：,半數致死量(LD50)作為毒價測定單位，即經規定的途徑，以不同的劑量接種試驗動物，在一定時間內能致半數試驗動物死亡的劑量。用雞胚測定時，毒價單位為雞胚半數致死量(ELD50)或雞胚半數感染量(EID50)。用細胞培養測定時，用組織細胞半數感染量(TCID50)。在測定疫苗的免疫性能時，則用半數免疫量(IMD50)或半數保護量(PD50)。,.,病毒毒價的測定（微量法）,(1)病毒的制備將病毒接種于單層細胞，37吸附1h后加入維持液，置溫箱培養；逐日觀察，待細胞病變（CPE）達75%以上，收獲病毒懸液凍融或超聲波處理，以3000r/min離心10min，取上清液，定量分裝成1ml小瓶置-70保存備用，選用的病毒必須是對細胞有較穩定的致病力。,.,(2)病毒毒價測定取置-70冰箱保存的病毒一瓶，將病毒在96孔培養板上作10倍遞進稀釋即10-1，10-2，10-3，每孔病毒懸液量為50l，每個稀釋度作8孔，每孔加入100l細胞懸液，每塊板的最后一行設8孔細胞對照，制備細胞懸液的濃度以使細胞在24h內長滿單層為度。把培養板置5%CO2溫箱37培養，從48h-14d逐日觀察細胞病變，記錄結果。,.,中和試驗可應用于：,1.病毒株的種型鑒定：中和試驗具有較高的特異性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同型標準血清，即可測知相應血清或病毒的型，所以中和試驗不但可以定屬而且可以定型。2.測定血清抗體效價：中和抗體出現于病毒感染的較早期，在體內的維持時間較長。動物體內中和抗體水平的高低，可顯示動物抵抗病毒的能力。3.分析病毒的抗原性。,.,血凝抑制試驗,基本原理:某些病毒具有血凝素,能選擇性地作用于個別種類的哺乳動物的紅細胞表面的受體,病毒附著于細胞而發生凝集反應,稱為紅細胞凝集現象(簡稱血凝)。如果將病毒特異性抗體加入病毒或血凝素懸液中,作用一定時間后,由于抗原(血凝素)與抗體發生特異性結合,這種結合妨礙了病毒血凝素對紅細胞的附著,因而血凝現象被抑制,這種試驗稱為血凝抑制試驗。,.,用簡式表示:,病毒+紅細胞凝集病毒+抗體+紅細胞凝集被抑制,.,免疫熒光試驗,基本原理：有些熒光素能和抗體分子結合,并且保持抗體活力,和相應的抗原特異性結合,并形成免疫復合物。此種復合物因有熒光素作標記,借助熒光顯微鏡,能觀察到它的存在及位置,從而可以確定相應的病毒抗原。,.,免疫熒光試驗分直接法和間接法兩種:,直接法:直接法是將熒光素標記在病毒特異性抗體分子上,標記的抗體直接與固定在載玻片細胞內的病毒抗原結合,然后于熒光顯微鏡下觀察結果。直接法的優點是簡便、特異;缺點是敏感性較低,只能檢測一種病毒抗原。,.,間接法:將熒光素標記在抗人或抗動物抗體即抗抗體分子上,用來檢測抗體與病毒抗原形成的復合物,因此間接法有兩對抗原抗體系統。間接法的優點是敏感性高，標記一種抗體可用于多種抗原的檢測;缺點是有時出現非特異性熒光,所以對操作要求更高。,.,操作步驟：,首先制備含有病毒抗原的細胞片：在細胞培養瓶中加入載玻片,讓細胞在載玻片上生長,并感染病毒。根據病毒復制特性,一定時間后用冷丙酮固定,用抗體和/或熒光標記抗體染色。于熒光顯微鏡下觀察、記錄結果。,.,（2）病毒的分子生物學鑒定,分子生物學技術已廣泛應用于病毒的鑒定：包括病毒基因的PCR擴增及其序列分析,核酸雜交技術,病毒全基因組序列測定分析等,從而可獲得分離毒株的基因組信息,依據基因組序列繪制遺傳進化樹分析比較分離毒株的遺傳變異情況,確定分離毒株的基因類型。,.,（3）電子顯微鏡技術,細胞培養、雞胚培養和動物培養的病毒可以借助電子顯微鏡技術,包括超薄切片和負染技術,觀察標本中的病毒形態結構,尤其是形態結構比較特殊的病毒,如腺病毒、痘病毒、冠狀病毒、輪狀病毒、流感病毒、彈狀病毒等具有更特殊的鑒別價值。,.,某些病毒感染早期的標本和某些難以培養的病毒可以用電子顯微鏡技術觀察標本中的病毒顆粒。