口腔細胞培養及其應用 細胞培養：模擬體內的生理環境，在適當的條件下，使活體組織細胞在體外環境存活、生長增殖，并維持其結構功能。 貼壁型細胞： 必須貼附于支持物表面才能生長。大多數培養細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞 潛伏期（游離期，貼壁期） 對數生長期 停止期（平臺期） 潛伏期：細胞接種培養后，先經過一個在培養液中呈懸浮狀態的懸浮期。此時細胞胞質回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結束。各種細胞貼附速度不同，這與細胞的種類、培養基成分和底物的理化性質等密切相關。 初代培養細胞貼附慢，可長達1024小時或更多；連續細胞系和惡性細胞系快，1030分鐘即可貼附。細胞貼附現象是一個非常復雜和與多種因素相關的過程。支持物能影響細胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質如纖維連接素，細胞表面蛋白等也參與貼附過程。這些物質都是蛋白類成分，它們有的存在于細胞膜的表面，有的則來自培養基中的血清。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。 超凈臺 濾 器 壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣 電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時）。主要用干玻璃 器皿消毒 濾器：過濾除菌：大多數培養用液，如人工合成培養基、血清、 酶液等均采用濾過法除菌 超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環境 紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培養室空氣、操作臺、塑料 培養皿和培養板等表面消毒 水：新鮮配置的三蒸水或去離子水 平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液 天然培養基： 天然培養基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。 優點：營養成分豐富，培養效果好 缺點：來源受限。 成分復雜，影響對某些實驗產物的提取和實驗結 果的分析。 易發生支原體污染 合成培養基 合成培養基是根據細胞生存所需物質的種類和數量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培養基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。 優點：標準化生產，組分和含量相對固定。 成本低 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。 人工合成培養基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養基（如血清）。 血清中含有： 多種蛋白質（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） 多種金屬離子； 激素； 促貼附物質，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。 各種生長因子 轉移蛋白 不明成分 無血清培養基的主要研制策略：在基礎培養基中補充各種必需因子，如激素、生長因子 、結合蛋白 、貼壁和擴展因子 等。 無血清培養基由基礎培養基和替代血清的補充成分組成。 無血清細胞培養基的使用保證了實驗結果的準確性、可重復性和穩定性，減少了細胞污染，簡化了提純和鑒定各種細胞產物的程序。 低溫保護劑的應用 在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。 常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。 凍存和復蘇的原則：慢凍快融 當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反結晶就大，大結晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。 原代培養 取自體內新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養。 傳代培養 細胞在培養器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養器皿中。 功能特點 分泌功能 礦化功能 收縮功能 附著能力 再生能力 增殖分化影響因素 生長因子 胰島素 纖維粘連蛋白 抗壞血酸 羥基磷灰石 二、唾液腺細胞 細胞形態特點 腺泡上皮細胞 導管上皮細胞 肌上皮細胞 免疫組織化學染色 腺泡上皮細胞：角蛋白、淀粉酶、對氨基水楊酸、導管上皮膜、 前角蛋白、單克隆角蛋白、分泌成分陽性反應 導管上皮細胞：角蛋白、上皮膜蛋白、磷酸酐酶抗體染色陽性反應 肌上皮細胞： 肌動蛋白、S100蛋白、肌凝蛋白抗體染色陽性反應 功能特點 分泌功能 腺泡細胞：淀粉酶、PRP、唾液過氧化物酶、特異蛋白等 腺泡上皮細胞：頂端分泌、基底及側膜分泌 導管細胞：膠原 肌上皮細胞：膠原 唾液腺細胞的增殖分化 基底潛能干細胞理論 單細胞全能干細胞理論 雙細胞亞全能干細胞理論 增殖分化功能影響因素 細胞因子 激素 細胞外基質 鈣離子 三、口腔粘膜細胞 培養方法 組織塊法 酶消化法 細胞形態特點 免疫組織化學染色 波形絲蛋白表達陰性 多種角蛋白表達陽性 功能 分泌：膠原蛋白和非膠原蛋白 金屬蛋白酶 四、頜骨相關的硬組織細胞 分散組織 機械分離法 消化分離法 培養細胞的純化 人工純化（酶消化法，機械刮除法，反復 貼壁法，克隆法等） 自然純化 細胞的凍存與復蘇 所謂冷凍保存，就是將體外培養物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度，并在此溫度下對其長期保存的過程。