如可以從甲型肝炎病人的糞便中檢出甲型肝炎病毒顆粒,從嬰幼兒腹瀉的糞便中檢出輪狀病毒和諾沃克病毒顆粒等。有時在臨床上對水痘帶狀皰疹病毒和天花病毒引起的皰疹很難區別,借助電子顯微鏡技術可在數小時內做出明確的鑒別診斷。,.,二、病毒感染單位的測定,病毒的滴度（titer）：樣本中病毒的濃度病毒滴度可以通過用系列稀釋的病毒接種細胞培養、雞胚或實驗動物,檢測病毒增殖的情況而確定。常用于病毒感染單位測定的技術有空斑試驗、終點稀釋法、熒光-斑點試驗、轉化試驗等,最常用的是前兩種。,.,1.空斑試驗,是一種檢查和準確測定病毒滴度的方法。將稀釋的病毒懸液加入單層細胞培養瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層融化的半固體營養瓊脂，使病毒在單層細胞培養中有限擴散。結果是每一個有感染性的病毒在單層細胞中可產生一個局限性的感染灶。用活性染料(如中性紅)染色，則活細胞著色，受病毒感染而破壞的細胞不著色，形成肉眼可見的空斑/蝕斑(plaque)。每個蝕斑是由一個感染性病毒顆粒形成的，稱作空斑形成單位(plaqueformingunit,PFU)。病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示。,.,根據樣本的稀釋度和空斑數,計算每毫升空斑形成單位(PFU),即可確定病毒的滴度。為了盡量減小計算病毒滴度的誤差,進行空斑試驗時應對病毒液做系列稀釋,依據細胞培養板(瓶、皿)的面積,僅計算含20100個空斑的培養板,因超過100個空斑的培養板會導致計數不準確。空斑試驗是純化和滴定病毒的一個重要手段,只是并非所有病毒或毒株都能形成空斑。,.,2.終點稀釋法,終點稀釋法endpointdilutionassay)用于測定幾乎所有種類的病毒滴度,包括某些不能形成空斑的病毒,并可用以確定病毒對動物的毒力或毒價。將病毒做系列稀釋,選擇46個稀釋度,接種一定數量的細胞、雞胚或動物,每個稀釋度做36個重復。使用細胞培養,可通過CPE來判定組織培養半數感染量(TCID50)。在雞胚或動物,是以死亡或發病來測定。動物實驗：以感染發病作為指標時,可計算半數感染量(ID50);以體溫反應作為指標時,可計算半數反應量(RD50)。用雞胚測定時,可計算雞胚半數致死量(ELD50)或雞胚半數感染量(EID50),.,3.熒光-斑點試驗,是空斑試驗的一種改良方法,用于測定細胞培養時不會引致CPE的病毒滴度,如豬瘟病毒。該方法的起始步驟與空斑試驗一致.在病毒充分吸附和基因表達之后,用甲醇或丙酮固定細胞,用針對病毒蛋白的抗體進行處理,然后加入熒光素標記的二抗。將細胞置熒光顯微鏡下觀察,病毒感染細胞形成熒光斑點,病毒的滴度以每毫升熒光斑點形成單位。,.,4.轉化試驗,用于測定某些不形成空斑的反轉錄病毒的滴度。Rous肉瘤病毒轉化雞胚細胞就是一個例子.受到轉化的細胞可形成小的斑點,容易與其余的單層細胞相互區別。感染性以每毫升斑點形成單位（focus-formingunit，FFU）表示。,.,三、病毒顆粒的檢測,方法：電鏡技術、血凝試驗、病毒酶活性測定、綠色熒光蛋白標記最直觀的方法是用電子顯微鏡（electronmicroscopy，EM）觀察病毒顆粒病毒濃度要求：107如：某些病毒料中含毒量較高,如輪狀病毒引致的腹瀉的糞便,EM觀察較易發現病毒,但像口蹄疫病毒或豬瘟病毒,病料中一般含毒量較低,EM不作為常規檢驗手段。,1、電鏡技術,.,免疫電鏡(IEM),免疫電鏡(IEM)技術是應用病毒的特異抗體的電鏡技術,可檢出某些憑形態特征較難區分的病毒。由于抗體與病毒顆粒相結合,凝聚了樣本中的病毒。可提高檢出率。高滴度的抗血清或單克隆抗體是決定IEM成敗的關鍵材料。,.,2、血凝試驗,許多動物病毒,如正黏病毒科、副黏病毒科、腺病毒科的成員,能夠凝集某些動物(如雞、小鼠、豚鼠)或人的紅細胞。這些病毒含有可與紅細胞結合的蛋白質,如禽流感病毒的囊膜上有一種稱為血凝素的糖蛋自,可與紅細胞表面的N-乙酰神經氨酸糖蛋自結合,引起紅細胞凝集。利用這種特性,可做血凝試驗來檢測這些病毒的存在。,.,一般將病毒液在血凝反應板上做倍比稀釋,加入紅細胞,未凝集的紅細胞呈圓點或紐扣狀沉于孔底,而凝集的紅細胞彌漫性格狀覆蓋整個孔。該方法快速,但如犬細小病毒檢驗樣本中的病毒粒子含量若少于lO9/g,敏感性則差。,+：血球完全凝集，成厚膜狀鋪于管底。+：血球呈薄層貼附于管底，邊緣不整齊。+：中央呈小圓盤狀，邊緣凝集呈顆粒狀。+：中央呈彌散圓盤狀，邊緣有少量凝集顆粒。：無凝集，血球自然沉于管底呈一小圓盤狀。,.,3、病毒酶活性測定,一些動物病毒含有核酸聚合酶，可將病毒與放射性標記的前體混合,測定其放射性活性,該方法常用于反轉錄病毒的反轉錄活性的檢測,因它們不能轉化細飽,也不能形成空斑。因酶活性與病毒粒子數量成比例關系,因此該方法可以快速跟蹤感染過程中病毒的增殖侑況。,.,4、綠色熒光蛋白標記,用于檢測病毒的轉錄或翻譯過程,在活細胞中可直接觀察到，不需要固定細胞,也不需要底物或酶。可將綠色熒光蛋白的基因序列插入病毒基因組,不影響病毒蛋白的功能,用重組病毒感染細胞后,即可產生綠色熒光蛋白。可用于研究病毒的亞細胞定位,分析病毒在活細胞中的吸附、侵入、脫殼、復制、裝配和釋出過程.,.,四、病毒的血清學診斷,原理是用已知病毒抗原來檢測病人或動物血清中有無相應抗體，故須待病人或動物感染后體內產生抗體時才能檢出。另外，在采取臨床標本及病人、動物血清應注意病程，必須采取患者急性期血清與恢復期血清(雙份血清)進行血清學試驗。若第2次血清抗體滴度比第1次高出4倍以上時，才有診斷意義。,.,血清學技術,1、免疫熒光技術2、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）3、免疫沉淀技術4、免疫轉印技術5、中和試驗6、血凝試驗和血凝抑制試驗7、補體結合試驗,.,（一）病毒抗原的直接檢出,除對細胞培養中的病毒可進行鑒定外,對一些血清型類別不多或在常規細胞培養系統中還不能成功培養的病毒,應用免疫熒光技術或酶聯免疫吸附實驗直接檢測病毒抗原是快速而簡單的方法。,.,1.免疫熒光法(immunofluorescentassay，IF),根據抗原抗體特異性結合的反應特點,將熒光色素與待檢病毒的特異性抗體以化學的方法結合起來。將熒光標記了的抗體在特定的條件下浸染標本,使抗體與標本中的抗原(病毒)發生結合反應,細胞內的病毒或抗原可被熒光素標記的特異性抗體結合,在熒光顯微鏡下可見斑點狀黃綠色熒光,根據所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。,.,免疫熒光(IF)法用于鑒定病毒具有快速、特異的優點。此方法主要包括直接免疫熒光法、間接免疫熒光法以及在間接法的基礎上發展而成的補體結合法。,.,2.酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays,ELISA),ELISA使用病毒特異性抗體檢測標本中的病毒抗原。ELISA法用于鑒定病毒具有簡便、快速、特異的優點。,.,3.免疫沉淀(immunoprecipitation),基于病毒特異性抗體與感染細胞或組織的可溶性提取物中的病毒蛋白的相互作用。病毒蛋白事先經放射性同位素標記的氨基酸進行代謝標記,將病毒與抗體作用,分離抗體-病毒蛋白復合物,然后將病毒蛋白從復合物中解離,再經聚丙烯酰胺凝膠電泳,最后經放射自顯影,可觀察到病毒蛋白帶條。,.,該技術可用于分析病毒蛋白的許多特性,如存在于病毒粒子和感染細胞內的病毒蛋白種類,蛋白的分子質量,蛋白的合成動態,亞細胞定位,病毒蛋白與其他病毒或細胞蛋白的結合情況。,.,4.免疫轉印(immunoblotting),是基于抗體與固定在濾膜上的病毒蛋白質的相互作用。