而復蘇就是以一定的復溫速率將凍存的體外培養物或生物活性材料恢復到常溫的過程。不論是微生物、動物細胞、植物細胞還是體外培養的器官都可以進行凍存，并在適當條件下復蘇。 常規細胞培養法 細胞培養的污染、檢測與控制 微生物污染 空氣、器材、操作、試劑、組織標本 微生物污染的檢測 細菌和真菌的污染和檢測 肉眼直接觀察法 培養檢查法 顯微鏡觀察法 支原體的污染和檢測 造成支原體高污染率的原因： 0.8 um，無細胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45 um）； 2.支原體污染時，沒有明顯的肉眼或一般光學顯微鏡可觀察到的特征變化 ；3.過去缺乏簡單、快速且可靠的檢測方式； 4.細胞流通間缺乏物品管理，造成實驗室間的相互污染； 5.研究或操作人員忽略污染問題； 6.已受污染的細胞； 7.已受污染的培養基、血清。 支原體之檢測： 相差顯微鏡觀察法、電鏡法 Hayflick培養基直接培養法 DNA熒光染色法 PCR方法 微生物污染的控制 抗生素除菌法 加溫處理 化學污染 細胞交叉污染 第二節 口腔醫學中相關細胞培養及其特點 一、 牙齒相關細胞 牙髓細胞 培養中的細胞成分： 成纖維細胞 未分化的間充質細胞 培養方法 取材 浸泡 修剪 鋪瓶 培養 細胞形態特點 免疫組織化學染色 波形絲蛋白表達陽性 角蛋白、神經絲蛋白、結蛋白、膠質細胞 原纖維酸性蛋白表達陰性 生長增殖特點 成功率 快速增殖期 死亡 功能特點 堿性磷酸酶活性 礦化現象 對鈣調節因子的作用 對細胞因子的反應 對氫氧化鈣、羥基磷灰石蓋髓劑的反應 牙周膜細胞 培養方法 取材 浸泡 修剪 鋪瓶 培養 培養中的細胞成分： 成纖維細胞 未分化的間充質細胞 細胞形態特點 免疫組織化學染色 波形絲蛋白表達陽性 角蛋白、神經絲蛋白、結蛋白、膠質細胞 原纖維酸性蛋白表達陰性 生長增殖特點 成功率 快速增殖期 死亡 指數增生期：這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂指數表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數。一般細胞的分裂指數介于0.1%0.5%，初代細胞分裂指數低，連續細胞和腫瘤細胞分裂指數可高達3%5%。 特點： 是細胞增生最活躍、活力最旺盛的階段 培養物中細胞數量呈指數增長,細胞群體均一 是理想的實驗用細胞 在接種細胞數量適宜情況下，指數增生期持續35天后，隨細胞數量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現象稱接觸抑制。 細胞接觸匯合成片后，雖發生接觸抑制，只要營養充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養液中營養成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養的枯竭和代謝物的影響，則發生密度抑制，導致細胞分裂停止。 停滯期：細胞數量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數量不再增加，故也稱平臺期。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養液中營養漸趨耗盡，代謝產物積累、pH降低。此時需做分離培養即傳代，否則細胞會中毒，發生形態改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應越早越好。 培養細胞的體外生長環境 無污染環境 超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環境。 基 質 玻璃基質 塑料 飼養細胞 生物性基質處理培養表面 金屬 氣體環境和氫離子濃度 Hepers 緩沖液 CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- CO2: 5% 液相環境 溫度 滲透壓 二、 細胞培養的基本方法 無菌操作技術 體外培養細胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養成功或失敗的首要條件。即便使用設備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術操作不規范,也會導致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。 培養前準備 在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關數據的計算要事先做好。根據實驗要求，準備各種所需器材和物品放置操作場所(培養室、超凈臺)內消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。 培養室的消毒 無菌培養室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內同時紫外線消毒。 洗手和著裝 原則上和外科手術相同。并于開始操作前要用75酒精消毒手和前臂。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養室都要重新用消毒液洗手。進入原代培養室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。 培養過程中的無菌操作 在無菌環境進行培養或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經過