病毒蛋白經聚丙烯配胺凝膠電泳,然后轉印到對蛋白質有很強親和性的濾膜(如硝酸纖維素濾膜)上，經免疫染色(如免疫酶染色)檢測結合在膜上的蛋白質。由于結合到膜上的蛋白質是變性的,因此識別非線性抗原表位的抗體不適合用于檢測。該方法可用于病毒蛋白的分析,其主要優點在于不需要進行病毒蛋白的標記,因此適用于組織、器官或培養細胞中病毒蛋白的檢測。,.,（二）病毒抗體的直接檢出,應用病毒特異性抗原檢測病毒感染患者血清中的抗體也是診斷病毒感染的的重要手段，可有IgG和IgM兩種。IgM抗體出現于病毒感染早期,可用于快速診斷病毒感染。,.,IgG抗體出現較遲,在血清中存在的時間也較長,因此IgG類抗體用于臨床診斷必須具有早期和恢復期雙份血清,或有隨訪的血清,兩次標本中抗體的效價需有4倍或以上的升高才有診斷價值。,.,ELISA或免疫印跡法可檢測血清中針對某種病毒抗原亞單位的抗體,例如,該法已用于HIV患者抗體的確認實驗。其他常用的方法還包括:1.中和試驗2.補體結合試驗3.血凝抑制試驗,.,1.中和試驗(neutralizingtest,NTtest),是病毒在活體內或細胞培養中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗。針對病毒的一些蛋白質抗原或抗原表位的抗體與病毒結合后可以中和病毒的感染性。中和抗體(netralizingantibodies,NTAb)是作用于病毒表面抗原(衣殼或包膜)的抗體，同種不同型病毒間一般無交叉，特異性高，而且抗體在體內維持時間長。因此流行病學檢查常用此法。,.,病毒中和試驗可以在細胞培養、雞胚或動物上進行,一般將抗體稀釋,與一定量的病毒混合,然后檢測其在細胞培養、雞胚或動物上的殘余感染性。終點是以抑制細胞病變(細胞培養或病毒復制雞胚或動物的抗體最高稀釋度來表示。中和試驗具有很強的特異性,是檢測病毒和新分離病毒毒株的鑒定最經典的方法,也可用于檢測病毒感染動物血清中的抗體。,.,可用來檢查患者血清中抗體的消長情況,也可用來鑒定未知病毒或研究病毒的抗原結構。中和試驗的結果呈現“陽性”不一定表示正在感染中，也可能因以前有過隱性感染所致。因此，中和試驗適用于人群免疫情況的調查，在臨床診斷上較少使用。,.,2.補體結合試驗(complementfixationtest,CFtest),用于檢測人或動物血清中的病毒抗體。用已知病毒內部可溶性抗原來檢測病人或動物血清中相應抗體。一般是血清中IgM類抗體。原理：病毒抗原與抗體的相互反應可以引起補體結合,最終不會導致細胞膜溶解。在補體結合試驗中,利用紅細胞作為靶細胞，溶血系統作為指示系統,因紅細胞膜的溶解易于觀察到。游離的補體可以溶解紅細胞膜。如果存在抗原抗體結合反應,將與補體發生結合,失去溶解紅細胞作用。,.,利用加入“結合了溶血素(即紅細胞抗體)”的綿羊紅細胞可以檢測到是否存在病毒抗原。如果補體被病毒抗原抗體復合物結合,則紅細胞仍然是完整的;相反,如果補體未被結合,紅細胞將在游離的補體的作用下被溶解。因補體結合試驗中常使用粗制的病毒抗原,因此該方法的特異性不是很高.,.,“補體結合抗原”即CF抗原是病毒的內部抗原，同種異型間常有交叉反應，故特異性較中和試驗低。但“補體結合抗體”即CF抗體產生較早，消失較快，常用于病毒早期感染的診斷，故CF陽性可作為近期感染的指標。,.,3.血凝抑制試驗(hemagglutinatiainhibitiontest,HItest),許多病毒表面具有血凝素(HA)，能凝集雞、豚鼠、人等的紅細胞，稱血凝現象。這種現象能被相應抗體（即抗血凝素抗體）所抑制，檢測血凝抑制抗體的試驗，稱HI試驗。即具有HA病毒的抗體，可阻斷病毒與紅細胞結合。原理是血凝素(HA)對應的抗體，即抗血凝素抗體與病毒結合后，抑制了病毒表面的HA與紅細胞的結合。,.,病毒+雞RBC=凝集（血凝試驗）病毒+特異性抗體+雞RBC=不凝集（血凝抑制試驗）本試驗簡易、經濟，特異性高，常用于粘病毒、流感病毒及乙型腦炎病毒感染的輔助診斷及流行病學調查，也可鑒定病毒的型與亞型。,.,五、病毒核酸的檢測,指利用一些分子生物學技術,如基因組電泳分析、核酸雜交、聚合酶鏈式反應、酶切圖譜分析、寡核苷酸指紋圖、DNA芯片技術等,通過檢測病毒的核酸而確證樣本中病毒的存在。目前PCR等技術已廣泛用于病毒的檢測和病毒病的診斷。,.,由于大多數病毒的基因均已克隆并已知道其核酸序列,因此可以利用病毒的基因作為探針(probes)進行雜交以檢測標本中有無相應的病毒核酸,或針對病毒的序列設計相應的引物,作多聚酶鏈反應(PolymeraseChainReactionAssay,PCR)。近年隨著技術的進步,已研制出多種高通量的檢測病毒核酸的技術。,.,1、核酸雜交技術,核酸雜交是病毒診斷領域中發展較快的一項新技術,主要分為Southern雜交和Northern雜交兩大類。其基本原理是雙鏈DNA(或RNA)在加熱或堿處理下,變性解開成單鏈,然后用一條已知的特異性的核苷酸序列的單鏈DNA,以同位素或非放射性核素標記后制成探針去與固態支持物上的變性單鏈DNA進行雜交,再用放射自顯影技術或用生物素-親和素系統進行檢查,以確定待測核酸中有無與探針DNA同源的DNA存在。,.,由于病毒基因很多已成功地被克隆及進行了核苷酸序列測定,因此可以利用特定的病毒基因作為探針,用核酸雜交的方法檢測標本中有無相應的病毒核酸。核酸雜交技術(nucleioacidhybridizationtechnique)方法包括有斑點核酸雜交、細胞內原位雜交、DNA印跡雜交和RNA印跡雜交等。,.,2、PCR技術,近年來發展了一系列以PCR為基礎的體外核酸擴增技術,用于檢測不易感或不能培養的病毒。此方法特異性強、敏感性高、簡便快速,已成功用于HCV、H、CMV、HPV等多種病毒性感染的臨床檢測中。由于PCR方法十分敏感,可檢出fg水平的病毒核酸,故操作時應注意PCR產物的氣溶膠污染以防出現假陽性:此外,病毒核酸檢測陽性并不等于標本中存在有感染性的活病毒。,.,隨著PCR技術的廣泛應用,派生出了一系列的新技術和方法,根據不同的檢測目的可以選用相適應的技術方法。利用實時定量PCR法(realtimequantitaticePCR)檢測病毒載量;利用原位(insitu)PCR法定位檢測細胞或組織中的病毒感染;利用巢式(nested)PCR可以提高PCR的敏感性和特異性等等。,.,3、高通量的病毒核酸檢測技術,突發傳染病病原體的快速鑒定DNA芯片技術目前基因芯片主要有兩種：一種是DNA合成芯片,在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸;另一種是DNA微集芯片,將克隆基因或PCR擴增的基因片段有序地顯微打印到芯片上。,.,DNA芯片技術的優點,一次性可以完成大量樣品DNA序列的檢測和分析,最新研發的高密度病原體基因芯片能檢測1700多種人類病毒。DNA芯片技術解決了傳統核酸雜交技術的許多不足,在病毒診斷和流行病學調查方面有著廣闊的應用前景。,.,六、病毒感染的快速診斷,快速診斷主要是指從含有病毒標本及感染機體的血清中檢測病毒顆粒、蛋白抗原、IgM抗體和核酸等，往往在數小時內即可得出結果。,.,(一)形態學檢查,1.普通光學顯微鏡檢查2.電鏡和免疫電鏡檢查,.,1、普通光學顯微鏡檢查法,某些受病毒感染的細胞內,可形成與正常細胞結構和著色不同的斑塊,稱為包涵體。有些病毒在宿主細胞內增殖后，在細胞的一定部位(胞核、胞漿或兩者兼有)出現一個或數個、圓形或橢圓形、嗜酸性或嗜堿性的結構，即包涵體。包涵體對病毒感染的診斷有一定價值。,.,光學顯微鏡是病毒診斷的輔助方法之一,借助染色技術可以直接觀察病毒產生的核內或胞漿內包涵體和病毒感染細胞的具體形態。應用光學顯微鏡檢查包涵體,根據不同病毒包涵體的形態、染色、存在部位的差異,可輔助診斷某些病毒性疾病。,.,例如,從病